PRODUKSI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE ISOLAT …digilib.unila.ac.id/32625/3/SKRIPSI TANPA BAB...

PRODUKSI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE ISOLATBacillus sp.UJ-132 SEBAGAI KANDIDAT PROBIOTIK DARI HUTAN

MANGROVE DESA MARGASARI LAMPUNG TIMUR

(Skripsi)

Oleh

MILSA SOLVA DIANA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG2018

ABSTRAK

Produksi dan Karakterisasi Enzim Protease Isolat Bacillus sp. UJ-132sebagai Kandidat Probiotik dari Hutan Mangrove Desa Margasari Lampung

Timur

Oleh

Milsa Solva Diana

Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui produksi dan karakterisasi enzimprotease dari isolat Bacillus sp. UJ132 yang diisolasi dari kawasan hutanmangrove Desa Marga Sari Lampung Timur. Uji aktivitas enzim dilakukansecara kualitatif dan kuantitatif. Tujuan penelitian ini adalah menentukan produksioptimum enzim dan mengamati karakterisasi enzim meliputi penentuan suhu danpH optimum, pengaruh beberapa ion logam serta penentuan Km dan Vmaks. Darihasil percobaan diketahui bahwa enzim protease dihasilkan pada waktu produksioptimum 18 jam yang menghasilkan aktivitas protease sebanyak 0,09 U/ml. Suhuoptimum enzim ini yaitu pada suhu 50 oC yang menghasilkan aktivitas sebesar0,08 U/ml. Enzim protease ini mempuyai kondisi optimum pada pH 5 dengannilai aktivitas 0,09 U/ml. Semua ion logam (Ca2+, Mn2+, Cu2+, Mg2+) berfungsisebagai inhibitor kecuali ion Fe2+ yang berfungsi sebagai aktivator padakonsentrasi 1 µM dan 5 µM. EDTA dengan konsentrasi 1 µM dan 5 µMberfungsi sebagai inhibitor pada enzim protease isolat UJ132. Nilai Vmaks enzimprotease 0,33 U/ml sedangkan Km senilai 4,59 mg/ml substrat, enzim inimempunyai afinitas yang tinggi terhadap substrat.

Kata Kunci: Bacillus sp; Bakteri Proteolitik; Hutan Mangrove; Probiotik;Protease.

PRODUKSI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE ISOLAT

Bacillus sp.UJ-132 SEBAGAI KANDIDAT PROBIOTIK DARI HUTAN

MANGROVE DESA MARGASARI LAMPUNG TIMUR

Oleh

MILSA SOLVA DIANA

Skripsi

Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Mencapai Gelar

SARJANA SAINS

pada

Jurusan Biologi

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG

2018

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di OKU Timur, Sumatera Selatan

pada tanggal 26 Agustus 1996 sebagai anak pertama

dari empat bersaudara, dari pasangan bapak Muhtar dan

ibu Parisyam.

Penulis mulai menempuh pendidikan dini Taman

Kanak-kanak Raudhatul Athfal Nurul Huda, kemudian

melanjutkan pendidikan Sekolah Dasar Negeri 01 Sukaraja Luar dan

menyelesaikannya pada tahun 2008, selanjutnya penulis menempuh pendidikan

Sekolah Menengah Pertama hingga tahun 2011 di SMP Negeri 01 Buay Madang.

Kemudian penulis melanjutkan pendidikan di SMA Negeri 3 Martapura, Sumatera

Selatan dan menyelesaikannya tahun 2014. Pada tahun yang sama, penulis

diterima sebagai mahasiswi Jurusan Biologi FMIPA Universitas Lampung melalui

jalur Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SNMPTN).

Selama menempuh pendidikan di kampus Penulis pernah menjadi asisten

praktikum mata kuliah Mikrobiologi Umum dan Mikrobiologi Pangan dan

Industri. Selain itu penulis juga aktif di dunia organisasi kampus yaitu Himpunan

Mahasiswa Biologi (HIMBIO).

vi

Aktivitas organisasi penulis dimulai sejak menjadi Anggota Muda Biologi

(Amuba) tahun 2014–2015. Selanjutnya penulis aktif dalamHimpunan Mahasiswa

Biologi (Himbio) FMIPA Unila sebagai anggota biro Keskretariatan dan Logistik

(Kalog) tahun 2015 dan menjadi anggota divisi Komunikasi dan Informasi

(Kominfo) tahun 2016.

Penulis melaksanakan Kuliah Kerja Nyata (KKN) di desa Subing Karya,

Kabupaten Lampung Tengah dari bulan Januari-Februari 2017. Pada bulan Juli –

Agustus 2017, penulis melaksanakan Kerja Praktik di Lembaga Ilmu Pengetahuan

Indonesia (LIPI) Cibinong, Bogor dengan judul penelitian “Isolasi dan

Karakterisasi Bakteri Susu Sapi Perah yang Terinfeksi Mastitis”. Penulis

melaksanakan penelitian di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas

MIPA, Universitas Lampung pada bulan Januari 2018 hingga Maret 2018.

PERSEMBAHAN

حیم حمن الر بســــــــــــــــــم هللا الر

Segala puji bagi Allah SWT yang selalu menunjukkan jalan kebaikan dan melimpahkan

nikmat sehat, sehingga atas Ridho-Nya karya ini dapat terselesaikan dengan baik.

Kupersembahkan karya ini dengan setulus hati kepada:

Yang teristimewa orangtuaku tercinta,Ayahanda Muhtar dan Ibunda Parisyam yang selalu menyebut namaku dalam doa, serta yang

selalu memberikan segalanya untuk pendidikanku, yang menjadi sumber kekuatanku untuktetap bertahan dalam mewujudkan cita-cita.

Ketiga adikku dan segenap keluarga,Adik-adikku tersayang Rana Okta Viani, Chelsea Olivia dan Galang Ahmad Givaris yangselalu mendoakan,smemberikan canda tawa, motivasi tiada henti dan menjadi teman cerita

baik suka maupun duka.

Teruntuk yang kuhormati,Bapak Dr.Sumardi, M,Si., Bapak Ir. Salman Farisi, M.Si.

Dan Ibu Dra. C.N. Ekowati, M.Si.

Para Guru dan Dosen,Atas dedikasi yang telah mengajarkan ilmu pengetahuan dan nilai-nilai moral serta yang

membuat diri ini memahami sebagian akan kebesaran Allah SWT.

Sahabat-sahabat tersayang,

Yang telah memberikan pengalaman, nasihat-nasihat, canda dan tawa selama masa studi.

Serta,Almamater tercinta

Universitas Lampung

MOTTO

Allah akan meninggikan orang-orang yang beriman di antaramu dan orang-orangyang diberi ilmu pengetahuan beberapa derajat

(Q.s. al-Mujadalah : 11)

“Kita semua harus menerima kenyataan, tapi menerima kenyataan saja adalahpekerjaan manusia yang tak mampu lagi berkembang. Karena manusia juga bisa

membikin kenyataan-kenyataan baru. Kalau tak ada orang mau membikin kenyataan-kenyataan baru, maka “kemajuan” sebagai kata dan makna sepatutnya dihapuskan dari

kamus umat manusia.”(Pramoedya Ananta Toer, House of Glass)

“Orang kaya memiliki TV kecil dan perpustakaan besar, sementara orang miskinmemiliki perpustakaan kecil dan TV besar.” – Zig Ziglar

“sedangkan sebetulnya cara mendapatkan hasil itulah yang lebih penting daripadahasil sendiri”(Tan Malaka)

“Apa gunanya ilmu kalau tidak memperluas jiwa seseorang sehingga ia berlaku sepertisamudera yang menampung sampah-sampah?”

(Emha Ainun Nadjib)

Apa gunanya ilmu kalau hanya untuk mengibuli? Apa guna banyak baca buku, kalaumulut kau bungkam melulu?

(Wiji Thukul)

Jangan gunakan kefasihan berbicaramu (mendebat) dihadapan Ibumu yang dahulumengajarimu berbicara

(Ali bin Abi Thalib)

SANWACANA

Alhamdulillahirobbilalamiin,

Puji syukur kehadirat Allah SWT. yang telah melimpahkan rahmat dan hidayah-

Nya sehingga Penulis mampu menyelesaikan skripsi yang berjudul “Produksi

dan Karakterisasi Enzim Protease Isolat Bacillus sp.UJ-132 Sebagai

Kandidat Probiotik dari Hutan Mangrove Desa Margasari Lampung Timur”

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana sains di Universitas

Lampung. Penelitian ini merupakan bagian dari proyek penelitian Bapak

Dr. Sumardi, M.Si. tahun 2018.

Penulis mengucapkan terimakasih dengan tulus kepada semua pihak yang telah

memberikan bantuan, bimbingan, nasihat, semangat dan dukungan dalam proses

penyusunan skripsi ini maupun selama masa studi. Secara tulus, Penulis

mengucapkan terimakasih kepada:

1. Ibunda Parisyam dan Ayahanda Muhtar tercinta, yang selalu menjadi

kekuatan terbesar untuk melakukan yang terbaik dalam hidup. Terima kasih

atas segala doa yang terus dipanjatkan, support, dan kasih sayang yang tak

pernah putus.

x

2. Adikku tercinta (Rana Okta Viani, Chelsea Olivia dan Galang Ahmad

Givaris) terima kasih atas segala keriangan yang selalu kalian berikan.

Semoga kita selalu membuat ayah dan ibu tersenyum.

3. Bapak Dr. Sumardi, M.Si. selaku Dosen PembimbingUtama yang senantiasa

membimbing, memberikan ilmu, motivasi, saran dan kritik baik selama

perkuliahan maupun dalam proses penyelesaian skripsi ini.

4. Bapak Ir. Salman Farisi, M.Si. selaku Dosen Pembimbing Kedua yang

senantiasa membimbing, memberikan ilmu, memberikan waktu, motivasi dan

semangat selama proses penyusunan skripsi maupun selama masa

perkuliahan.

5. Ibu Dra. C.N. Ekowati, M.Si.selaku Dosen Penguji yang senantiasa

membimbing, memberikan ilmu, motivasi, kritik dan saran baik dalam proses

penyelesaian skripsi maupun selama masa perkuliahan.

6. Ibu Endang Linirin Widiastuti, Ph.D. selaku Pembimbing Akademik yang

telah memberikan arahan dan motivasi selama perkuliahan maupun dalam

penyusunan skripsi.

7. Bapak Prof. Dr. Ir. Hasriadi Mat Akin, M.P., selaku Rektor Universitas

Lampung.

8. Bapak Prof. Warsito, S.Si., D.E.A., Ph.D., selaku Dekan Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

9. Ibu Dr. Nuning Nurcahyani, M.Sc. selaku Ketua Jurusan Biologi, Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.

10. Seluruh dosen dan karyawan Jurusan Biologi atas semua bimbingan

pengajaran, pelayanan dan bantuan yang telah diberikan.

xi

11. Tim CKPTWB dan MIKROPEDIA (Suminta Frida Hairisah, Komang Rima,

Nandia Putri Aulia, Rismayanti, Rizka Oktavia, Agung Setia Ningsih, Benny

Hartanto, Rosmaida La. Sinurat, Diana Ismawati, Ketut Mahendri) terima

kasih atas kerjasama, kebersamaan, kesabaran, dan canda tawa yang

diberikan. Semoga kita dapat meraih kesuksesan dan kebahagiaan.

