1

ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF LACTIC ACID BACTERIA FROM

ORANGUTAN’S (Pongo Pygmaeus) FECES AS PROBIOTICS CANDIDATE

Isma Prasthani H.P, Masdiana C. Padaga, Dyah A. Oktavianie

Program Studi Pendidikan Dokter Hewan Program Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya

Email : ismaprasthani@gmail.com;

ABSTRAK

Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, mengkarakterisasi dan mengetahui potensi probiotik

BAL pada feses orangutan (Pongo pygmaeus). Sampel feses diisolasi dari 3 orangutan berusia lebih

kurang 2 tahun yang diambil dari Taman Safari Indonesia II. Karakterisasi BAL berdasarkan sifat

fenotip dan profil protein menggunakan SDS-PAGE. Kemampuan BAL sebagai probiotik

berdasarkan ketahanan isolat pada kondisi saluran pencernaan menggunakan model cairan lambung

pH 2,5 dan cairan getah empedu (Oxgall 0,3%). Hasil isolasi feses orangutan ditemukan kisaran

jumlah BAL dengan rerata 5,09±1,74 107 cfu/ml yang ditumbuhkan secara aerobic dan 5,86±2,15x10

7

cfu/ml yang ditumbuhkan secara anaerobic. Dari 14 isolat BAL menunjukkan 2 isolat berbentuk

kokus dan 12 isolat berbentuk batang yang berhasil diisolasi dari feses orangutan. 14 isolat BAL hasil

karakterisasi fenotip berhasil dilakukan pendugaan isolat mendekati genus Lactobacillus sp,

Pedicoccus sp, Aerococcus sp dan Enterococcus sp. Berdasarkan hasil SDS-PAGE menunjukkan

sebagian besar isolat BAL memiliki pita protein fungsional yang sama dengan berat molekul 111,6

kDa dan 99,96 kDa yang diduga merupakan protein bile salt hidrolase dan pita protein dengan berat

molekul 33,25 kDa dan 31,47 kDa yang diduga merupakan protein bacteriocins. Hasil uji potensi

BAL sebagai kandidat probiotik menunjukkan bahwa 14 isolat BAL mempunyai kemampuan tumbuh

yang tinggi pada media asam (pH 2,5) dan garam empedu (Oxgall 0,3 %). Dapat disimpulkan bahwa

Isolat BAL hasil isolasi dari feses orangutan (Pongo pygmaeus) memiliki potensi untuk

dikembangkan sebagai probiotik.

Kata kunci : Orangutan, BAL, Karakterisasi, Probiotik

ABSTRACT

This study was aimed to isolate, characterize and discovered a potency of probiotics from

orangutan (Pongo pygmaeus) feces. Feces samples were used from 3 orangutans approximately 2

years old, which were taken from Taman Safari Indonesia II. LAB characterization based on

phenotype and protein profile was conducted by SDS-PAGE. Pottential assay of LAB as probiotic

candidate was discovered by isolates resistance in gastrointestinal with pH of gastric fluid was 2.5 and

bile fluid (Oxgall) was 0,3 %. The result of isolation LAB from orangutan feces was found LAB with

average 5.09 ± 1.74 107 cfu / ml in aerobic condition and 5.86 ± 2.15 x10

7 cfu / ml in anaerobic

condition. The results showed from 14 isolates of LAB there were 2 isolates with cocci form and 12

isolates with rods form. From phenotypic characterization of 14 LAB isolates can be predicted that

the isolates have similiarity with Lactobacillus sp, Pedicoccus sp, Aerococcus sp and Enterococcus

sp. Based on the results of SDS-PAGE, the majority of LAB isolates has a functional protein bands

with a molecular weight of 111.6 kDa and 99.96 kDa which suspected as bile salt hydrolase protein

and the protein bands with molecular weight 33.25 kDa and 31.47 kDa which suspected as

bacteriocins protein. The conclusion showed that the 14 LAB isolates from the orangutan (Pongo

pygmaeus) feces have a potency as a probiotic candidates.

Key words: Orangutan, LAB, Characterization, Probiotics

ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT

ASAL FESES ORANGUTAN (Pongo pygmaeus) SEBAGAI KANDIDAT PROBIOTIK

2

PENDAHULUAN

Pemanfaatan probiotik terbukti telah

meningkatkan kesehatan saluran pencernaan.

