KARAKTERISASI DAN PEMURNIAN XILANASE DARI BAKTERI RAYAP Reticulitermes santonesis

Gde SutawijayaPembimbing: Zeily Nurachman, D.Sc

Institut Teknologi Bandung

Seminar Tugas Akhir26 Mei 2010

Agenda Presentasi

• Pendahuluan• Tinjauan Pustaka• Metodologi• Hasil• Kesimpulan

Pendahuluan

• Adanya kemampuan hemiselulotik dari rayap• Kebutuhan akan adanya agen bleaching kertas

yang ramah lingkungan• Kebutuhan energi yang meningkat

Tujuan

• Mengekstraksi xilan dari tongkol jagung• Memproduksi enzim xilanase menggunakan

substrat xylan tongkol jagung• Memurnikan enzim xilanase menggunakan

FPLC dengan kolom DEAE

Tinjauan Pustaka

Xilanase (EC 3.2.1.8)

Xilanase menghidrolisis ikatan (1->4)-beta-D-xylosidic pada xilanXilanase menghasilkan xiloligosakarida dan xilosa

Tinjauan Pustaka

Tinjauan Pustaka

Kandungan tongkol jagung : selulosa 44,9%, hemiselulosa (31,8%), dan lignin 23,3%, dan komponen lainnya (Titi Sunarti (IPB) dan Nur Richana (BB Pasca Panen Pertanian)).

Tongkol jagung

Metodologi

• Persiapan tongkol jagung• Ekstraksi xilan dari tongkol jagung• Produksi xilanase• Pemurnian xilanase• Karakterisasi xilanase

MetodologiTongkol jagung

Kering

Tongkol jagung yang telah dipotong

Tongkol Jagung halus

Dipotong kecil-kecil

Digiling

1. Persiapan tongkol jagung

Metodologi

Delignifikasi dengan NaOCl 1% (10:1), 5 jam,

suhu kamar

Ekstraksi xilan menggunakan NaOH

Padatan diambil, dan dikeringkan

Supernatan diambil dengan cara sentrifugasi

filtrasi

Pengasaman dengan HCl

2.Ekstraksi xilan dari tongkol jagung

Metodologi

Xilan dikeringkan

dihaluskan

Xilan

Metodologi3.Produksi xilanasePembuatan media padat dan cair

• 1.Komposisi media padat• K2HPO4 1,5%• MgSO4.7H2O 0,025%• NaCl 0,25%• NH4Cl 0,5 %• NH4PO4 0,5 %• Yeast 0,2%• Xilan 0.5%• Bacto agar 2% • 2. Media cair untuk produksi enzim • Komposisi • K2HPO4 1,5%• MgSO4.7H2O 0,025% • NaCl 0,25% • NH4Cl 0,5%• NH4PO4 0,5 %• Yeast 0,2% • Xilan 0,5%

Metodologi

• Penanaman bakteri/pembuatan koloni tunggal

Metodologi

20 mL kultur starter dishaker selama 12 -15 jam pada 150 rpm, 37°C, setelah itu dimasukan ke dalam media produksi enzim 200 mL (dalam erlenmeyer 1L). Media produksi di-shaker dalam 20 jam pada

150 rpm, 37°C. Enzim yang dipanen disentrifuga pada 5000 rpm untuk menghilangkan debris sel

Produksi xilanase

Fraksinasi Enzim dengan (NH4)2SO4

Enzim hasil dialisis

Padatan Supernatan

Crude Enzim Xylanase 1L

*Diresuspensi dengan buffer tris-HCl pH 8.0 20 mM* Didialisis

+106g(NH4)2SO4 (Fraksi 0-20)*Disentrifugasi pada 11000 rpm, 30 menit

Tujuannya untuk mengendapkan protein dengan prinsip salting out

Dialisis

Dialisis bertujuan untuk membersihkan amonium sulfat dari protein, prinsipnya dengan perbedaan konsentrasi, dimana konsentrasi garam di dalam membran lebih besar daripada di luar membran