12. Sahabat terbaikku, Rumpies (Adelea Tasya Putri, Puput Dian Anggraini,

Rachma Aulia, Sesti Edina Merisca, Suminta Frida Hairisah dan Triana

Gusmaryana) yang telah menemani di waktu luang, senggang, susah, dan

senang.

13. UNO Group, Fanisha Restu Dikjayati, Lasmi Putri Kinasih, Nana Nurhasanah dan

Nurisfa’ni, yang selalu menyelaraskan pengetahuan dan keimanan serta senantiasa

mengajak untuk bermuhasabah diri.

14. Sahabat LDR ku, Ev dan Nyett nun jauh disana yang selalu mendengarkan

keluhan dan lawakan basi serta menjadi teman bernostalgia, terima kasih

untuk keabsurdan kalian.

15. Sobat Puware ku, yuk Riska Sri Haryanti, Fitri Satriawati, Lesi Mareta,

Liyana Mardova dan Nunik Indah Wayyah yang selalu menjadi kawan

melancong dikala pulkam di Sukaraja tercinta dan senantiasa menjadi kawan

dalam merancang masa depan yang masih kelabu.

16. Microholic 2013, kak Yovita Selvie Pasaribu yang selalu memberikan

pengarahan, motivasi dan senantiasa mendengarkan dan memberi solusi atas

segala kebingungan dan ketidakpahaman selama penelitian.

17. Teman-teman terdekatku (Annisa Gena Saras Agustia, Nurjulia Jashinda

Akas, Indria Ratna. Eka Ratna Susmala Dewi dan Pratami Dwi Rahmawati)

terima kasih untuk semangat, canda tawa dan kebersamaannya.

xii

18. Microholic 2014 terimakasih atas pengetahuan, kerjasama, dukungan, canda

dan tawa selama ini yang telah kalian berikan.

19. Teman-teman KKN desa Subing Karya, Bagus Prasojo, Eva Narulita Kurnia

Perdana, Ibnu Alwan, M. Ikhwan Alrasyid, Revilarita Arlanda dan Yula Fadilah,

terimakasih untuk kebersamaan yang telah dilalui selama 40 hari dan berkesan

hingga kini.

20. Teman-teman seperjuangan Biologi Angkatan 2014, terima kasih atas

semangat serta kekeluargaannya yang telah terjalin selama ini. Seluruh

kakak-kakak dan adik-adik tingkat Jurusan Biologi FMIPA Unila yang tidak

dapat disebutkan satu persatu atas kebersamaan, dukungan dan semangatnya.

21. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan namanya satu persatu yang telah

membantu, mempermudah serta mendoakan dalam penelitian hingga

penyelesaian skripsi ini.

22. Serta almamater tercinta, Universitas Lampung.

Akhir kata, penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan,

akan tetapi besar harapan semoga skripsi yang sederhana ini dapat berguna dan

bermanfaat bagi kita semua. Semoga Allah SWT senantiasa membalas semua

kebaikan yang telah diberikan kepada penulis.

Bandar Lampung, 3 Agustus 2018

Penulis,

Milsa Solva Diana

DAFTAR ISI

Halaman

ABSTRAK .......................................................................................... i

HALAMAN SAMPUL DALAM....................................................... ii

HALAMAN PERSETUJUAN .......................................................... iii

HALAMAN PENGESAHAN............................................................ iv

RIWAYAT HIDUP ............................................................................ v

PERSEMBAHAN............................................................................... vii

MOTTO .............................................................................................. viii

SANWACANA ................................................................................... ix

DAFTAR ISI....................................................................................... xiii

DAFTAR TABEL .............................................................................. xvi

DAFTAR GAMBAR.......................................................................... xvii

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang .......................................................................... 1B. Tujuan Penelitian....................................................................... 4C. Manfaat Penelitian..................................................................... 4D. Kerangka Pikiran....................................................................... 4E. Hipotesis .................................................................................... 5

xiv

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Enzim ....................................................................................... 61. Pengertian Enzim .............................................................. 62. Produksi Enzim ........ 73. Sifat Enzim......................................................................... 104. Mekanisme Kerja Enzim.................................................... 105. Jenis Enzim ........................................................................ 126. Faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim.................... 147. Kinetika Enzim................................................................... 178. Isolasi Enzim...................................................................... 18

B. Enzim Protease ........................................................................ 21C. Bacillus sp. .............................................................................. 23D. Bakteri Probiotik ...................................................................... 24E. Hutan Mangrove....................................................................... 27

III. METODOLOGI PENELITIAN

A. Tempat dan Waktu ................................................................... 30B. Alat dan Bahan ......................................................................... 30C. Metode Penelitian..................................................................... 31D. Analisis Data ........................................................................... 31E. Prosedur Kerja.......................................................................... 31

1. Peremajaan Isolat Bakteri .................................................... 31a. Uji Aktivitas Protease secara Kualitatif.......................... 32b. Uji Aktivitas Enzim Protease secara Kuantitatif ............ 32

1. Pembuatan Starter Isolat Bakteri Proteolitik.............. 322. Produksi Enzim Protease............................................ 333. Uji Aktivitas Enzim Protease .................................... 334. Karakterisasi Enzim Protease..................................... 35

a. Penentuan Suhu Optimum..................................... 35b. Penentuan Ph Optimum......................................... 35c. Pengujian Daya Hambat Inhibitor dan Berbagai

Ion Logam terhadap Aktivitas Enzim Protease ..... 35d. Penentuan Km dan Vmaks .................................... 36

IV.HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Uji Kualitatif ............................................................................ 38B. Produksi Enzim Protease.......................................................... 39

xv

C. Karakterisasi Enzim Protease1. Suhu Optimum..................................................................... 402. Ph Optimum......................................................................... 413. Pengaruh Ion Logam dan Inhibitor EDTA pada Aktivitas

Enzim Protease .................................................................... 434. Penentuan Km dan Vmaks .................................................. 44

V.KESIMPULAN DAN SARAN

A.Kesimpulan................................................................................. 47B. Saran .......................................................................................... 47

DAFTAR PUSTAKA………………………………………………. 48

LAMPIRAN………………………………………………………… 55

DAFTAR TABEL

HalamanTabel 1. Jenis-jenis Enzim ...................................................................................14

Tabel 2. Mekanisme Uji Kuantitatif Protease ......................................................34

Tabel 3. Ulangan 1 Optimasi Waktu Produksi.........................................................62



Tabel 6. Ulangan 1 Pengaruh Suhu................................................................................. 63



Tabel 9. Ulangan 1 Pengaruh Ph..................................................................................... 64

Tabel 10. Ulangan 2 Pengaruh pH.................................................................................. 64

Tabel 11. Ulangan 3 Pengaruh pH.................................................................................. 64

Tabel 12. Ulangan 1 (5 µm) Pengaruh Ion logam.......................................................... 65

Tabel 13. Uji Ion Logam (1 µm) ................................................................................. 65

Tabel 14. Data Pengaruh Substrat…………………………………………........65

Tabel 15. Nilai Kinetika Enzim………………………………………………...65

DAFTAR GAMBAR

HalamanGambar 1. Struktur Kuartener Protease ................................................................. 6

Gambar 2. Mekanisme Lock Key .........................................................................11

Gambar 3. Mekanisme Induce-fit.........................................................................12

Gambar 4. Pengaruh Suhu....................................................................................15

Gambar 5. Pengaruh pH.......................................................................................16

Gambar 6. Pengaruh Inhibitor..............................................................................17

Gambar 7. Struktur Sekunder beta-sheet dan alpha-helix Protein.......................23

Gambar 8. Bacillus sp. ........................................................................................24

Gambar 9. Ekosistem Hutan Magrove ................................................................27

Gambar 10. Isolat UJ-132 Menghasilkan Zona Bening........................................38

Gambar 11. Optimasi Waktu Produksi .................................................................39

Gambar 12. Pengaruh Suhu...................................................................................40

Gambar 13. Aktivitas Enzim Protease pada Beberapa Variasi pH .......................42

Gambar 14. Pengaruh Beberapa Ion Logam dan Inhibitor EDTA terhadapAktivitas Enzim Protease .................................................................43

Gambar 15. Kurva Lineweaver-Burk Enzim Protease..........................................45

Gambar 16. Uji Kuantitatif Enzim.................................................................................. 68

Gambar 17. Natan dan Supernatan Protease………………………………………….. 68

Gambar 18. Media Produksi Protease………………………………............................. 68

Gambar 19. Hasil Sentrifuge Uji ………………………………..…………………… 68

xviii

Gambar 20. Uji Enzim Protease………………………………………...……………….69

Gambar 21. Media Produksi Protease……………………………………...…….……...69

Gambar 22. Ekstrak Seluler…………………………….......………………………...…69

Gambar 23. Media Produksi yang Dishaker di Orbitasl Shaker…………………...... ..69

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Munculnya beberapa penyakit pada hasil perikanan laut seperti penyakit

vibriosis pada udang maupun ikan laut lainnya, memurunkan hasil produksi

perikanan. Tingginya tingkat mortalitas udang budidaya diduga disebabkan

oleh infeksi virus maupun bakteri patogen (Ali, 2009).

Badan Pusat Statistik (BPS) melaporkan bahwa produksi budidaya perairan

laut di provinsi Lampung pada tahun 2011 sebanyak 1.151 ton, tahun 2012

meningkat menjadi 1.193 ton, pada tahun 2013 meningkat kembali menjadi

2.978 ton, kemudian pada tahun 2014 menurun menjadi 2.816 ton, kemudian

terjadi peningkatan dua kali lipat pada tahun 2015 menjadi 4.105 ton. Produksi

pada tahun 2016 mengalami penurunan yang drastis hingga mencapai angka

1.159 ton saja. Hal ini menimbulkan kerugian ekonomi yang sangat

signifikan. Salah satu penyebab munculnya kerugian ini adalah terjadinya

infeksi mikrorgoranisme patogen pada produk perikanan. Laporan dari

berbagai wilayah di dunia menyatakan bahwa kerugian ekonomi akibat

mikroorganisme patogen ini di seluruh dunia mencapai US$ 3 miliar per tahun

(Subasinghe et al., 2001; Hill, 2005).

2

Berbagai upaya telah dilakukan untuk mengendalikan penyakit dan kualitas air,

salah satunya menggunakan probiotik. Probiotik didefinisikan sebagai

mikroba hidup yang ditambahkan dalam jumlah tertentu dan mampu bertahan

hidup dalam ekosistem saluran pencernaan. Mikroba probiotik memiliki peran

positif pada inang. Peran mikroba tersebut berpengaruh terhadap kesehatan

dan nutrisi inang (Gismondo et al.,1999).