Sesuai yang disampaikan Schrezenmeir & de

Vrese (2008) bahwa probiotik merupakan

mikroorganisme hidup non patogen yang

berpengaruh positif bagi kesehatan hewan

dengan cara memperbaiki keseimbangan

mikroflora indigenous dalam saluran

pencernaan. Probiotik bermanfaat untuk

kesehatan antara lain: meningkatkan

ketahanan terhadap penyakit infeksi terutama

diare, menurunkan resiko lactose intolerance

dan meningkatkan sistem imunitas

(Roberfroid, 2000). Penelitian mengenai

bakteri asam laktat (BAL) yang berpotensi

probiotik untuk kesehatan telah banyak

dilakukan seperti pemanfaatan probiotik

dalam penanggulangan penyakit infeksi

saluran pencernaan (Laudanno, 2006;

Savadogo, 2006). Beberapa spesies BAL

yang umum digunakan sebagai probiotik

adalah lactobacillus, enterococcus dan

lactococcus (Gibson, 2000).

Orangutan merupakan satwa liar yang

rentan terserang penyakit infeksi saluran

pencernaan. Berdasarkan data yang diperoleh

dari Taman Safari tahun 2003-2004

penyakit yang sering menyerang orangutan

adalah diare yang merupakan tanda

terjadinya enteritis (Tilley & Smith, 1980;

Lestari, 2004). Data tersebut didukung oleh

studi yang dilakukan Minarwanto (2008)

bahwa kasus penyakit pada orangutan

sebagian besar berupa gangguan pencernaan

seperti enteritis, gastritis dan lactose

intolerance. Penggunaan bakteri probiotik

dari saluran pencernaan orangutan mampu

menurunkan resiko gangguan pencernaan

karena lebih mudah beradaptasi dengan

lingkungannya sehingga keseimbangan

mikroflora dengan cepat dapat diperoleh.

Penelitian terdahulu mengenai isolasi

dan karakterisasi BAL sebagai kandidat

probiotik telah dilakukan oleh Beasly, 2004;

Lengkey, 2009; Azhari, 2011 yang

melakukan isolasi, identifikasi dan

eksploitasi BAL dari mikrobiota manusia

daging ayam mentah dan minuman

tradisional yogurt.

Namun demikian, penelitian tentang

BAL pada wild animal terutama orangutan

untuk mendapat isolat indigenous belum

pernah dilakukan sebelumnya dan perlu

penelitian lebih lanjut agar BAL dapat

berperan sebagai probiotik. Oleh karena itu,

penelitian ini dilakukan untuk mengisolasi

dan mengkarakterisasi BAL serta

mengetahui potensi BAL sebagai kandidat

probiotik yang diisolasi dari feses orangutan

(Pongo pygmaeus).

MATERI DAN METODE PENELITIAN

Alat dan Bahan

Peralatan yang digunakan adalah

seperangkat alat steril pengambilan sampel,

glass ware, vortex (Maxi Mix II), Laminar

Air Flow (LAF) (Nuaire Labgard Class II),

inkubator (MMM Medcenter), mikroskop

cahaya (Olympus TL2), foto digital

mikroskopik (Olympus CX41), anerobic jar

(OXOID), spektrofotometer (Genesys 20),

sentrifugasi, Ultrasonic clearer (Branson

200), power pac basic (Bio-Rad), cetakan gel

20x16x1 cm3, elektroforesis chamber.

Sedangkan bahan-bahan yang digunakan

adalah Peptone (HIMEDIA REF RM 001-

500G), MRS Agar (De Man,Rogosa And

Sharpe 1.10660.0500), MRS broth (Merck),

beef ekstrak, Oksidase stick, OF Basal

medium (MERCK 1.10282), H2O2 3 %,

Oksidase kit, NaCl 6,5%, 10%, dan 18%,

pewarna gram, perwarna spora, cairan

empedu (Oxgall) 0,3%, HCl, NaOH, Gel

Polyacrylamide, inhibitor protease 1 mM

PSMF, cell-lytic B-II-Bactreial solution, 0,3

% Tris, 1,44% glycine, 0,1% SDS,

Coomassie blue R-250 (MP001), 50%

methanol, 10 % acetic acid, Page Ruler TM

Prestained Protein Ladder Plus (SM1811).

Prosedur Penelitian

Preparasi Sampel Feses

Penelitian ini menggunakan sampel

feses yang berasal dari tiga orangutan yang

berusia lebih kurang 2 tahun diambil dari

3

TSI II Prigen-Pasuruan. Pengambilan sampel

diambil dilakukan 2 kali ulangan dan sampel

yang diambil pada setiap ulangan dilakukan

duplo sebanyak 1 gram secara aseptis

menggunakan cotton swab yang dimasukan

kedalam botol sampel steril dan disimpan

pada suhu 5oC.

