KARAKTERISASI DAN IDENTIFIKASI ISOLAT DARI FLAVON, FLAVONOL, FLAVAN, FLAVANOL, FLAVANONOL

Sebagian besar senyawa flavonoid alam ditemukan dalam bentuk glikosida, yang artinya unit flavonoid

terikat pada suatu unit gula. Glikosida adalah kombinasi antara suatu gula dan suatu alkohol yang saling

berikatan melalui ikatan glikosida. Pada prinsipnya, ikatan glikosida terbentuk apabila gugus hidroksil dari

alkohol beradisi kepada gugus karbonil dari gula.

Adanya hidrolisa oleh asam, suatu glikosida terurai kembali menjadi komponen-komponen awalnya, yakni

terbentuknya gula dan alkohol yang sebanding. Dan alkohol yang terbentuk, disebut aglikon. Residu gula

pada glikosida flavonoid alam adalah glukosa, ramnosa, galaktosa, dan gentiobiosa sehingga glikosida

tersebut masing-masing disebut glukosida, ramnosida, galaktosida, dan gentiobiosida.

Flavonoid dapat ditemukan sebagai mono-,di-, atau triglikosida dimana satu, dua, atau tiga gugus hidroksil

dalam molekul flavonoid terikat oleh gula. Poliglikosida larut dalam air dan sedikit larut dalam pelarut

organik seperti eter, benzen, kloroform dan aseton.

1. 1.   Reaksi Warna

Pada analisis klasik, banyak macam reaksi warna dan sifat kelarutan yang dipakai untuk mengidentifikasi

berbagai golongan pigmen flavonoid.

o Jika tidak ada pigmen yang mengganggu, pada jaringan tumbuhan, (misalnya: daun bunga putih)

dapat diidentifikasi adanya flavon dan flavonol dengan pemberian uap ammonia.

o Jika ekstrak pigmen dalam air dibasakan, akan terlihat berbagai perubahan warna. Meskipun,

perubahan pada pigmen yang satu dapat menutupi perubahan pigmen lain:

? flavon, flavonol                                                                                   kuning

? flavanonol                                                                                                   coklat-jingga

o Reduksi menggunakan Magnesium dan Asam Klorida pekat dapat mengidentifikasi adanya golongan

flavonol dan flavanonol. Reaksi positif ditunjukkan dengan timbulnya warna merah. Terkadang flavon

menunjukkan reaksi positif, hanya saja intensitas warna merah yang dihasilkan, intensitasnya lebih

rendah dari flavonol.

o Reaksi dengan besi (III) klorida dapat digunakan untuk mengidentifikasi senyawa fenol. Hanya saja

belum spesifik membedakan tiap golongan. Adanya warna hitam-biru menunjukkan reaksi positif

terhadap galokatekin (flavanol).

o Penambahan air brom dapat digunakan untuk mengidentifikasi katekin (flavanol). Reaksi positif dapat

ditunjukkan dengan tidak terbentuknya endapan. Untuk memperkuat analisa, biasanya dibandingkan

dengan identifikasi adanya tannin, pada tannin, penambahan air brom dapat menghasilkan endapan.

o Pendidihan simplisia dengan HCL 2 M dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya katekin

(flavanol). Reaksi positif ditunjukkan dengan timbulnya warna coklat kuning. Melalui cara ini, adanya

flavanonol dapat diidentifikasi dengan melakukan reaksi lanjutan. Setelah didihkan dengan asam,

simplisia diekstraksi dengan eter.

Senyawa PereaksiUap FeCl3 Mg+HCl Didihkan Penambahan

amonia pekatdengan HCl 2M

Air Brom

Flavon Kuning -Merah (<flavonol)

- -

Flavonol Kuning - Merah - -

FlavanonolCoklat jingga

- Merah - -

Galokatekin (flavanol)

- Hitam biru - - -

Katekin (Flavanol)

- - - Coklat Kuning ? endapan

 1. 2. KLT

Metode ini merupakan cara kromatografi yang paling umum dan berguna untuk mengidentifikasi adanya golongan flavonoid. Pada metode ini, pengidentifikasian dilakukan dengan melakukan pengamatan bercak pada totolan setelah dilakukan eluasi menggunakan pelarut tertentu.Bercak glikosida flavon dan glikosida flavonoid yang khas, akan tampak berwarna ijas (lembayung tua) dengan sinar UV dan menjadi kuning bila diuapi NH3. Akan tetapi, sering juga terjadi timbulnya warna-warna lain yang terlihat. Tabel berikut ini, akan menjelaskan terperinci mengenai rentang warna bercak dan jenis flavonoid yang mungkin terdapat.  Warna Bercak dengan Sinar UV