Probiotik memiliki keunggulan dibandingkan cara-cara pengendalian yang

lainnya, di antaranya adalah : (1) menekan pertumbuhan bakteri pathogen

termasuk diantaranya bakteri vibrio dan (2) mampu memperbaiki kualitas air

(Moriarty,1998). Beberapa pegiat ilmiah telah melakukan penelitian untuk

mencari manfaat dari penggunaan probiotik diantaranya pemanfaatan probiotik

di sektor budiya perikanan (Fadilah et al.2012), bioremediasi kualitas air

(Muliani et al., 2008), efisiensi pada pakan (Murdianto, 2015). Penelitian

mengenai probiotik sebagian besar dimanfaatkan untuk pembenihan atau

efisiensi pakan baik dalam budidaaya perairan.

Kelompok bakteri yang termasuk probiotik antara lain Bacillus sp..,

Photobacterium sp., dan Lactobacillus sp. (Irianto, 2003). Bakteri dalam

saluran pencernaan terutama hewan akuatik telah diketahui memiliki peran

baik diantaranya bakteri pada genus Bacillus, Bifidobacteri, Pseudomonas,

Lactobacillus, dan Micrococcus telah terbukti sebagai bakteri yang

menguntungkan dan dapat hidup berasosiasi sebagai flora normal pada

organisme baik di dalam maupun di luar tubuh (Feliatra et al., 2004).

3

Sumber bakteri probiotik yang telah diteliti di antaranya adalah air dan

sedimen laut, karang, dan daun mangrove (Tjahjadi et al., 1994; Rosa et al.,

1997; Hala, 1999; Haryanti et al., 2000; Muliani et al., 2004).

Proses penguraian bahan organik di mangrove melibatkan multi spesies bakteri

(Suastika-Jaya et al, 1996). Bakteri-bakteri tersebut tersusun dari berbagai

jenis bakteri, seperti bakteri proteolitik, selulolitik, amilolitik, nitrifikasi dan

denitrifikasi. Limbah organik yang mempunyai kandungan protein tinggi akan

terdekomposisi menjadi senyawa yang lebih sederhana oleh bakteri proteolitik.

Beberapa bakteri proteolitik telah ditemukan yaitu Bacillus, Pseudomonas dan

Vibrio (Tsao, 1984). Secara alamiah, bakteri proteolitik sudah terdapat dalam

perairan mengrove meskipun dengan kuantitas dan kualitas yang terbatas

(Browdy et al., 2001).

Beberapa peneliti telah menemukan bakteri penghasil protease di hutan

mangrove. Yahya (2014) melaporkan bahwa golongan Bacillus sp. antara lain

B. megatrium dan B. pumilus ditemukan dalam perairan mangrove. Bakteri

menguraikan serasah secara enzimatik melalui peran aktif dari enzim

proteolitik, selulolitik dan kitinoklastik. Bakteri Bacillus sp., Pseudomonas

sp., Nitrococcus sp., Micrococcus sp. dan Vibrio sp. merupakan bakteri

chemoheterof yang tergantung pada nutrien dalam ekosistem mangrov e

(Rajab, 2010). Beberapa genus bakteri yang diketahui mampu menghasilkan

protease di antaranya Bacillus (Rao et al., 1998; Said dan Likadja, 2012).

Sejauh ini potensi dari isolat bakteri Bacillus sp. yang berasal dari hutan

mangrove di Lampung belum banyak digali, oleh karena itu perlu dilakukan

4

kajian ilmiah mengenai enzim proteolitik dari isolat Bacillus sp. sebagai

kandidat probiotik yang bersumber dari hutan mangrove di desa Marga Sari

Lampung Timur.

B. Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui karakteristik enzim

protease yang dihasilkan isolat Bacillus sp. sebagai kandidat probiotik dari

hutan mangrove wilayah Lampung Tengah.

C. Manfaat Penelitian

Hasil dari penelitian ini adalah menambah koleksi bakteri proteolitik penghasil

enzim protease dan diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah untuk

peneliti dan masyrakat mengenai karakteristik enzim protease.

D. Kerangka Pikiran

Bakteri yang dikenal menghasilkan protease ekstrasel diantaranya Bacillus sp.

Protease ekstraseluler merupakan enzim konstitutif yaitu enzim yang

dibentuk terus-menerus oleh sel.Protease merupakan enzim yang dapat

menghidrolisis senyawa protein menjadi asam amino.

Bakteri proteolitik dapat ditemukan pada habitat alami diantaranya di

kawasan hutan mangrove. Manggrove sebagai habitat bakteri mengandung

banyak protein sebagai subtrat, yang terkandung dalam berbagai komponen

penyusun lantai mangrove. Dari lingkungan mangrove di desa Margasari

ditemukan lima Isolat Bacillus sp. diantaranya isolat Bacillus sp. UJ-132.

5

Salah satu isolat yang terpilih diantaranya Bacillus sp. UJ-132. Kemampuan

isolat Bacillus sp. UJ-132 dalam menghidrolisis protein tergantung pada

jumlah protease yang dihasilkan.

Aktivitas enzim sangat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan. Kondisi

lingkungan yang mempengaruhi karakter enzim antara lain: suhu, pH, ion-ion

logam. Mengetahui sifat dan karakter suatu enzim sangat penting untuk

mengetahui kondisi optimum aktivitas enzim. Lingkungan mangrove di

daerah hutan mangrove Margasari memiliki kondisi suhu 23 oC. Pada kondisi

yang optimum, enzim akan bekerja maksimal. Kondisi lingkungan habitat asal

bakteri proteolitik sangat berpengaruh terhadap karakter enzim protease yang

dihasilkan .

E. Hipotesis

Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah diperoleh waktu produksi,

pH dan suhu optimum, inhibitor dan aktivator spesifik, serta Km dan Vmaks

yang dapat memberikan aktivitas optimum protease dari Bacillus sp. Isolat UJ-

132.

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Enzim

1. Pengertian Enzim

Enzim merupakan katalisator pilihan yang diharapkan dapat mengurangi

dampak pencemaran lingkungan dan pemborosan energi karena reaksinya

tidak membutuhkan energi, bersifat spesifik dan tidak beracun. Enzim telah

dimanfaatkan secara luas pada berbagai industri produk pertanian, kimia

dan industri obat-obatan. Tiap sifat utama dari biokatalisator adalah

menaikkan kecepatan reaksi, mempunyai kekhususan dalam reaksi dan

produk serta kontrol kinetik (Akhdiya, 2003).

Gambar 1. Struktur Kuartener Protease

7

Berdasarkan biosintesisnya, enzim dibedakan menjadi enzim konstitutif dan

enzim induktif. Enzim konstitutif adalah enzim yang selalu tersedia di

dalam sel mikroba dalam jumlah yang relatif konstan, sedangkan enzim

induktif adalah enzim yang ada dalam jumlah sel yang tidak tetap,

tergantung pada adanya induser. Enzim induktif ini jumlahnya akan

bertambah sampai beberapa ribu kali bahkan lebih apabila dalam medium

mengandung substrat yang menginduksi, terutama bila substrat penginduksi

merupakan satu-satunya sumber karbon (Rahayu, 2010).

2. Produksi Enzim

Komponen utama enzim adalah protein sehingga sintesis enzim sangat

terkait dengan proses ekspresi genetik. Oleh sebab itu, pengaturan sintesis

enzim pada dasarnya adalah pengaturan ekspresi genetik.

Mekanisme pengaturan sintesis enzim telah banyak dipelajari pada bakteri

dengan menggunakan model operon (dikemukakan oleh Francois Jacob dan

Jackues Monod, 1961). Operon terdiri atas serangkaian gen struktural yang

mengkode protein yang terlibat dalam suatu proses metabolisme tertentu.

Situs operator ialah sekuen DNA yang mengatur transkripsi gen struktural

dan gen regulator yang mengkode protein yang mengenali daerah operator.

Pada banyak bakteri, gen-gen struktural yang menentukan sintesis enzim

dalam suatu lintasan metabolik tertentu ditempatkan menurut urutan sesuai

dengan rangkaian reaksi pada lintasan tersebut. Hal ini menunjukkan

bahwa urutan reaksi pada lintasan metabolik dikendalikan oleh kromosom

(Murray et al., 2002).

8

Sintesis Enzim merupakan proses terbentuknya enzim sebagai protein yang

terdiri dari 2 tahap yaitu tahap transkripsi dan tahap translasi. Tahap

transkripsi adalah tahap dimana pada saat pembentukan mRNA di dalam

nukleus dari DNA template dengan dibantu oleh enzim polimerase. Tahap

translasi adalah tahap dimana mRNA keluar dari inti sel dan bertemu

dengan tRNA lalu dibantu oleh Ribosom yang terdiri dari sub unit besar

dan sub unit kecil (Marzuki, 2014)

1. Transkripsi

Transkripsi adalah proses pembentukan molekul RNA dari DNA.

Proses transkripsi memerlukan kerja sekelompok enzim yang disebut

dengan RNA polimerase. Untuk memulai proses ini, dibutuhkan adanya

sinyal atau tanda yang berupa gen tertentu. Gen yang menjadi tanda itu

adalah kodon AUG. Tempat mulainya transkripsi ini disebut hulu, atau

dikodekan dengan bentuk 5`. Proses dimulainya transkripsi dikenal

dengan istilah inisiasi. Pada pengakhiran proses transkripsi, ada daerah

yang disebut hilir yang sering ditandai dengan bentuk 3`. Proses

diakhirinya transkripsi dikenal dengan istilah terminasi. Proses

transkripsi selalu berjalan dari hulu ke hilir, artinya selalu berjalan

menurut arah 5` ke 3`.

Proses antara inisiasi dan terminasi adalah proses pemanjangan atau

dikenal dengan proses elongasi. Pita mRNA dengan pita DNA memiliki

panjang yang berbeda. Untaian RNA lebih pedek dari pada untaian

9

DNA. Di dalam satu untai DNA double helix bisa terjadi beberapa

proses transkripsi yang menghasilkan beberapa untai mRNA.

Informasi yang diterjemahkan dari DNA ke RNA adalah basa

nitrogennya. Jika pada untai DNA sens terdapat basa nitrogen adenin

(A), maka pada rantai mRNA akan diterjemahkan sebagai basa nitrogen

urasil (U). Jika pada untai DNA sens terdapat basa nitrogen guanin

(G), maka pada untai mRNA akan diartikan sebagai basa nitrogen

sitosin (S). Hal ini berlaku sebaliknya. Untai inisiasi pada DNA-pun

akan diterjemahkan menjadi untai terminasi pada mRNA, dan

sebaliknya.mRNA yang telah selesai dicetak (dalam arti telah selesai

menerima informasi genetik dari DNA) akan meninggalkan DNA,

keluar dari inti sel melalui pori-pori membran inti sel menuju

sitoplasma untuk melanjutkan proses translasi.

2. Translasi

Proses translasi dibantu dengan bantuan molekul-molekul perantara lain

yang terdapat di dalam sitoplasma, yaitu tRNA atau

RNA pemindah. tRNA berfungsi untuk mengikat asam amino pada satu

ujungnya, sedangkan ujung yang lain mampu untuk mengenal

kodon mRNA untuk tempat melekatnya asam amino yang dia ikat.

Asam amino yang terdapat di dalam sitoplasma akan diikat oleh tRNA.