Isolasi Bakteri Asam Laktat

Isolasi bakteri dilakukan sesuai dengan

Standar Nasional Indonesia (SNI) ISO 6887-

1: 2012. Sampel feses yang telah dikoleksi

dilakukan pengenceran secara berseri (10-

1,10

-2, 10

-3, 10

-4,10

-5dan 10

-6) menggunakan

pepton water steril. Hasil pengenceran 10-2

,

10-4

, dan 10-6

ditanam menggunakan metode

pour plate pada media selektif MRS agar

(MRSA) (steril, diinkubasi secara anerobic

dalam 5% CO2 pada suhu 37°C selama 48

jam. Pemurnian bakteri dengan

menggunakan teknik penggoresan kuadran

pada media MRSA. Target pemurnian adalah

koloni yang memiliki morfologi koloni

berbeda, bersifat katalase negatif dan

termasuk kedalam bakteri Gram positif.

Selanjutnya, dipilih 3 jenis koloni dominan

untuk dilakukan karakterisasi koloni dan

bakteri. Setiap koloni dibuat triplo sehingga

diperoleh 54 isolat yang berasal dari

orangutan A, orangutan B dan orangutan C.

Karakterisasi Fenotip Bakteri Asam Laktat

Karakterisasi isolat BAL berpedoman

pada buku Cowan and Steel’s Manual for the

identification of medical bacteria (Barrow &

Feltham, 1993). Sifat morfologi yang diamati

meliputi morfologi koloni dan morfologi sel.

Pengamatan fisiologis yang meliputi

motilitas, uji kemampuan tumbuh pada suhu

15°C, 37°C, dan 45°C, pada MRS broth

dengan konsentrasi NaCl 6,5%, 10%, dan

18% Sedangkan karakterisasi secara

biokimiawi yang dilakukan antara lain : uji

katalase, oksidase, Indole, reduksi nitrat,

hidrolisis pati, oksidatif-fermentatif (OF) dan

uji fermentasi glukosa. Pendugaan isolat

BAL berdasarkan nilai uji similaritas yang

menggunakan metode UPGMA (Unwighted

pair group method using arithmetic

averages).

Uji Potensi Bakteri Asam Laktat sebagai

Kandidat Probiotik (Lin et al., 2006)

Uji potensi isolat BAL sebagai

probiotik meliputi uji ketahanan BAL

terhadap cairan asam lambung (pH 2,5) dan

uji ketahanan terhadap sekresi garam

empedu (Oxgall 0,3%) dengan menggunakan

media MRS broth dengan menginokulasi

isolat bakteri pada populasi awal minimal

108 cfu/ml kedalam media uji.

a) Uji ketahanan BAL terhadap asam

lambung

Isolat BAL diinokulasikan kedalam

medium selektif MRS broth yang

ditambahkan HCL 2 N sehingga pH

mencapai 2,5-3 (disesuaikan dengan pH

lambung). Selanjutnya isolat diinkubasi pada

suhu 37oC selama 3-4 jam. Pengamatan

pertumbuhan isolat dinyatakan dengan

tingkat kekeruhan menggunakan

spektrofotometer berdasarkan nilai OD

(optical dencity) pada λ= 660 nm dan

penanaman 1 ml isolat ke dalam media

MRSA dengan metode pourplate yang

kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama

24 jam. Intepretasi hasil positif akan terlihat

dengan peningkatan nilai OD dan

pertumbuhan isolat pada media MRSA

setelah inkubasi.

b) Uji ketahanan BAL terhadap garam

empedu

ketahanan BAL terhadap getah empedu

disesuaikan dengan kadar garam empedu

pada saluran pencernaan yaitu dengan

menggunakan oxgall sebanyak 0,3 % w/v

dalam media MRS broth dengan pH 7,2.

Pengujian pada konsentrasi garam empedu

0,3 % mengacu pada Marteu et al., (1997).

Kultur kerja isolat BAL diinokulasikan ke

dalam medium selektif MRS broth yang

ditambahkan garam empedu 0,3%.

Selanjutnya isolat diinkubasi pada suhu 37oC

selama 3-4 jam. Pengamatan pertumbuhan

isolat dinyatakan dengan tingkat kekeruhan

menggunakan spektrofotometer berdasarkan

nilai OD (optical dencity) pada λ= 660 nm

4

dan penanaman 1 ml isolat ke dalam media

MRSA dengan metode pourplate yang

kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama

24 jam. Intepretasi hasil yang menandakan

positif akan terlihat dengan peningkatan nilai

OD dan pertumbuhan isolat pada media

MRSA setelah inkubasi.