FPLC

Fast Performance Liquid Chromatography Merupakan pemisahan dengan memanfaatkan

perbedaan migrasi suatu dari senyawa pada fasa diam dan fasa gerak. Digunakan kolom penukar anion DEAE-Sepharosa yang bekerja berdasarkan perbedaan muatan dalam protein

Uji Aktivitas Xilanase Dari Bakteri Rayap

Pembuatan DNS0,05 gr DNS ditimbang dan dilarutkan dalam 25 ml NaOH 2 M, ditambahkan Na-K

tartarat 15 gram, diencerkan dengan aqua dm hingga 50 ml, dan disimpan dalam suhu 4⁰C.

Pembuatan Enzim Sampelenzim 50 µL dan substrat 450 µL diinkubasi pada 60oC selama 5 menit. Kemudian

ditambah dengan DNS 500 µL dan diinkubasi di dalam air mendidih 5 menit Pembuatan Enzim Kontrolsubstrat 450 µL dan diinkubasi pada 60oC selama 5 menit kemudian dicampurkan

dengan DNS 500 µL dan ienzim 50 µL, dan diinkubasi di dalam air mendidih 5 menit

Hasil

• Kromatogram dari FPLC• Aktivitas enzim• Kadar protein

Puncak-puncak kromatogram menunjukan adanya aktivitas enzim

Uji Aktivitas dengan metoda gula pereduksi (reagen DNS)

Sampel A1 A1 A3 Median Faktor

Pengenceran Akktivitas

(U)

fraksi 24 0.02 0.014 0.018 0.017 51.89 6.77 kali 1.381 9.349

fraksi 23 0.008 0.012 0.009 0.01 50.61 6.77 kali 1.347 9.119

fraksi 11 0.164 0.179 0.172 0.172 77.61 6.77 kali 2.065 13.98

Fraksi 7 0.621 0.646 0.626 0.631 154.2 6.77 kali 4.103 27.78

Crude 0.71 0.68 0.69 0.693 164.66.77 kali 4.379 29.65

Dialisis 1 0.624 0.61 0.01 0.415 118.1100 kali 3.143 314.3

Terjadi peningkatan aktivitas setelah fraksinasi 0-20% sebesar 10,8 kali

Penentuan kadar protein

0 5 10 15 20 250

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

f(x) = 0.0156190476190476 x + 0.00158730158730153R² = 0.998688021387727

Kurva standar bradford

Series1Linear (Series1)

Konsentrasi proten (µg/ml)

Absorban

Penentuan kadar protein

Konsentrasi protein A1 A2 A3 A

4 0.072 0.07 0.078 0.071

8 0.121 0.119 0.12 0.12

12 0.189 0.191 0.188 0.189

16 0.238 0.25 0.268 0.252

20 0.328 0.311 0.305 0.315

Ekstrak kasar = 1.00 = 66 µg/mLFraksi 6 = 0.113 = 7,2 µg/mLFraksi 7 = 0.14 = 9 µg/mL

Pembahasan

Puncak-puncak pada kromatogram menunjukan adanya aktivitas enzim, namun untuk memastika nenzim tersebut adalah xilanase, perlu diuji dengan metoda DNS. Sebelumnya juga telah diuji aktivitas xilanase terhadap tongkol jagung, dan ternyata xilanase ini tidak dapat menguraikan tongkol jagung mentah

Kesimpulan

• Aktivitas xilanase dari bakteri rayap tergolong besar

• Dari data bisa dilihat bahwa terjadi peningkatan aktivitas dengan fraksinasi amonium sulfat.

Ucapan Terimakasih

• Pak Zelly, teh Inda, bu Iis, pak Yayat, kak Edo untuk bimbingan dan motivasinya

• Teman-teman 2006 sebimbingan, Tita, Ricky, Asro

• Teman-teman kimia untuk bantuan dan semangatnya

• Peserta seminar ini

Diskusi

Knowledge only gained through coriousity