Jenis Flavonoid yang Mungkin TerdapatSinar UV tanpa NH3

Sinar UV dengan NH3

Lembayung Gelap

Kuning, Hijau-Kuning, atau Hijau

Biasanya 5-OH flavon atau flavonol (tersulih pada 3-O dan mempunyai 4’-OH)

Perubahan warna sedikit atau tanpa perubahan warna

a.  Biasanya flavon atau flavonol tersulih pada 3-O mempunyai 5-OH tetapi tanpa 4’-OH bebas.b.  Beberapa 6- atau 8-OH flavon dan flavonoltersulih pada 3-O serta mengandung 5-OH

Fluoresensi Biru Muda

Fluoresensi Hijau-Kuning atau Hijau-Biru

1. Flavon tanpa 5-OH2. Flavonol tanpa 5-OH bebas

Kuning Redup, Kuning, atau Fluoresensi Jingga

Perubahan warna sedikit atau tanpa perubahan

Flavonol yang mengandung 3-OH bebas dan mempunyai atau tak mempunyai 5-OH bebas.

Adapula analisis lain dari Geissman mengenai penampang bercak, yakni sebagai berikut: Bercak yang pertama kali terlihat (antosianin, kalkon, auron).

Di bawah sinar UV dengan panjang gelombang 365nm beberapa senyawa berfluoresensi (flavonol,kalkon) dan senyawa lain menyerap sinar dan tampak sebagai bercak gelap dengan latar belakang berfluoresensi (glikosida flavonol, antosianin, flavon)

Dengan uap ammonia, sambil diperiksa dibawah sinar UV, glikosida flavon dan flavonolberfluoresensi kuning, flavanon terlihat kuning pucat, katekin (flavanol) biru pucat.

Diperiksa kembali dibawah cahaya biasa sambil diuapi ammonia, flavon terlihat kuning, antosianin kelabu biru, kalkon, dan auron merah jingga.

Besarnya kombinasi fase diam dan fase gerak yang dipakai juga berpengaruh terhadap jalannya proses pengidentifikasian. Umumnya, pengembang paling populer untuk KLT adalah butanol:asam asetat:air (4:1:5). Untuk fase diam umumnya menggunakan selulosa, campuran selulosa dan povinilpirolidon, magnesium silikat, dan silica gel yang kandung timbale asetat.  Akan tetapi, terdapat juga beberapa kombinasi fase diam dan fase gerak yang dianjurkan untuk jenis flavonoid tertentu: 

1. Glikosida Flavonoid: Selulose : TBA, BBA, HOAc 5-40%H2OPoliamida : H2O : MeOH : MEK : asetil aseton (13:3:3:1)Silika : EtO Ac : Pir : H2O : MeOH (80:20:10:5) 

1. Aglikon Flavonoid Polar (missal:   flavon, flavonol ): Selulose : TBA, HOAc 50%, KAA, benzene : HOAc : H2O (125:72:5)Poliamida : HOAc : MeOH : H2O (1:18:1)Silika : benzena : Pir : HCO2H (36:9:5) 

1. Aglikon Flavonoid Non Polar (dihidroflavonoid, isoflavon, dan   flavon   termetilasi) Selulose : HOAc 10-30%Silika : CHCl3 : MeOH (15:1 sampai 3:1) Dengan pemberian pereaksi semprot dapat meningkatkan kepekaan dalam mendeteksi bercak flavonoid. Ada beberapa pereaksi semprot yang dapat digunakan:

1. Larutan AlCl3 5% (digunakn dengan melihat di sinar UV) menunjukkan adanya 5-hidroksi-flavonoid (bercak berfluoresensi kuning)

2. Larutan difenil-asam borat-etanolamin (Naturstoffreagenz A)1% dalam MeOH menunjukkan adanya 3’,4’-dihidroksi-flavon dan 3’,4’-dihidroksi-flavonol (bercak jingga dilihat pada sinar UV, 4’-hidroksi flavon dan 4’-hidroksi-flavonol (bercak hijau kuning).

1. Asam sulfanilat yang terdiazotasi (Larutan asam sulfanilat 0,3% dalam HCL 8% dicampur larutan natrium nitrit 5% disemprot pada pelat, dan sebelum dikeringkan ditambah natrium karbonat 20%. Campuran reaksi ini menunjukkan gugus hidroksi fenol (bercak kuning, jingga, merah).

2. Vanilin-HCL (Larutan Vanilin 5% dalam EtOH dicampur HCl pekat) menunjukkan adanyakatekin (flavanol) (bercak merah ayau merah lembayung).