Analisa Profil Protein BAL menggunakan

SDS-PAGE (Ghazi et al., 2009)

Hanya 9 isolat representatif dipilih

berdasarkan nilai uji similaritas terdekat

untuk diketahui profil proteinnya. Preparasi

sampel protein menggunakan fresh culture

isolat BAL dalam media MRS broth yang

ditambahkan 5 ml phospat buffer 0,1 M

(pH7,4). Sel bakteri didapat setelah

dilakukan sentifugasi pada kecepatan 6000

rpm selama 15 menit. Sel bakteri

sebelumnya dilakukan sonifikasi selama 10

menit. Pellet ditambahkan etanol 96 %

dengan rasio (1:1) kemudian di inkubasi

pada suhu dingin -20oC selama 24 jam dan di

sentifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm

selama 10 menit. Pellet yang dihasilkan

selanjutnya di tambahkan Tris Hcl dengan

rasio (1:1). Protein marker yang digunakan

dalam penelitian ini PageRuler™ Prestained

Protein Ladder Plus (10 hingga 250 kDa).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Jumlah Bakteri Asam Laktat Pada Feses

Orangutan

Rerata jumlah BAL (cfu/ml) pada

sampel feses tiga orangutan usia lebih

kurang 2 tahun di TSI II dapat dilihat pada

Tabel 1 berikut ini :

Tabel 1. Rerata Jumlah BAL pada Feses Orangutan di TSI II

Kode Sampel Rerata Jumlah Koloni BAL

(107cfu/ml)*

Aerobic Anaerobic

A 3,20±1,33 3,47±1,68

B 6,82±1,11 7,67±1,28

C 5,25±0,11 6.45±0,41

Rerata 5,09±1,74 5,86±2,15

Pada penelitian ini BAL memiliki

jumlah yang cukup besar pada populasi

mikroflora dalam feses orangutan dapat

dilihat pada Tabel 1. Menurut Salminen

(1998) saluran pencernaan orangutan

diperkirakan mengandung flora normal

mencapai 1012

bakteri per gram isi saluran

cerna dan lebih kurang 500 spesies

merupakan BAL. Penelitian terdahulu pernah

dilakukan oleh Pertiwi (2008) yang berhasil

mengisolasi BAL dari feses tikus dengan

rerata jumlah BAL berkisar 9,12 x109

cfu/ml.

Berdasarkan Tabel 1. diketahui bahwa

sampel feses orangutan yang di inkubasi

secara anaerobic memiliki kisaran jumlah

BAL dengan rerata 5,86±2,15x107

cfu/ml.

Nilai ini lebih tinggi dibandingkan sampel

feses yang diinkubasi secara aerobic yang

memiliki kisaran jumlah BAL dengan rerata

5,09±1,74x107 cfu/ ml. Menurut Candra

(2006) BAL termasuk kedalam

mikroorganisme bersifat anaerob facultatif

yang menggunakan proses fermentasi

sebagai metabolisme utama dalam

menghasilkan energi, tergantung dari

ketersedian oksigen dalam lingkungan

pertumbuhannya. Pada Tabel 1. dapat dilihat

bahwa masing-masing individu orangutan

mempunyai rerata jumlah koloni BAL

berbeda. Perbedaan jumlah koloni BAL pada

saluran pencernaan orangutan dipengaruhi

oleh kapasitas fermentasi pada colon yang

memungkinkan bakteri probiotik

berkembangbiak dengan jumlah yang

berbeda. Menurut Freitas et al., (2003)

keseimbangan jumlah BAL yang ada di

saluran pencernaan sangat bergantung pada

kebiasaan makan dan kemampuan orangutan

5

untuk memfermentasi serat dalam jumlah yang signifikan.

Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat

Isolasi BAL asal feses orangutan

(Pongo pygmaeus) diperoleh 54 koloni

(Lampiran 5) setelah dilakukan pewarnaan

Gram dan Uji katalase di dapatkan 14 koloni

murni dipilih berdasarkan kemampuan tubuh

isolat dengan karakteristik yang disajikan

dalam Tabel 2.

Tabel 2. Karakterisasi Isolat BAL

Keterangan : O : Oksidatif; F: Fermentatif; (+): Reaksi positif; (-): Reaksi negatif.