Pengikatan ini dibantu dengan menggunakan energi yang berupa

ATP (adenin tripospat). ATP berfungsi untuk mengaktifkan asam

10

amino agar siap untuk diangkut ke subunit ribosom.Translasi meliputi

tiga tahapan, yaitu inisiasi, elongasi, dan terminasi.

3. Sifat Enzim

Enzim bersifat spesifik dalam mengkatalis suatu reaksi. Setiap enzim

memiliki suhu dan pH optimum yang berbeda-beda (spesifik untuk masing-

masing enzim). Reaksi enzimatik secara umum bekerja denga cara

menurunkan energi aktivasi. Hal inilah yang menyebabkan reaksi yang

dikatalisis secara enzimatik menjadi lebih efisien dibandingkan dengan

reaksi yang dikatalisis oleh katalis kimia (August, 2000).

Enzim mempunyai kekhususan aktivitas, yaitu berperan sebagai katalis

hanya terhadap satu jenis reaksi saja (Winarno, 1986). Sifat spesifik

(spesifisitas enzim) didefinisikan sebagai kemampuan suatu enzim untuk

mendiskriminasikan substratnya berdasarkan perbedaan afinitas substrat-

substrat untuk mencapai sisi aktif enzim (August, 2000). Sifat spesifinitas

ini dapat dimanfaatkan untuk tujuan reaksi atau jenis produk yang

diharapkan. Sifat ini sangat menguntungkan karena tidak akan dijumpai

reaksi-reaksi samping, sehingga lebih ramah lingkungan.

4. Mekanisme Kerja Enzim

Terikatnya substrat pada sisi aktif enzim menyebabkan berubahnya

keadaan substrat sehingga berada dalam keadaan transisi dan akibatnya

molekul substrat mengalami perubahan konformasi transisi yang

diperlukan agar dapat diubah menjadi produk. Beberapa ion logam yang

11

merupakan kofaktor juga membantu terjadinya ikatan sustrat dengan enzim

(Wheeler, 1994). Jika enzim telah melakukan pembentukan ikatan antara

enzim dengan substrat dengan membentuk molekul kompleks enzim

substrat, pembentukan molekul ini sangat dipengaruhi oleh bentuk sisi aktif

enzim dan kespesifikan substrat.

Menurut Saono (1976) ada dua teori pembentukan kompleks enzim substrat

yaitu:

a) Teori lock and key (Kunci Gembok)

Diilustrasikan dimana substrat yang spesifik akan terikat pada daerah

spesifik di molekul enzim yang disebut sisi aktif. Substrat mempunyai

daerah polar dan non polar pada sisi aktif yang baik bentuk

maupun muatannya merupakan pasangan substrat.

Gambar 2. Mekanisme Lock Key

b) Teori induced-fit (ketetapan induksi)

Teori ini menerangkan bahwa enzim bersifat fleksibel. Dimana

sebelumnya bentuk sisi aktif tidak sesuai dengan bentuk substrat,

12

tetapi setelah substrat menempel pada sisi aktif, maka enzim akan

terinduksi dan menyesuaikan dengan bentuk substrat.

Gambar 3. Mekanisme Induced-fit

5. Jenis Enzim

Berdasarkan biosintesisnya, enzim dibedakan menjadi enzim konstitutif

dan enzim induktif. Enzim konstitutif adalah enzim yang selalu tersedia di

dalam sel mikroba dalam jumlah yang relatif konstan, sedangkan enzim

induktif adalah enzim yang ada dalam jumlah sel yang tidak tetap,

tergantung pada adanya induser. Enzim induktif ini jumlahnya akan

bertambah sampai beberapa ribu kali bahkan lebih apabila dalam medium

mengandung substrat yang menginduksi, terutama bila substrat penginduksi

merupakan satu-satunya sumber karbon (Lidya dan Djenar, 2000).

Berdasarkan tempat bekerjanya, enzim dapat dibedakan dalam 2 golongan,

yaitu endoenzim dan eksoenzim. Endoenzim disebut juga enzim

intraseluler, dihasilkan di dalam sel yaitu pada bagian membran sitoplasma

dan melakukan metabolisme di dalam sel. Eksoenzim (enzim ekstraseluler)

merupakan enzim yang dihasilkan sel kemudian dikeluarkan melalui

dinding sel sehingga terdapat bebas dalam media yang mengelilingi sel dan

13

bereaksi memecah bahan organik tanpa tergantung pada sel yang

melepaskannya (Soedigdo, 1988).

Menurut Poedjadi (2005), enzim yang dibagi kedalam enam golongan

tersebut digolongkan berdasarkan pada jenis reaksi yang dikatalisis,

keenam golongan enzim tersebut yait:

a. Oksido-reduktase Enzim yang berperan dalam reaksi oksidasi-reduksi.

Enzim yang termasuk dalam golongan ini ada dua yaitu dehidrogenase

dan oksidase. Contoh enzim dehidrogenase yaitu : alkohol

dehidrogenase dan glutamat dehidrogenase. Contoh enzim oksidase

yaitu : glukosa oksidase dan glisin oksidase

b. Transferase Enzim yang berperan dalam reaksi pemindahan gugus

tertentu. Contoh enzim yang termasuk golongan ini adalah

metiltransferase, hidroksimetiltransferase dan aminotransferase.

c. Hidrolase Enzim yang berperan dalam reaksi hidrolisis. Ada tiga jenis

enzim hidrolase, yaitu jenis yang memecah ikatan ester, memecah

glikosida, dan yang memecah ikatan peptida. Contoh enzim hidrolase

yaitu esterase, lipase, amilase, aminopeptidase, karboksipeptidase,

pepsin, tripsin, dan kimotripsin.

d. Liase Enzim yang termasuk golongan ini mempunyai peranan penting

didalam reaksi pemisahan suatu gugus dari suatu substrat (bukan cara

hidrolisis) 9 atau sebaliknya. Contoh enzim golongan ini yaitu:

dekarboksilase, aldolase, dan hidratase.

e. Isomerase Enzim yang termasuk dalam golongan ini bekerja pada

reaksi perubahan intramolekular misalnya reaksi perubahan glukosa

14

menjadi fruktosa. Contoh : ribulosafosfat epimerase, dan glukosafosfat

isomerase.

f. Ligase Enzim yang berperan pada reaksi penggabungan dua molekul,

oleh karenanya enzim-enzim tersebut juga dinamakan sintetase. Ikatan

yang terbentuk adalah ikatan C-O, C-S, C-N, atau C-C. Contoh:

glutamin dan piruvat karboksilase.

Tabel 1. Jenis-jenis Enzim

6. Faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim

a. Temperatur

Suhu inkubasi sangat mempengaruhi kerja dari enzim, suhu inkubasi

yang lebih tinggi dari suhu optimum kerja enzim dapat menyebabkan

terjadinya perubahan konformasi sisi aktif enzim yang disebabkan

adanya denaturasi protein enzim (Aehle, 2004). Sebagian besar enzim

terdenaturasi pada suhu diatas 50 OC (Wolfe, 1993). Dalam batas-batas

15

suhu tertentu, kecepatan reaksi yang dikatalisis enzim akan naik bila

suhunya naik.

Temperatur mempengaruhi aktivitas enzim. Pada temperatur rendah,

reaksi enzimatis berlangsung lambat, kenaikan temperatur akan

mempercepat reaksi, hingga suhu optimum tercapai dan reaksi

enzimatis mencapai maksimum. Kenaikan temperatur melewati

temperatur optimum akan menyebabkan enzim terdenaturasi dan

menurunkan kecepatan reaksi enzimatis (Armstrong,1983).

Gambar 4. Pengaruh Suhu

b. pH (Derajat Keasaman)

Eenzim pada umumnya bersifat amfolitik, yang berarti enzim

mempunyai konstanta disosiasi pada gugus asam maupun gugus

basanya, terutama pada gugus residu terminal karboksil dan gugus

terminal amino. Perubahan kereaktifan enzim diperkirakan merupakan

akibat dari perubahan pH lingkungan (Winarno, 1989). Perubahan pH

dapat mempengaruhi asam amino kunci pada sisi aktif, sehingga

menghalangi sisi aktif enzim membentuk kompleks dengan substratnya

(Page, 1989).

16

Gambar 5. Pengaruh pH

c. Konsentarasi Enzim

Kecepatan laju reaksi enzimatik berhubungan langsung antara

konsentrasi enzim dengan substrat (Orten and Neuhaus, 1970).

Konsentrasi enzim secara langsung mempengaruhi kecepatan laju

reaksi enzimatik, laju reaksi meningkat dengan bertambahnya

konsentrasi enzim (Poedjiadi, 2005).

d. Konsentrasi substrat

Kecepatan reaksi enzimatis pada umumnya tergantung pada konsentrasi

substrat. Kecepatan reaksi akan meningkat apabila konsentrasi substrat

meningkat. Peningkatan kecepatan reaksi ini akan semakin kecil

hingga tercapai suatu titik batas yang pada akhirnya penambahan

konsentrasi substrat hanya akan sedikit meningkatkan kecepatan reaksi

(Lehninger, 1990).

e. Aktivator dan inhibitor

17

Beberapa enzim memerlukan aktivator dalam reaksi katalisnya.

Aktivator adalah senyawa atau ion yang dapat meningkatkan kecepatan

reaksi 11 enzimatis. Komponen kimia yang membentuk enzim disebut

juga kofaktor. Kofaktor tersebut dapat berupa ion-ion anorganik seperti

Zn, Fe, Ca, Mn, Cu, Mg atau dapat pula sebagai molekul organik

kompleks yang disebut koenzim (Martoharsono dan Soeharsono, 1997).

Menurut Wirahadikusumah (2001) inhibitor merupakan suatu zat kimia

tertentu yang dapat menghambat aktivitas enzim.

Gambar 6. Pengaruh Inhibitor

7. Kinetika Enzim

Parameter dalam kinetika reaksi enzim adalah konstanta Michaelis-

Menten (Km) dan laju reaksi maksimum (Vmaks). Mekanisme reaksi

enzimatik untuk sebuah subtrat tunggal. Enzim (E) mengikat substrat

(S) dan menghasilkan produk (P). Kinetika enzim menginvestigasi

bagaimana enzim mengikat substrat dengan mengubahnya menjadi

produk. (Soedigdo, 1988).

18

Konsentrasi substrat mempengaruhi kecepatan reaksi yang dikatalisis

oleh enzim. Pada konsentrasi substrat yang amat rendah, kecepatan

reaksipun amat rendah, tetapi, kecepatan ini akan akan meningkat

dengan meningkatnya konsentrasi substrat. Pada batas kecepatan

maksimum (Vmaks), enzim menjadi jenuh oleh substratnya, dan tidak

dapat berfungsi lebih cepat (Lehninger, 1990).

Michaelis dan Menten mendefinisikan suatu tetapan, yang dinyatakan

sebagai Km yang bermanfaat dalam menyatakan hubungan yang tepat

di antara konsentrasi substrat dan kecepatan reaksi enzimatik. Nilai Km

didefinisikan sebagai konsentrasi substrat tertentu pada saat enzim

mencapai kecepatan setengah kecepatan maksimum. Nilai Km

merupakan unsur kunci di dalam persamaan Michaelis-Menten dan

bersifat khas bagi setiap enzim dengan menggunakan substrat tertentu

yang spesifik pada kondisi pH dan temperatur tertentu (Rajab, 2010).