3. Rodamina B 4% dalam HCl 0,1 M menunjukkan adanya flavanonol (bercak lembayung), flavon dan flavonol tidak bereaksi.

4. Asam p-toluenasulfonat menunjukkan adanya katekin (flavanol) dengan bercak coklat. 

1. 1. Spektra dalam Pelarut Metanol dengan spektrofotometer UV-VisSpektroskopi serapan UV-Vis merupakan cara tunggal yang paling baik untuk menganalisis struktur flavonoid. Cara tersebut digunakan untuk mengidentifikasi jenis flavonoid dan menentukan pola oksigenasi. Keuntungan utama cara ini adalah sangat sedikitnya jumlah flavonoid yang diperlukan untuk analisis lengkap (sekitar 0,1 mg).Spektrum flavonoid biasanya ditentukan dalam pelarut metanol atau etanol. Akan tetapi, spektrum yang dihasilkan dalam etanol kurang memuaskan. Spektrum khas terdiri atas dua maksima pada rentang 240-285nm (pita II) dan 300-550 nm (pita I). Kedudukan yang tepat dan kekuatan nisbi maksma tersebut memberikan informasi yang berharga mengenai sifat flavonoid dan pola oksigenasinya. Petunjuk mengenai rentang maksima utama yang diperkirakan untuk setiap jenis flavonoid disajikan pada table di bawah ini:  PITA II (nm) PITA I (nm) JENIS FLAVONOID250-280 310-350 Flavon

250-280 330-360Flavonol(3-OH tersubtitusi)

250-280 350-385Flavonol(3-OH bebas)

245-275310-330 bahu,kira-kira 320 puncak

Isoflavon, Isoflavon(5-deoksi-6,7-diosigenasi)

275-295 300-330 bahu Flavanon dan dihidroflavonol230-270(kekuatan rendah)

340-390 Khalkon

230-270(kekuatan rendah)

380-430 Auron

270-280 465-560 Antosianidin dan antosianin 

1. 2. Pereaksi GeserPenambahan pereaksi (pereaksi geser) dapat digunakan untuk menentukan kedudukan gugus hidroksi fenol bebas pada inti flavonoid, kemudian mengamati pergeseran puncak serapan yang terjadi. Dengan demikian, secara tidak langsung cara ini berguna untuk menentukan kedudukan gula atau  metil yang terikat pada salah satu gugus hidroksi fenol.Macam-Macam Pereaksi Geser dan Kegunaan:

1. AlCl3 : membantu untuk mengetahui letak gugus OH di C3 atau C5 pada    ring A,C3/C5 pada C3’ dan C4’atau C4’ dan C5’ pada ring B.

Mekanisme: Al akan begabung dengan gugus -OH dan O karbonil sehingga penambahannya harus pada flavonoid yang mempunyai gugus karbonil pada no.4 cincin C

1. NaOMe (Na metoksida) : untuk mengetahui gugus -OH pada C3’ dan C4’.2. NaO Ac (Na asetat) : untuk meramalkan gugus -OH pada C5, C6, C7’, C5’, C7, C8’, C3, C3’

dan C4’ Pembuatan Pereaksi Geser:

1. Membuat lar. flavonoid persediaan : ± 0,1 mg cuplikan + 10 ml MetOH p.a. ? encerkan ad daya serap puncak utama   ± 0,6

2. Membuat pereaksi geser : NaOMe : kira-kira 2,5 g logam Na (lebih baik ditangani dan ditimbang dalam keadaan

terendam dalam eter minyak bumi atau heksana didalam gelas piala) dipotong kecil-kecil dan ditambahkan ke dalam 100 ml MetOH dengan hati-hati. Larutan yang diperoleh harus disimpan di dalam botol kaca yang bertutup plastik. Pereaksi pengganti NaOMe yang cocok ialah NaOH 2M dalam air.

NaOAc : serbuk NaOAc anhidrat. Pelumeran NaOAc untuk menghilangkan HOAc sisa AlCl3 : kira-kira 5 g AlCl3 segar dan kering (bila dimasukkan air harus berdesis) ditambahkan

dengan hati-hati ke dalam 100 ml MetOH, bahan yang tersisa biasanya akan larut juga setelah beberapa waktu kemudian. Simpanlah dalam botol plastik bertutup.

HCl : 50 ml HCl pekat bertingkat ditambahkan ke dalam 100 ml aquadest H3BO3 : digunakan serbuk H3BO3 anhidrat.Tahapan kerja dengan pereaksi geser:

1. Ukur spektrum cuplikan dalam MetOH; tambahkan 3 tetes NaOMe ad homogen ? rekam spektrum untuk memeriksa apakah ada penguraian, rekam lagi setelah ± 5’, cuci kuvet dan isi dengan larutan flavonoid persediaan

2. Larutan flavonoid ditambah 6 tetes larutan AlCl3 ? rekam spektrum, + 3 tts HCl ad homogen ? rekam spektrum, cuci kuvet dan isi dengan larutan flavonoid

3. Larutan flavonoid ditambah serbuk NaOAc ? ± 2 mm lapisan NaOAc pd dasar kuvet ? kocok homogen & rekam spektrum. Periksa apakah ada penguraian. Tambahkan H3BO3 (½ x NaOAc) ? kocok homogen dan rekam spektrum.