Karakteristik

fenotipe

Kode Isolat

AA AF AG BD CI AJ AK AL BM BN BO CP CQ CR

Growth in air - + + - + + + + + + + + + +

Anaerobic + + + + + + + + + + + + + +

Suhu 370C + + + + + + + + + + + + + +

Suhu 450C + + + + + + + + + + + + + +

Suhu 150C + + + + + + + + + + + + + +

NaCl 6,5% + + + + + + + + + + + + + +

NaCl 10 % + + + + + + + + + + + + + +

NaCl 18 % + + + + + + + + + + + + + +

Oksidase - - - - - - - - - - - - - -

Katalase - - - - - - - - - - - - - -

Motilitas - - - - - - - - - - - - - -

Indole - - - - - - - - - - - - - -

Reduksi nitrat - - - - - - - - - - - - - -

Hidrolisis pati - - - - - - - - - - - - - -

O/F F F F F F F F F F F F F F F

Galaktosa - + - + - + + + - + + + + +

Glukosa + + + + + + - - - - - + + +

Xylose + - - - - + + + + + + + + +

Arabinos - - - - - - - - - - - - - -

Fruktosa - + - + - + - - - - - - - -

Laktosa + + + + + + + + + + + + + +

Maltose - + - + - + + + + + + + + +

Sukrosa - + - + - + + - - + + + + +

Manitol - - - - - + + + + - + + + +

Ribose - - - - - - - - - - - - - -

Pendugaan

Genus

Ped

icoccu

s sp

Lacto

bacillu

s sp

Lacto

bacillu

s sp

Lacto

bacillu

s sp

Lacto

bacillu

s sp

Lacto

bacillu

s sp

Lacto

bacillu

s sp

Lacto

bacillu

s sp

Entero

coccu

s sp\

Aero

coccu

s sp

ccus sp

p

Lacto

bacillu

s sp

Lacto

bacillu

s sp

Lacto

bacillu

s sp

Lacto

bacillu

s sp

Lacto

bacillu

s sp

6

Karakterisasi isolat berpedoman pada

buku Cowan and Steel Manual of The

Identification of Medical Bacteria. Hasil

karakterisasi isolat dapat dilakukan

Pendugaan isolat BAL mendekati genus

Lactobacillus sp, Pedicoccus sp, Aerococcus

sp dan Enterococcus sp berdasarkan nilai uji

similaritas masing-masing isolat yang

disajikan dalam bentuk fenogram untuk

mengetahui jarak kedekatan antar isolat BAL

hasil isolasi dengan isolat BAL acuan. Nilai

similaritas mendekati 1 menunjukan bahwa

ada kemungkinan isolat tersebut dari genus

dan spesies yang sama. Dari nilai similaritas

diperoleh 14 isolat BAL yang

dikelompokkan kedalam 5 kelompok bakteri

yang memiliki genus dan spesies berbeda

seperti pada Tabel 3.

Tabel 3. Pengelompokan dugaan isolat BAL hasil karakterisasi berdasarkan nilai uji

similaritas dengan isolat acuan (Lactobacillus sp, Pedicoccus spp,

Aerococcus spp dan Enterococcus spp)

Kode

Isolat

Sumber Isolat Nilai

similaritas

Dugaan isolat

CP Orangutan C 0,919 Lactobacillus casei /plantarum

CQ Orangutan C 0,919 Lactobacillus casei /plantarum

CR Orangutan C 0,919 Lactobacillus casei /plantarum

BO Orangutan B 1,000 Lactobacillus casei /plantarum

AL Orangutan A 0,919 Lactobacillus casei/plantarum

AK Orangutan A 0,919 Lactobacillus casei/plantarum AJ Orangutan A 1,000 Lactobacillus casei/plantarum