8. Isolasi Enzim

Tahapan isolasi enzim meliputi:

a. Sentrifugasi

Sentrifugasi merupakan tahap awal pemurnian enzim. Metode ini

digunakan untuk memisahkan enzim ekstraseluler dari sisa-sisa sel.

Sentrifugasi akan menghasilkan supernatan yang jernih dan endapan

yang terikat kuat pada 13 dasar tabung, yang kermudian dipisahkan

secara normal. Sel-sel mikroba biasanya mengalami sedimentasi pada

19

kecepatan 5000 selama 15 menit (Scopes, 1982; Walsh and Headon,

1994).

Menurut Cooper (1994), prinsip sentrifugasi berdasarkan pada

kenyataan bahwa setiap partikel yang berputar pada laju sudut yang

konstan akan memperoleh gaya keluar (F). Besar gaya ini bergantung

pada laju sudut ω (radian/detik) dan radius pertukarannya (sentimeter)

(Sariningsih, 2000).

b. Fraksinasi dengan ammonium sulfat

Presipitasi adalah proses penambahan senyawa yang dapat

menggumpalkan dan memisahkan protein dari bahan lain sehingga

didapatkan protein yang lebih murni (Suhartono et al., 1992). Menurut

Chaplin dan Bucke (1990), presipitasi protein merupakan metode yang

berguna untuk pemekatan protein dan sering dilakukan pada tahap awal

dari pemurnian enzim. Presipitasi protein dapat dilakukan dengan

beberapa cara antara lain perubahan pH, penambahan pelarut organik

dan penambahan garam.

Pemekatan protein dengan penambahan garam ke dalam larutan enzim

merupakan cara yang banyak dilakukan. Garam yang dapat digunakan

berupa natrium klorida, natrium sulfat, atau ammonium sulfat.

Ammonium sulfat lebih sering digunakan karena memiliki beberapa

kelebihan dibandingkan garam-garam yang lain, yaitu mempunyai

kelarutan yang tinggi, tidak mempengaruhi aktivitas enzim, mempunyai

20

daya pengendapan yang efektif, mempunyai efek penstabil terhadap

kebanyakan enzim, dapat digunakan pada berbagai pH dan harganya

murah (Scopes, 1982).

Penambahan garam pada konsentrasi tinggi akan menurunkan kelarutan

protein. Hal ini dikarenakan adanya peningkatan muatan listrik di

sekitar protein yang akan menarik molekul-molekul air dari protein.

Interaksi hidrofobik sesama molekul protein pada suasana ionik tinggi

akan menyebabkan pengendapan protein, yang disebut salting out.

Protein yang hidrofobisitasnya tinggi akan mengendap lebih dahulu,

sedangkan protein yang memiliki sedikit residu non polar akan tetap

larut meskipun pada konsentrasi garam yang paling tinggi (Scopes,

1982 ; Walsh and Headon, 1994).

Dialisis Salah satu metode yang digunakan untuk meningkatkan

kemurnian enzim adalah dialisis. Prinsip dialisis yaitu memisahkan

molekul-molekul besar dari molekul-molekul kecil dengan bantuan

membran semipermeable. Dialisis berfungsi untuk memisahkan garam-

garam anorganik agar tidak mengganggu tahap pemurnian enzim

selanjutnya. Dialisis dapat dilakukan dengan menggunakan kantong

selofan, kantong ini memiliki ukuran pori-pori yang lebih kecil dari

ukuran protein sehingga protein tidak dapat keluar dari kantong selofan.

Penggunaan kantong selofan memiliki beberapa keuntungan yaitu

mudah digunakan, memiliki harga yang relatif murah dan mudah

didapatkan (Kristanti, 2001).

21

B. Enzim Protease

Enzim protease adalah enzim yang dapat menghidrolisis protein menjadi asam

amino. Masing-masing protease mempunyai pengikat peptida yang spesifik.

Enzim ini diperoleh dari tumbuhan dan mikroorganisme. Sifat proteolitik

didasarkan pada kemampuan untuk memutus ikatan peptida protein.

(Suhartono, 1989). Menurut Surwanto (1994) berdasarkan pH optimum untuk

aktifnya enzim protease dibedakan atas 3 kelompok yaitu protese alkali,

protease netral dan protease asam.

Protease disebut juga peptidase atau proteinase, merupakan enzim golongan

hidrolase yang akan memecah protein menjadi molekul yang lebih sederhana,

seperti menjadi oligopeptida pendek atau asam amino, dengan reaksi hidrolisis

pada ikatan peptide. Enzim ini diperlukan oleh semua mahkluk hidup karena

bersifat esensial dalam metabolism protein. Protein ini memiliki banyak

struktur sekunder beta-sheet dan alpha-helix yang sangat pendek (Poliana,

2007).

Berdasarkan cara kerjanya Palmerr (1981) membagi protease menjadi dua,

yaitu:

1. Proteolisis terbatas,yang memcah hanya satu atau beberapa ikatan peptida

tertentu dari sebuah protein target. Contohnya adalah perubahan

prohormon menjadi hormon.

2. Proteolitis tak terbatas, yaitu mendgradasi protein menjadi asam amino

penyusunnya.

22

Hartley (1960) membagi protease menjadi 4 golongan :

1. Protease Serin,

a. Memiliki residu serin dalam lokasi aktifnya.

b. Bersifat endopeptidase

c. Yang termasuk enzim ini: tripsin, kimotripsin, elastase dan subtilin

2. Protease sulfhidril

a. Memiliki residu sulfhidril pada lokasi aktif

b. Kerja enzim ini dapat dihambat oleh senyawa oksidator, alkilator dan logam

berat

c. Yang termasuk enzimini : protease dari tanaman dan mikroba seperti

papain, fisin dan bromelin

3. Protease metal

a. Keaktifannya tergantung pada adanya metal dengan hubungan stoikiometrik

1 mol metal/1 molenzim

b. Dapat dihambat oleh EDTA (Ethlene Diamine Tetra Acetic Acid) dimana

dapat mengkelat metal sehingga keaktifan enzim hilang/berkurang.

c. Yang termasuk enzim ini : karboksipeptidase untuk beberapa amino

peptidase

4. Protease asam

a. Enzim yang pada lokasi aktifnya terdapat dua gugus karboksil

b. Aktif pada pH rendah,optimum 2,0-5,0

c. Keaktifannya dapat dihambat oleh p-bromo fenasilbromida.

d. Yang termasuk enzim ini : pepsin, renin dan protease kapang.

7

23

Gambar 7. Struktur Sekunder beta-sheet dan alpHa-helixProtein

C. Bacillus sp.

Bacillus sp. merupakan bakteri berbentuk batang, tergolong bakteri gram

positif, motil, menghasilkan spora yang biasanya resisten pada panas, bersifat

aerob (beberapa spesies bersifat anaerob fakultatif), katalase positif, dan

oksidasi bervariasi. Tiap spesies berbeda dalam penggunaan gula, sebagian

melakukan fermentasi dan sebagian tidak (Barrow, 1993).

Ditambahkan Claus & Barkeley (1986) genus Bacillus mempunyai sifat

fisiologis yang menarik karena tiap-tiap jenis mempunyai kemampuan yang

berbeda-beda, diantaranya : (1) mampu mengdegradasi senyawa organik

seperti protein, pati, selulosa, hidrokarbon dan agar, (2) mampu menghasilkan

antibiotik; (3) berperan dalam nitrifikasi dan dentrifikasi; (4) pengikat nitrogen;

(7) bersifat khemolitotrof, aerob atau fakutatif anaerob, asidofilik, psikoprifilik,

atau thermofilik. Menurut Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8

th editions dalam Hadioetomo (1985) kalsifikasi Bacillus sp.p. adalah sebagai

berikut:

Kerajaan : Procaryotae

Divisi : Bacteria

24

Kelas : Schizomycetes

Bangsa : Eubacteriales

Suku : Bacillaceae

Marga : Bacillus

Jenis : Bacillus spp.

Menurut Yuniati (2015) Mikroorganisme merupakan sumber enzim yang

paling potensial dibandingkan tanaman dan hewan. Penggunanan

mikroorganisme lebih menguntungkan karena pertumbuhannya cepat, dapat

tumbuh pada substrat yang murah, lebih mudah ditingkatkan hasilnya melalui

pengaturan kondisi pertumbuhan dan rekayasa genetik.

Gambar 8. Bacillus sp.

D. Bakteri Probiotik

Probiotik adalah sediaan sel mikroba hidup yang memiliki pengaruh

menguntungkan terhadap kesehatan dan kehidupan inangnya (Salminen et

al., 1999). probiotik didefinisikan sebagai segala bentuk pakan tambahan

erupa sel mikroba utuh (tidak harus hidup) yang mengutugkan bagi hewan

inangnya melalui cara menyeimbangkan kondisi mikrobiologis inang,

memodifikasi bentuk asosiasi dengan inang atau komunitas mikroba

25

lingkunga hidupnya, meningkatkan pemanfaatan nutrisi pakan atau

memperbaiki kualitas lingkungan (Gatesoupe,1999; Verschure et al.,2000;

Irianto, 2003; Prima, 2004; Guarto dan Hendrajat, 2008).

Beberapa probiotik diketahui dapat menghasilkan enzim pencernaan seperti

amilase, protease dan lipase yang dapat meningkatkan konsentrasi enzim

pencernaan pada saluran pencernaan inang sehingga dapat meningkatkan

perombakan nutrien. Terdapat beberapa mekanisme respon probiotik yaitu

meliputi produksi bahan penghambat secara langsung, penurunan pH luminal

melalui produksi asam lemak terbang rantai pendek, kompetisi terhadap

nutrien dan tempat pelekatan pada dinding usus, interaksi bakterial (CE),

resistensi kolonisasi contohnya Lactobacilli vs bakteri patogen, merubah

respon imun, dan mengatur ekspresi gen colonocyte (Fooks dan Gibson,

2002; Steer et al., 2000; Mack et al., 1999).

Berbagai jenis mikroorganisme yang digunakan sebagai probiotik diisolasi

dari isi usus pencernaan, mulut, dan kotoran ternak atau manusia. Pada saat

ini, mikroorganisme yang banyak digunakan sebagai probiotik yaitu strain

Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus sp. , Streptococcus, yeast dan

Saccharomyces cereviceae. Mikroorganisme tersebut harus non-patogen,

Gram positif, strain yang spesifik, anti E. coli, tahan terhadap cairan empedu,

hidup, melekat pada mukosa usus, dan minimal mengandung 30 x 109 cfu/g

(Mack et al., 1999).