Penafsiran Spektrum? NaOMe

Jenis FlavonoidPergeseran yang Tampak Petunjuk

PenafsiranPita I Pita IIFlavon, Flavonol

Kekuatan  menurun terus (artinya penguraian)

 

3,4’-OH, o-diOH pada cincin A, cincin B: 3 OH yang berdampingan

Mantap +45 sampai 65 nm, kekuatan tidak menurun

  4’-OH

Mantap +45 sampai 65 nm,

  3-OH, tidak ada 4’-OH bebas

kekuatan menurun

 

Pita baru (bandingkan dengan MeOH), 320-335 nm

7-OH

 ? NaOAc

Jenis FlavonoidPergeseran yang Tampak Petunjuk

PenafsiranPita I Pita II

Flavon, Flavonol

 

+5 sampai 20 nm (berkurang bila ada oksigenasi pada 6 atau 8)

7-OH

Kekuatan berkurang dengan bertambahnya waktu

 

Gugus yang peka terhadap basa, misalnya pada 6, 7 atau 7, 8 atau 3, 4’- diOH

? NaOAc/H3BO3

Jenis FlavonoidPergeseran yang Tampak Petunjuk

PenafsiranPita I Pita II

Flavon, Flavonol

+12 sampai 36 nm (nisbi terhadap spectrum MeOH)

 o-diOH pada cincin B

Pergeseran lebih kecil

 o-diOH pada cincin A (6, 7 atau 7, 8)

? AlCl3 dan AlCl3/HCl

Jenis FlavonoidPergeseran yang Tampak Petunjuk

PenafsiranPita I Pita II

Flavon, Flavonol (AlCl3/HCl)

+ 35 sampai 55 nm   5-OH

+ 17 sampai 20 nm  5-OH dengan oksigenasi pada 6

Tidak berubah  Mungkin 5-OH dengan gugus prenil pada 6

Flavon, Flavonol (AlCl3) + 50 sampai 60 nm  

Mungkin 3-OH (dengan atau  tanpa 5-OH)

Pergeseran AlCl3/HCl + 30 sampai 40 nm

 o-diOH pada cincin B

Pergeseran AlCl3/HCl   o-diOH pada cincin

+ 20 sampai 25 nmA (tambahan pada pergeseran o-diOH padacincin B)

 DAFTAR PUSTAKA

1. Harborne, J.B. dan Williams, C.A. 1995. Anthocyanins and other flavonoids. Natural Product Report,

Plant Science Laboratories, University of Reading, Reading, UK, RG6 6AS [serial online]

1995,December; 17-18:[22 screens]. Available from:

URL: http://www.rsc.org/ej/NP/1998/a815631y.pdf. Accessed April 1,2010.

 

1. Dokkedal , Anne Lígia, dkk. 2007. Xeractinol – A New Flavanonol C-glucoside from Paepalanthus

argenteus var. argenteus (Bongard) Hensold (Eriocaulaceae). J. Braz. Chem. Soc., Vol. 18, No. 2, 437-

439, 2007. Printed in Brazil – ©2007 [serial online] March 16, 2007; 1-3:[3 screens]. Available from:

URL: http://jbcs.sbq.org.br .Accessed April 1,2010.

 

1. Anonim A. 2010. Flavanonol. Available from: URL: http://en.wikipedia.org/wiki/Flavanonol. Accessed

April 1,2010.

 

1. Anonim B. 2010. Taxifolin. Available from: URL: http://en.wikipedia.org/wiki/Taxifolin.

Accessed April 1,2010.

 

1. Anonim C. 2009. Aromadedrin. Available from: URL:http://en.wikipedia.org/wiki/Aromadedrin. 

Accessed April 1,2010.

 

7.   Markham . K.R. 1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoid.Terjemahan.Kosasih padmawinata, ITB Bandung

 

8.   Robinson. T. 1963, THE ORGANIC CONSTITUENTS OF HIGHER PLANTS, Their Chemistry and

Interrelationships. BURGESS PUBUSHING COMPANY, Minneapolis

 

9.    http://en.wikipedia.org/wiki/Flavonoid

 

10.  http://en.wikipedia.org/wiki/Flavone

 

11.  http://en.wikipedia.org/wiki/Flavonols

 

12.  http://en.wikipedia.org/wiki/Flavanonols

 

13.  http://en.wikipedia.org/wiki/Flavan

 

14.  http://en.wikipedia.org/wiki/Flavanol