BN Orangutan B 1,000 Lactobacillus acidophilus

AF Orangutan A 0,944 Lactobacillus acidophilus

BD Orangutan B 0,933 Lactobacillus delbrueckii /brevis

AG Orangutan A 0,741 Lactobacillus delbrueckii /brevis

CI Orangutan C 0,741 Lactobacillus delbrueckii /brevis

AA Orangutan A 0,730 Pedicoccus sp

BM Orangutan B 0,740 Aerococcus sp /Enterococcus sp

Berdasarkan Tabel 3 isolat BAL yang

terkoleksi dapat dikelompokkan menjadi 5

kelompok isolat BAL yang mempunyai

genus dan spesies yang berbeda. Kelompok

satu terdiri dari isolat CP, CR, CQ, BO, AL,

AK dan AJ yang memiliki karakteristik

mendekati spesies Lactobacillus casei dan

Lactobacillus plantarum. Kelompok dua

terdiri dari isolat BN dan AF yang memiliki

karakteristik mendekati spesies Lactobacillus

acidophilus. Kelompok tiga terdiri dari isolat

BD, AG dan CI yang memiliki karakteristik

mendekati spesies Lactobacillus delbrueckii

dan Lactobacillus brevis. Kelompok empat,

isolat AA yang memiliki karakteristik

mendekati genus Pedicoccus sp. Kelompok

lima, isolat BM yang memiliki karakteristik

mendekati genus Aerococcus sp dan

Enterococcus sp. Hasil karakterisasi isolat

BAL asal feses orangutan didominasi oleh

genus Lactobacillus sp. Menurut pendapat

Dibner & Richard (2005); Carol et al.,

(2011) bahwa koloni BAL genus

Lactobacillus banyak ditemukan pada

saluran pencernaan hewan.

Uji Potensi BAL sebagai Kandidat

Probiotik

Kondisi yang kritikal bagi BAL

pertama kali pada saat bakteri memasuki

saluran pencernaan, yakni terpapar pada

cairan asam lambung dan cairan garam

empedu yang ada di usus. Menurut Havenaar

et al., (1992) untuk mengembangkan galur

probiotik baru perlu dilakukan seleksi secara

7

in vitro yang meliputi sensitivitas ketahanan

terhadap cairan asam lambung (pH 2,5) dan

cairan garam empedu (Oxgall 0,3 %). Data

hasil ketahanan isolat terhadap asam

lambung dan cairan garam empedu dapat

dilihat pada Tabel 4.

Tabel 4. Kemampuan hidup isolat BAL pada pH 2,5 dan Oxgall 0,3 % diukur

menggunakan spektrofotometer λ= 660nm dengan satuan Optical density

(OD)

Kode

Isolat

Nilai Optical dencity (OD) isolat pada jam ke-

pH 2,5 Oxgall 0,3 %

t0 t4 t0 t4

AA 0,444 0,569 0,404 0,888

BD 0,439 0,546 0,402 0,678

AF 0,369 0,383 0,316 0,510

AG 0,521 0,677 0,521 0,874

CI 0,464 0,588 0,441 0,870

AJ 0,504 0,529 0,457 0,696

AK 0,428 0,508 0,365 0,482

AL 0.490 0,538 0,435 0,658

BM 0,476 0,539 0,414 0,678

BN 0,459 0,501 0,499 0,660

BO 0,537 0,618 0,497 0,949

CP 0,401 0,575 0,491 0,722

CQ 0,501 0,593 0,504 0,865

CR 0,455 0,567 0,438 0,714

Keterangan : t0 : sebelum inkubasi; t4: setelah 4 jam inkubasi

Hasil kemampuan tumbuh isolat BAL

menunjukkan bahwa terdapat peningkatan

nilai OD dari sebelum inkubasi (t0) dan

setelah inkubasi (t4). Peningkatan nilai OD

menunjukkan isolat BAL yang diisolasi dari

feses orangutan mempunyai ketahanan cukup

tinggi terhadap cairan asam lambung dan

garam empedu.

Isolat CP merupakan isolat BAL

berbentuk batang yang memiliki ketahanan

terhadap cairan asam lambung (pH 2,5)

paling tinggi diantara isolat yang berbentuk

batang. Isolat AA merupakan isolat BAL

berbentuk kokus memiliki ketahanan

terhadap cairan asam lambung (pH 2,5)

paling tinggi diantara isolat yang berbentuk

kokus. Hal ini menunjukkkan bahwa Isolat

BAL yang di uji mampu melewati saluran

lambung yang bersifat asam. Isolat BAL

mempunyai ketahanan untuk beradaptasi

pada cairan asam lambung (pH 2,5) karena

kemampuannya dalam mempertahankan pH

sitoplasma melalui translokasi protein yang

dibantu oleh enzim. Enzim-enzim yang

berperan dalam ketahanan BAL terhadap

cairan asam lambung (pH 2,5) adalah enzim

histidin dekarboksilase, enzim arginin

deiminase dan enzim protease (De Angelis

et al., 2002; Casiano-Colon & Marquis

1998).