Target utama dari penggunaan probiotik dan prebiotik yaitu: (i) peningkatan

ketahanan inang terhadap patogen eksogenus pencernaan; (ii) mengontrol

26

penyakit dimana komponen mikroflora pencernaan telah diimplikasi dalam

aeteologi; (iii) menurunkan keracunan metabolisme mikrobial dalam

pencernaan; dan (iv) mengatur sistim imunitas inang. Secara keseluruhan,

tujuan dari strategi ini yaitu meningkatkan pertumbuhan bakteri yang dapat

bersaing dengan, atau antagonis terhadap bakteri patogen. Saat ini telah

banyak dilakukan penelitian penggunaan probiotik dan prebiotik terhadap

ternak non ruminansia maupun ruminansia. Pengaturan bakteri pencernaan

agar menjadi satu komunitas yang sehat melalui pemberian probiotik atau

prebiotik khususnya karbohidrat meningkatkan bakteri yang menguntungkan

saat ini banyak diteliti (Faggia, 2010).

Beberapa probiotik yang telah terbukti menekan populasi bakteri vibrio adalah

Bacillus sp. (Dalmin et al., 2001), Bacillus subtilis BT23 (Vaseeharan dan

Ramasamy, 2003), Bacillus subtilis UTM 126 (Balcázar dan Rojas-Luna,

2007).

Terdapat beberapa keuntungan dalam penggunaan probiotik atau biokontrol

untuk penanggulangan penyakit antara lain; (1) organisme yang dipakai telah

dipertimbangkan lebih aman daripada berbagai bahan kimia yang digunakan;

(2) tidak terakumulasi dalam rantai makanan; (3) adanya proses reproduksi

yang dapat mengurangi pemakaian yang berulang; (4) organisme sasaran

jarang yang menjadi resisten terhadap agen probiotik/biokontrol dibandingkan

dengan resistensinya terhadap bahan kimia atau antibiotik; (5) dapat dipakai

untuk pengendalian secara bersama-sama dengan cara-cara proteksi yang telah

ada sampai saat ini (Suwanto, 1994).

27

E. Hutan Mangrove

1. Pengertian Hutan Mangrove

Mangrove merupakan salah satu tumbuhan yang dikenal sebagai pelindung

fisik pantai untuk mencegah adanya abrasi. Mangrove tumbuh dan hidup

pada daerah berlumpur, basah, dan perairan pasang surut daerah tropis

(Purnobasuki, 2005).

Gambar 9. Ekosistem Hutan Mangrove

Serasah dan batang lapuk mangrove merupakan bahan organik yang telah

mengalami beberapa tahap dekomposisi oleh mikroorganisme dan telah

tercampur ke dalam tanah untuk menghasilkan zat organik dan mineral

bagi kesuburan tanah serta sumber bagi kehidupan fitoplankton. (Arief,

2007). Berbagai zat organik hasil dekomposisi serasah dan batang lapuk

oleh mikroorganisme umumnya adalah selulosa, hemiselulosa, dan pektin.

Diantara komponen organik tersebut, pektin merupakan substansi terbesar

pada tanaman yaitu berkisar antara 0,5-4,0 % dari berat basah tumbuhan

28

(Sakai et al., 1993; Whitaker, 1990; Kashyap et al., 2001; Jayani et al.,

2005).

2. Bakteri pada Mangrove

Kelembaban tanah hutan mangrove sangat basah dan sebagian titik lokasi

tanahnya berlumpur. Kondisi tanah yang lembab dan basah ini adalah

salah satu ciri dari habitat t anaman mangrove. Tanah mangrove yang

berlumpur ini menimbun serasah, sehingga serasah akan mengalami

dekomposisi oleh berbagai jasad renik (Lidya, 2000).

Spesies bakteri pektinolitik telah berhasil diisolasi dan diidentifikasi dari

tanah Akola India yaitu Bacillus firmus, Bacillus coagulans, Bacillus

endophyticus, dan Bacillus vietnamensis (Aaisha dan Barata, 2016). Selain

itu, ditemukan pula bakteri pektinolitik di tanah perkebunan mangga

Andhra Pradesh yaitu Paenibacillus jamilae (Sridevi et al., 2016).

Penelitian serupa juga ditemukan bakteri pektinolitik dalam sedimen tanah

limbah pertanian di daerah El-Farafra Oasis, New Valley governorate,

Egypt yakni Bacillus subtilis (El-Sayed, 2015).

Mangrove juga mengandung protein yang dapat didegradasi oleh bakteri

proteolitik. Mann (1986) mengemukakan bahwa berat kering daun

mangrove mengandung 61 % protein. Bakteri akan menguraikan serasah

secara enzimatik melalui peran aktif dari enzim proteolitik Pada area

mangrove juga banyak ditemukan bangkai hewan-hewan air yang

mengandung protein pula; selanjutnya protein tersebut dapat didegradasi

29

oleh bakteri proteolitik yang hidup dalam tanah mangrove. Apabila

protein, baik yang berasal dari sisa-sisa mangrove maupun yang berasal

dari bangkai hewan-hewan air telah tergradasi oleh bakteri-bakteri

proteolitik, maka akan menambah nutrisi dalam tanah mangrove, sehingga

dapat menyuburkan area mangrove.

III. METODOLOGI PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilakukan pada bulan November – Januari 2018 di Laboratorium

Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam, Universitas Lampung.

B. Alat dan Bahan

1. Alat

Alat- alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu laminar air flow

cabinet, autoclave, oven, hot plate magnetic stirrer, neraca analitik, pH

meter, ultrasonic cleaner, inkubator, erlenmeyer, beaker glass, tabung

reaksi, mikro tip, cawan petri, kapas, kain kassa, keranjang, tabung reaksi,

kertas label, pipet volumetri dan pump, bunsen, gelas ukur, sentrifugasi

dingin, inkubator, orbital shaker, spektrrofotometer, kertas bening, pena,

stopwatch, ose bulat, ice bucket, ice gel, low incubator, sentri fugased dan

waterbath

2. Bahan

Bahan yang diperlukan dalam penelitian ini meliputi isolat bakteri Bacillus

sp. yang diperoleh dari kawasan Hutan Mangrove desa Margasari,

31

aquadest, media Sea Water Complete (SWC (bacto pepton, yeast

extract,gliserol,air laut, aquadest)), Skim Milk, substrat kasein, TCA

(thrichloroacetic acid) 0,1 M, Na2CO3 0,4 M, pereaksi Follin Ciocalteu,

Tyrosin standart,larutan Ion logam (Mn2+, Fe2+, Ca2+, Cu2+, Mg2+), Inhibitor

spesifik (EDTA), buffer Tris-HCL, buffer Sitrat (pH 5 dan 6), buffer fosfat

(pH 7 dan 8), dan buffer glisin NaOH (pH 9 dan 10) 0,5 M.

C. Metode Penelitian

Uji proteolitik dari isolat bakteri dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif. Uji

ini menggunakan 1 jenis isolat. Uji kualitatif ditentukan dengan melihat

adanya zona bening di sekitar koloni. Uji kuantitatif aktivitas protease

ditentukan dengan menggunakan metode Bergmeyer dan Grassl (1983) yang

diukur berdasarkan jumlah tirosin yang terbentuk. Banyaknya tirosin diukur

dengan spektrofotometer berdasarkan absorbansinya pada panjang gelombang

578 nm. Karakteristik enzim yang diaamti meliputi waktu produksi, suhu dan

pH optimum, pengaruh ion logam dan inhibitor spesifik, serta penentuan Km

dan Vmaks.

D. Analisis Data

Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif.

E. Prosedur kerja

Prosedur kerja yang dilakukan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:

1. Peremajaan Isolat Bakteri

Isolat yang digunakan adalah Bacillus sp. dengan kode isolat UJI32 yang

32

diisolasi dari udang Pasir di kawasan hutan mangrove dil akukan uji

proteolitik dan selanjutnya diremajakan untuk diproduksi dan karakkterisai

enzim.

a. Uji Aktivitas Protease Secara Kualitatif

Uji kualitatif dilakukan dengan menggunakan media SWC agar yang

ditambah Skim Milk 1 %.Suspensi bakteri Bacillus sp. isolat UJ-132

proteolitikyang telah diremajakan diambil sebanyak 1 ose dan di

inokulasikan ke dalam cawan petri yang berisi media SWC dan skim

Milk lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 OC. Jika terbentuk

zona bening disekitar koloni, hal tersebut menunjukkan adanya

aktivitas proteolitik ditunjukan dengan terlihatnya zona bening yang

muncul di sekitar koloni yang terbentuk (Putri, 2012).

b. Uji Aktivitas Enzim Protease Secara Kuantitatif

1. Pembuatan Starter Isolat Bakteri Proteolitik

Isolat bakteri proteolitik yang yang berumur 48 jam pada media

SWC diambil 3 ose dan diinokulasikan ke dalam erlenmeyer ukuran

250 ml yang berisi 50 ml media SWC, kemudian diinkubasi selama

24 jam di atas orbital shaker pada suhu ruang dengan kecepatan 120

rpm.

33

2. Produksi Enzim Protease

Starter bakteri proteolitik sebanyak 5 ml diinokulasikan ke dalam 45

ml media SWC yang telah ditambah Skim Milk 0,25 %, kemudian

diinkubasi selama 0, 6, 12, 18, 24, 30, dan 36 jam di atas orbital

shaker dengan kecepatan 120 rpm dalam suhu ruang. Selanjutnya,

kultur dimasukkan ke dalam tabung dan enzim diisolasi dengan cara

disentrifugasi pada suhu 4 OC pada kecepatan 10000 rpm selama 10

menit. Supernatan yang diperoleh digunakan untuk uji aktivitas

protease.

3. Uji Aktivitas Enzim Protease

Aktivitas protease diukur dengan metode Bergmeyer dan Grassl

(1983), dengan menggunakan substrat kasein Hammerstein (b/v).

Prosedur pengujian aktivitas protease adalah mereaksikan 0,1 ml

enzim dengan 0,5 ml bufer Fosfat yang mengandung 2 % kasein.

Campuran reaksi diinkubasi pada suhu 37 OC selama 10 menit, lalu

ditambahkan 0,1 M TCA (Trichloroacetic Acid). Larutan

diinkubasi kembali pada suhu 37 OC selama 10 menit, dilanjutkan

dengan sentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm 10 menit dengan

suhu 4 OC. Dari campuran hasil sentrifugasi diambil 0,375 ml

supernatan dan ditambahkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 1,25

ml Na2CO3 0,4 M, kemudian ditambahkan 0,25 ml pereaksi Folin

Ciocalteau (1:2) dan diinkubasi pada suhu 37 OC selama 20 menit.

34

Hasil inkubasi diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada

panjang gelombang 578 nm (Bergmeyer dan Grassl, 1983).

Tabel 2. Mekanisme Uji Kuantitatif Protease

Blanko(ml)

Standar(ml)

Sampel(ml)

Substrat kasien dalam BufferFosfat (0,1 M, pH 7)

0,5 0,5 0,5

Enzim - - 0,1Tirosin standar - 0,1 -Aquadest 0,1 - -Inkubasi pada optimum selama 10 menit

TCA (0,1 M) 0,5 0,5 0,5Enzim 0,1 0,1 -Aquadest - - 0,1Inkubasi pada 37 oC selama 10 menitSentrifugasi 10000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 oCFiltrat 0,375 0,375 0,375Na2CO3 (0,4 M) 1,25 1,25 1,25Pereaksi Follin (1:2) 0,25 0,25 0,25Diamkan selama 20 menit pada suhu optimumBaca absorbansinya pada panjang gelombang 578 nm

Aktivitas ptotease dihitung dalam satuan PU (Protease Unit) per ml

ekstrak enzim (Djajasukma, 1993).