Isolat AA merupakan isolat BAL

berbentuk kokus memiliki ketahanan

terhadap cairan garam empedu (Oxgall 0,3

%) paling tinggi diantara isolat yang

berbentuk kokus. Isolat BO merupakan isolat

BAL berbentuk batang memiliki ketahanan

terhadap cairan garam empedu (Oxgall 0,3

%) paling tinggi diantara isolat yang

berbentuk batang. Hal ini menunjukkkan

8

bahwa Isolat BAL yang di uji mampu

melewati saluran pencernaan terutama usus

tempat disekresikannya cairan garam

empedu. Hasil penelitian terdahulu

(Kusumawati, 2002; Ngatriah et al., 2000;

Wijayanto, 2009) menunjukan bahwa BAL

memiliki ketahanan terhadap cairan garam

empedu yang beragam. Menurut Smet et al.,

(1995) beberapa jenis BAL memiliki enzim

bile salt hydrolase dengan aktivitas untuk

menghidrolisis garam empedu yang mampu

mengubah kemampuan fisik dari kimia

garam empedu sehingga tidak bersifat racun

bagi BAL. Hal ini yang menyebabkan isolat

BAL mempu bertahan pada kondisi kritikal

ketika terpapar pada cairan garam empedu

yang ada di usus.

Penanaman pada media MRSA

merupakan pengujian tahap lanjut terhadap

isolat BAL yang terlebih dahulu telah

ditumbuhkan pada pH 2,5 dan Oxgall 0,3 %.

Hasil pengamatan menunjukkan bahwa isolat

BAL mampu tumbuh dengan baik setelah

diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam

(Gambar 1).

Gambar 1. Isolat BAL yang mempunyai kemampuan tumbuh paling tinggi pada media

MRSA setelah ditumbuhkan pada pH 2,5 dan Oxgall 0,3 %.

Menurut Zavaglia et al., (1998) dan

Jacobsen et al., (1999), bakteri yang berhasil

hidup setelah ditumbuhkan dalam media

selektif MRS yang ditambahkan oxgall 0,3

% dan pH asam dinyatakan bersifat tahan

terhadap garam empedu dan tahan terhadap

asam lambung.

Analisa Profil Protein BAL

Analisa profil protein isolat akan

mendukung dari hasil karakterisasi isolat

BAL. Sesuai dengan pendapat Ghazi et al.,

(2009) yang menyatakan metode analisa

SDS-PAGE dengan ekspresi profil protein

yang berbeda dapat digunakan untuk

mendukung hasil karakteristik fenotip isolat

BAL. Dari hasil running dengan

elektroforesis menggunakan acuan protein

marker PageRuler™ Prestained Protein

Ladder Plus (10 hingga 250 kDa) dapat

terdeteksi berat molekul isolat BAL dengan

kisaran 12, 34 kDa hingga 155,26 kDa, berat

molekul protein dan jumlah pita masing-

masing isolat BAL dapat dilihat pada

(Gambar 2).

9

Gambar 2. Profil Pita Protein Isolat BAL berdasarkan kelompok

Keterangan :

Dari hasil SDS-PAGE dapat dilihat

karakteristik profil pita protein masing-

masing isolat yang memperlihatkan jumlah

profil pita protein yang terdeteksi beserta

berat molekul protein terdeteksi. Isolat CR,

AJ dan BO memiliki karakteristik yang sama

ditunjukkan dengan adanya profil pita

protein dengan berat molekul 64,36 kDa

yang dimiliki ketiga isolat tersebut, antara AJ

dan BO memiliki kemiripan karakteristik

yang lebih tinggi dengan adanya 3 pita

protein yang sama dengan berat molekul

berturut-turut 111,6 kDa, 71,85kDa dan

64,36 kDa. Isolat BN dan AF memiliki

karakteristik sama ditunjukkan dengan pita

protein yang memiliki berat molekul sama

yakni 64,36 kDa. Selain itu, isolat AG dan

BD memiliki tingkat kemiripan karakteristik

yang tinggi ditunjukkan dengan banyaknya

pita protein yang sama dengan berat molekul

111,6 kDa, 94,6 kDa, 71,8 kDa dan 20,2

kDa. Sesuai Tabel 5.6 hasil karakterisasi

pita protein Isolat AA dan BM mampu

terdeteksi berturut-turut sebanyak 17 dan 7

pita protein. Hal tersebut sesuai dengan

karakteristik fenotip isolat BAL yang

mengkelompokan isolat BAL kedalam genus

yang sama. Hasil penelitian ini didukung

oleh Sanchez et al., 2003; Ghazi et al., 2009

yang menyebutkan adanya profil protein

yang terlihat pada karakterisasi profil protein

menggunakan SDS-PAGE akan mendukung

hasil karakterisasi fenotip isolat.