Keterangan :

PU : Unit Aktivitas Protease (Unit/ml)Asb : Nilai Absorbansi SampelAst : Nilai Absorbansi StandardAbl : Nilai Absorbansi BlankoT : Waktu

35

4. Karakterisasi Enzim Protease

a. Penentuan Suhu Optimum

Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim diuji dengan cara

mereaksikan larutan ekstrak kasar enzim dan 0,25 % substrat

kasein. Dengan variasi suhu uji 20, 30, 40, 50, 60 dan 70 OC.

Selanjutnya dilakukan pengukuran aktivitas enzim mengikuti

metode Bergmeyer dan Grassl. Suhu optimum akan

menghasilkan hasil produksi yang maksimum

b. Penentuan pH Optimum

Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim diuji dengan cara

mereaksikan larutan ekstrak kasar enzim dan 0,25 % substrat

kasein dinkubasi pada suhu 37 OC dalam satu seri bufer 0,05 M

yang berbeda, yakni: pH 4 dan 5 (buffer sitrat), pH 6 dan 7

(buffer fosfat), pH 8 dan 9 (buffer trisHCl), pH 10, 11 dan 12

(buffer glisin-NaOH). Selanjutnya dilakukan pengujian aktivitas

enzim mengikuti metode Bergmeyer dan Grassl (Soeka dan

Sulistiani, 2014).

c. Pengujian Daya Hambat Inhibitor dan Berbagai Ion LogamTerhadap Aktivatas Enzim Protease

Pengaruh ion logam Ca2+, Mn2+, Cu2+, Mg2+, Fe2+ sebagai aktivator

yang digunakan dalam bentuk garam masing-masing secara

berurutan adalah sebagai berikut: CaCl2, MnCl2, CuCl2, MgCl2, dan

36

FeCl3. Senyawa inhibitor untuk aktivitas protease yang digunakan

adalah senyawa pengkelat ion logam yang, asam etilen

diamintetraasetat (EDTA) dan satu tabung sebagai kontrol (tanpa

ion logam). Substrat enzim yang digunakan kasein 0,25 % yang

direaksikan dengan 1 µM dan 5 µM ion logam aktivator dan

senyawa inhibitor di atas. Enzim yang telah direaksikan dengan

ion logam dan inhibitor diinkubasi selama 10 menit pada suhu dan

pH optimum, kemudian dilakukan uji aktivitas enzim dengan

metode Bergmeyer dan Grassl (1983) yang dimodifikasi. Hasil uji

aktivitas protease kemudian dibandingkan dengan uji aktivitas

protease pada sampel yang tidak mendapat penambahan logam

(Baehaki, 2012 ; Wahyuntari dan Hendrawati, 2012).

d. Penentuan Km dan Vmaks

Penentuan kinetika enzim ini menggunakan hasil uji aktivitas

enzim mengikuti metode Bergmeyer dan Grassl (1983 ) yang

dimodifikasi pada suhu dan pH optimumnya dengan menggunakan

variasi konsentrasi substrat kasein sebagai berikut: 0 %, 1 %,

1,5 %, 2 % , dan 2,5 %. Nilai aktivitas protease yang diperoleh

kemudian digunakan untuk membuat kurva hubungan antara

konsentrasi kasein dan aktivitas spesifik enzim. Kemudian

hasilnya dimasukkan dalam persamaan linear Lineweaver-Burk.

Nilai Km dan Vmaks diperoleh dengan rumus (Wahyuntari dan

Hendrawati, 2012):

V. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Karakter enzim protease dari isolat Bacillus sp. UJ-132 adalah waktu

produksi optimum selama 18 jam. Enzim protease ini mempuyai pH

optimum 5. Suhu optimum enzim ini tergolong termostabil yaitu pada

suhu 50 oC. Semua ion logam (Ca2+, Mn2+, Cu2+, Mg2+) berperan sebagai

inhibitor kecuali ion Fe2+ yang membantu sebagai aktivator pada

konsentrasi 5 µM. Nilai Vmaks enzim protease 0,33 U/ml sedangkan Km

senilai 4,59 mg/ml substrat, enzim ini mempunyai afinitas yang tinggi

terhadap substrat.

B. Saran

Untuk mendapatkan hasil kerja enzim yang lebih baik, maka diperlukan

pemurnian serta karakterisasi dengan menggunakan elektroforesis dan

perlu dilakukan pengujian lebih lanjut dengan mengaplikasikan enzim

protease isolat Bacillus sp. UJ-132 pada pakan untuk budidaya perairan.

DAFTAR PUSTAKA

Aaisha, G.A., dan D.L. Barate. 2016. Isolation and Identification of PectinolyticBacteria from Soil Samples of Akola Region, India. Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci. 5(1): 514-521.

Ali, Ridlo dan R. Pramesti. 2009. Aplikasi Ekstrak Rumput LautSebagai Agen Imunostimulan Sistem Pertahanan Non Spesifik PadaUdang (Litopennaeus vannamei). J. Ilmu Kelautan. Vol 14 (3):133-137.

Adinarayana, K., P. Ellaiah, dan D.S. Prasad. 2003. Purification and PartialCharacterization of Thermostable Serine Alkaline Protease from a NewlyIsolated Bacillus subtilis PE 11, AAPS Pharm Sci Tech, 4 (4), 1-9.

Aehle, W. 2004. Enzyme in Industry. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA,Weinheim. Germany. 175, 219, 232.

Akhdiya, A. 2003. Isolasi Bakteri Penghasil Enzim Protease Alkalin Termostabil.Buletin Plasma Nutfah 9 (2).

Arief, M., Mufidah, dan Kusriningrum. 2007. Pengaruh Penambahan Probiotikpada Pakan buatan Terhadap Pertumbuhan dan Rasio Konversi Pakan IkanNila Gift (Oreochromis niloticus). Berkala Ilmiah Perikanan 3(2): 53-58

Armstrong, F.B. 1983. Biochemistry, Second Edition. Oxford University Press.135-139, 142-143.

August, E.G. 2000. Kajian lipase amobil dari Aspergillus niger pada pembuatanMAG yang bersifat antibakteri dati minyak kelapa. Tesis. Program PascaSarjana. Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Badan Pusat Statistik (BPS) Indonesia . 2016 . Produksi Perikanan Laut yangdijual di TPI. Jakarta.

Baehaki, A., Rinto dan A. Budiman . 2012. Isolasi dan Karakterisasi Proteasedari Bakteri Tanah Indralaya Sumatera Selatan. J. Teknol dan IndustriPangan112 : (37-41).

Balcazar, J.L., I. de Blas., I. Ruizzarzuela., D. Cunningham., D. Vandrell., danJ.L. Muzquiz. 2006. A review: The Role of Prebiotics in Aquaculture.Veterinary Mincrobiology 114 (2006): 173-186

49

Barrow, G.I. dan R.K.A. Feltham. 1993. Cowan and Steel’s Manual for theIdentification of Medical Bacteria Third Edition. Syndicate of theUniversity of Cambridge. United Kingdom.

Bergmeyer dan Grassl. 1983. Method of Enzymatic Analysis. Third Edition.VCH (Verlagsgesellschaft), Meinheim, Germany. Volume II (Samples,reagents, assesment of results). pp. 1 – 159.

Browdy, C.L., D.A.D. Bratvold., Stokes, dan R.P. Mcintosh. 2001. Perspective onthe application of closed shrimp culture system. P20-34. J. Jory (Eds).

Chaplin, M.F. dan Bucke. 1990. Enzyme Technology. Cambridge UniversityPress. England.

El-Sayed, M.H. 2015. Thermoalkali-Stable Pectinase from Bacillus subtilis StrainNVFO 19 Isolated from Agricultural Waste Dump Soil. 2015. CurrentResearch in Microbiology and Technology 3 (6) : 805-815.

Claus, D. dan R.C.W. Berkeley. 1986. Genus Bacillus Cohn 1872, 174. In Sneath,P. H. A., (ed.) Bergey’s manual of systematic bacteriology, Vol. 2,Williams and Wilkins, Baltimore, 1105-1139.

Cooper, T.G. 1994. The Tool of Biochemistry. John Wiley and Sons. Canada.

Prima, C.P. 2004. Pentingnya probiotik bagi tambak udang. CP Shrimp News.Surabaya.

Dalmin, G., Kathiresan., dan K. Purushothaman. 2001. Effect of Probiotics onBacterial Population and Health Status of Shirmp in Culture PondEcosystem. Indian J. Exp. Biol. 39, 939-942

Djajasukma. 1993. Isolasi Enzim Protease Dari Mucor javanicus. Pros. SeminarHasil Litbang SDH.

Esti, Y., L. Nurita., dan Arimurti .S. 2009. Karakterisasi Protease Ekstrak KasarBacillus sp 31. Jurnal Ilmu Dasar. 10 : (101-108)

Fadhilah, S.P., Z. Hasan, dan Haetami .K. 2012. Pengaruh Pemberian BakteriProbiotik Pada Pelet Yang Mengandung Kaliandra (Calliandracalothyrus)terhadap Pertumbuhan Benihan Nila (Oreochromis niloticus). J. Perikanandan Kelautan. Vol 3 (4): 285-291.

Feliatra., I. Efendi, dan E. Suryadi. 2004. Isolasi dan Identifikasi BakteriProbiotik dari Ikan Kerapu Macan (Ephinephelus fuscogatus) dalamUpaya Efisiensi Pakan Ikan. Jurnal Natur Indonesia 6(2): 75-80.

50

Fooks, L.J. dan G.R. Gibson .2002. In-vitro investigation of the effect ofprobiotics and prebiotics on selected human intestinal pathogens. FEMSMicrobiol. Ecol. 39: 67 – 75.

Gaggia, F., P. Mattarelli, dan B. Biavati. 2010. Probiotic and prebiotics inanimal feeding for safe food production. Intl. J. Food Microbiol. 14:515 – 528.

Gatesoupe, F. 1999. A Review: The Use of Probiotic in Aquaculture.Aquaculture 180:147-165

Gismondo, M.R., L. Drago, dan A. Lombardi. 1999. Review of ProbioticsAvailable to Modify Gastrointestinal Flora. Internasional Journal ofAntimicrobial Agents, 12: 287-292

Guarto dan E.A. Hendrajat. 2008. Budidaya Udang Vaname (Litopenaeusvannamei) pada Pola Semi Intensif dengan Applikasi Jenis ProbiotikKomersial. J. Ris. Akuakultur, 3(3):303-313.

Hadioetomo, R.S. 1985. Mikrobiologi. Gramedia. Jakarta.

Hala, Y. 1999. Penggunaan gen penanda molekular untuk deteksi pelekatan dankolonisasi vibrio harveyi pada larva udang windu (Penaeus monodon)[Disertasi]. Bogor. Institut Pertanian Bogor, Program Pascasarjana, 91hlm.

Hartley, B.S. 1960. Proteolytic enzymes. Annu Rev Biochem 29. 45-72.Inten, HN., Nengah IW., Mayun, LAAIA. 2015. Analisis PotensiProtease Ekstraselluler Tanah Hutan Mangrove Pantai Suwung KauhBali.Cakra Kimia. 3(2): 84-90.

Haryanti, S.K., S. Tsamura, dan T. Nishijima. 2000. Vibriostatic bacteriumisolated from seawater: Potentiality as probiotic agent in the rearing ofPenaeus monodon larvae. Ind. Fish. Res. J., 6: 26-32.

Hill, B.J. 2005. The Need for Effective Disease Control in InternationalAquaculture. Dev. Biol. (Basel) (121): 3–12

Irianto, A. 2003. Probiotik Akuakultur. Gadjah Mada University Press.Yogyakarta.

Jayani, R.S., S. Saxena, dan R. Gupta. 2005. Microbial pectinolyticenzymes: a review. Process Biochemistry, Vol.40, pp. 2931-2944

Kashyap, D.R., S. Chandra., A. Kaul, dan R. Tewari. 2000. Production,purification and characterization of pectinase from Bacillus sp. DT7.World journal of Microbiology and Biotechnology, Vol.16, pp. 277-282

51

Kristanti, N.D. 2001. Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Lipase Ekstraselulerdari Kapang Rhizopus oryzae TR 32. Tesis, Program Pascasarjana, IPB.Bogor

Kumar, D. dan T.C. Bhalla. 2004. Purification and Characterization of a SmallSize Protease from Bacillus sp. APR-4. Exp Biol 42: 515-517

Lehninger, A.L. 1990. Dasar – Dasar Biokimia Jilid 1. Terjemahan MaggyThenawidjaja. Jakarta : Penerbit Erlangga.

Lidya, B. dan N.S. Djenar. 2000. Dasar Bioproses. Direktorat Jendral|Pendidikan Tinggi DEPDIKNAS, Jakarta.

Mack, D.R., S. Michail., L. Wei., Mcdougall, dan M.A. Holingsworth. 1999.Probiotics inhibit enteropathogenic E. coli adherence in vitro inducingintestinal mucin gene expression. Amer. J. Physiol. 267(4 Pt 1): G941G950.

Mann, C.M. dan J.L. Markham .1998. A new method for determining theminimum inhibitory concentration of essential oils, Journal of AppliedMicrobiology, 84, 538-544.

Martoharsono, S. 1990. Biokimia Jilid I. UGM Press. Yogyakarta.

Marzuki, I. 2014. Enzim Struktur, Nomenklatur dan Mekanisme Kerja Enzim. UIPress. Jakarta.

Moriaty, D.J.W. 1998. Control of luminous Vibrio species in penaeidaquaculture ponds. Aquaculture,184:351-358.

Muliani, Nurbaya., A.Tompo, dan M. Atmomarsono.2004. Eksplorasi bakterifilosfer dari tanaman mangrove sebagai bakteri probiotik pada budidayaudang windu Penaeus monodon, J. Pen. Perik. Indonesia, 2: 47-57.

Muliani, S.A. dan Y. Hala. 2008. Isolasi dan karakterisasi bakteri asal lautSulawesi untuk biokontrol penyakit vibriosis pada larva udang windu(Penaeus monodon Fab.). J. Hayati, 10: 6-11.

Murray, J., B. Zhang., S.W. Taylor., D. Oglesbee., E. Fahy., M.F. Marusich.,S. S. Goshs, dan R.A. Capaldi. 2002. J Biol Chem 278, 13619-13622

Murdianto. 2015. Study on the effects of probiotic, Pediococcusacidilactici in thediet on some biological indices of Oscar astronautsocellatus.International Research Journal of Applied and Basic Sciences, 4 (11):3458-3464.

52

Novita, W., K. Arief., F.C. Nisa, dan U. Murdiyatmo. 2006. Karakterisasi ParsialEkstrak Kasar Enzim Protease dari Bacillus amyloliquefaciens NRRL B-14396, Jurnal Teknologi Pertanian, 7(2), 96-105.

Orten, J.M. dan O.W. Neuhaus. 1970. Biochemistry C. V. Mosby Company.Saint Louis. 430-435.

Page, D.S. 1989. Prinsip-Prinsip Biokimia. Erlangga. Jakarta.

Palmer, J.K. 1981. The Banana. Dalam: Hulme, A.C. (Ed). The Biochemistryof Fruits and Their Product. Vol 2. Academic Press London and NewYork.

Poedjiadi, A.F.M., dan T. Supriyantini. 2005. Dasar-dasar Biokimia.UI Press. Jakarta.

Poliana, J. dan A.P. MacCabe. 2007. Industrial Enzymes; Structure, Function,and Applications. Dordrecht: Springer. Halaman:174. ISBN 978-14020-53764

Purnobasuki, H. 2005. Tinjauan perspektif hutan mangrove. AirlanggaUniversity Press. Surabaya.

Rao, M.B., A.M. Tanksale., M.S. Ghatge dan V.V Deshpe. 1998. Molecular &Microbiology. UK. London.

Rajab, F. 2010. Isolasi dan seleksi bakteri probiotik dari lingkungan tambak danhatcheri untuk pengendalian penyakit vibriosis pada larva udang windu,Penaeus monodon. J. Ris. Akuakultur, 5: 103-113.

Rahayu, K. 2010. Teknologi Enzim. PAU Pangan dan Gizi UGM. Yogyakarta.

Rosa, D., T.I. Zafran, dan M.A. Girsang. 1997. Pengendalian Vibrio harveyisecara biologis pada larva udang windu (Penaeus monodon): I. IsolasiBakteri Penghambat. J. Penel. Perik. Indonesia, 3: 1-10.

Sakai, T., T. Sakamoto., J. Hallaert, dan E.J. Vandamme.1993. Pectin, pectinaseand protopectinase: production, properties and applications. Advances inApplied Microbiology, Vol.39, pp. 213-294

Salminen, S. dan A. Von-Wright. 1999. Lactic Acid Bacteria. New YorkMarcel Dekker.

Said, M.I. dan J.C. Likadja. 2012. Isolasi dan Identifikasi Bakteri yangBerpotensi sebagai Penghasil Enzim Protease pada Industri PenyamakanKulit Pt.

53

Saono, S.1976. Metabolisme dari Fermentasi. Ceramah Ilmiah ProceedingLokakarya Bahan Pangan Berprotein Tinggi. LKN-LIPI, Bandung.Hal 5-7.

Sariningsih, R. 2000. Produksi Enzim Protease Oleh Bacillus subtilis BAC-4.Skripsi. Universitas Padjajaran. Bandung.

Scopes, R.K. 1982. Protein Purification. Springer Verlag. New York.

Soedigdo, 1988. Studi Akivitas Enzim Lipase dari Aspergillus niger sebagaibiokatalis pada proses gliserolisis untuk menghasilkan momoasilgliserol.Thesis. Universitas Diponegoro.

Steer, T., H. Carpenter., K. Tuohy., G.R. Gibson, dan T.E. Steer. 2000.Perspectives on the role of the human gut microbiota and its modulationby pro- and prebiotics. Nutr. Res. Rev. 13: 229 – 254.

Suastika, I.B.M., A. Taslihan, dan N.H. Abidin. 1996. Penerapan TeknikProduksi dan Preservasi Bakteri Remediasi. Techner 27:12-14.

Subasinghe, R.2001. Aquaculture development, health and wealth. Inaquaculture in the third millennium. Technical proceedings of theconference on aquaculture in the third millennium (Subasinghe, R.P. et al.,eds). pp. 167-191. Bangkok and FAO, NACA.

Suhartono, M.T. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Departemen Pendidikan danKebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Antar UniversitasBioteknologi Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Suhartono, M.T., A. Suwanto, dan H. Widjaja. 1992. Diklat Struktur danBiokimiawi Protein. Penelitian Antar Universitas. IPB. Bogor.

Suwanto A. 1994. Pulsed-field gel electrophoresis: A revolution in microbialgenetic. Aspac. J. Mol. Biotechnol. 2:78-85.Dieffenbach dan Dveksler1995).

Tjahjadi M.R., S.L. Angka, dan A. Suwanto.1994. Isolation and evaluation ofmarine bacterial for biocontrol of luminous bacterial diseases in tigershrimp larvae (Penaeus monodon Fab ). Aspac J Mol Biol Biotechnol2:347-352.

Tsao. 1984. Alcohol from cellulose. Chemical Technology. 10(5): 315-319.

Vaseeharan, B. dan P. Ramasamy. 2003.Control of pathogenic Vibrio spp. ByBacillus subtilis BT23, a possible probiotic treatment for black tigershrimp Penaeus monodon. J. Microbiol 36 (2) 8-7

54

Verschuere, L., G. Rombaut., P. Sorgeloos, dan W. Verstraete. 2000. ProbioticBacteria as Bioloical Control Agents in Aquaculture. Microbial andMolecular Biol Rev 64: 655-671

Wahyuntari B. dan H.Hendrawati. 2012.Properties of an Extracellular Protease ofBacillus megaterium DSM 319 as Depilating Aid of Hides. MicrobiologyIndonesia 6(2). doi : 10.5454/mi.6.2.4.

Walsh,G. dan D.R. Headon. 1994. Immobilized Enzym. John Wiley and Sons Ltd.New York.

Wheeler, M.F. 1994.Mikrobiologi Dasar Jilid II. Terjemahan SoenartomoAdisoemarto. Penerbit Erlangga. Jakarta.

Whitaker, J.R. 1990. Microbial pectinolytic enzymes. Microbial enzymes andbiotechnology (2nd edition), W.M. Fogarty & C.T. Kelly, (Eds.), pp. 133176, Elsevier Science Ltd., ISBN: 1851664866, London, England.

Winarno, F. G. 1986. Enzim. Jakarta. Gramedia Pustaka Utama.

Wirahadikusuma, M. 2001. Biokimia Protein, Enzim dan Asam Nukleat.Bandung: ITB.

.Wolfe, S.L. 1993. Molecular and Cellular Biology. Wadsworth Publishing

Company. California.

Yahya, S. 2014. Bio-template Synthesis of SilikaRuthenium Catalyst ofBenzylation of Toluene. Journal of Physical Science. Vol. 24. No. 1.Pp. 29-35.

Yandri, T.S., H. Dian, dan H. Sutopo. 2007. The chemical modification ofprotease enzyme isolated from local bacteria isolate, Bacillus subtilisITBCCB148 with cyanuric chloride polyethylenglycol. Europ. J. Scien.Resea., 23: 177-186.

Yati, S.S. dan Sulistiani. 2014. Karakterisasi Protease Bacillus subtilis A1 InaccB398 yang Diisolasi Dari Terasi Samarinda. Berita Biologi 13 (2), 203211.

Yuniati, R., T.T. Nugroho, dan F. Puspita. 2015. Uji Aktivitas Enzim Proteasedari Isolat Bacillus sp Galur Lokal Riau. JOMP FMIPA. 1 :116-122.

PRODUKSI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE ISOLAT …digilib.unila.ac.id/32625/3/SKRIPSI TANPA BAB...

Documents

Transcript of PRODUKSI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE ISOLAT …digilib.unila.ac.id/32625/3/SKRIPSI TANPA BAB...