Bakteri asam laktat mempunyai profil

protein yang menunjukkan protein

fungsional. Hasil analisa profil protein

terlihat adanya kesamaan beberapa profil

protein dari sebagian besar isolat BAL (AJ,

BO, BN, AG, BD, AA dan BM) dengan

berat molekul 111,6 kDa dan 99,96 kDa

yang diduga protein tersebut merupakan

protein fungsional yang dimiliki oleh

sebagian besar isolat BAL. Profil protein

yang menunjukkan berat molekul 111,6 kDa

K(1): kelompok isolat bakteri 1

K(2): kelompok isolat bakteri 2

K(3): kelompok isolat bakteri 3

K(4): kelompok isolat bakteri 4

K(5): kelompok isolat bakteri 5

K (1) K (2) K (3) K (4) K (5) Marker

10

dan 99,96 kDa diduga jenis protein bile salt

hidrolase (BSH) yang dimiliki oleh BAL.

Hasil tersebut didukung oleh penelitian yang

dilakukan Lundeen & Savage (1992) berhasil

mendeteksi berat molekul protein BSH dari

Lactobacillus.sp dengan kisaran berat

molekul 80,00 sampai 115,00 kDa. Bile salt

hidrolase adalah enzim untuk menghidrolisis

garam empedu yang mampu mengubah

kemampuan fisik dari kimia garam empedu

sehingga tidak bersifat racun bagi BAL dan

menyebabkan BAL mampu tahan terhadap

garam empedu. Hal ini mendukung hasil uji

potensi BAL sebagai probiotik yang

ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan

isolat BAL pada media yang telah

ditambahkan Oxgall 0,3 %. Pada isolat BAL

(AJ, BD, AG dan BO) mempunyai profil

protein dengan berat molekul berturut-turut

33,25 kDa dan 31,47 kDa yang diduga

merupakan berat molekul dari protein

bacteriocins. Profil protein yang

menunjukkan berat molekul 33,25 kDa dan

31,47 kDa diduga jenis protein bacteriocins

yang dimiliki oleh BAL. Hasil tersebut

didukung oleh penelitian yang dilakukan

Drider et al., (2006) telah berhasil

mengindentifikasi protein bacteriocins yang

memiliki berat molekul berkisar > 30 kDa

pada BAL. Bacteriocins merupakan salah

satu senyawa antimikroba yang dihasilkan

oleh BAL. Dari hasil running elektroforesis

telah terdeteksi pita-pita protein lain yang

belum diketahui jenis proteinnya, hal ini

dikarenakan hasil ekstraksi yang digunakan

adalah crude protein sehingga diperlukan

penelitian lebih lanjut untuk purifikasi dan

identifikasi protein lain terutama yang

ditemukan pada beberapa isolat BAL.

KESIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian maka

disimpulkan bahwa dari hasil isolasi BAL

asal feses orangutan didapatkan 14 isolat

BAL dengan rerata jumlah bakteri 5,09±1,74

107

cfu/ml yang ditumbuhkan secara aerobic

dan 5,86±2,15x107

cfu/ml yang ditumbuhkan

secara anaerobic. Bakteri asam laktat hasil

isolasi feses orangutan memiliki karakteristik

fenotip mendekati genus Lactobacillus sp,

Pedicoccus sp, Aerococcus sp Enterococcus

sp. Bakteri asam laktat hasil isolasi feses

orangutan memiliki karakteristik profil

protein yang sama dan mempunyai pita

protein yang menunnjukkan protein

fungsional BAL sebagai probiotik. Isolat

BAL hasil isolasi feses orangutan diketahui

mempunyai potensi tinggi sebagai probiotik

yang ditunjukkan dengan kemampuan

tumbuh yang cukup tinggi pada media yang

ditambahkan cairan asam lambung (pH 2,5)

dan cairan garam empedu (Oxgall 0,3 %).

UCAPAN TERIMA KASIH

Terima kasih kepada direktorat

jenderal DIKTI yang telah memberikan

pembiayaan penelitian ini sehingga

penelitian ini mampu selesai sesuai dengan

yang diharapkan. Terima kasih kepada pihak

Taman Safari Indonesia II yang telah

membantu dalam penyediaan sampel feses

orangutan. Terima kasih kepada

Laboratorium Sentral Ilmu Hayati dan

Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam Universitas Brawijaya

yang telah menjadi tempat penelitian. Terima

kasih kepada dosen pembimbing serta rekan-

rekan peneliti atas dukungan serta bantuan

dalam kerjasama yang baik untuk

penyelesaian penelitian ini.

DAFTAR PUSTAKA

Anonimus. 2012. Standar Nasional Indonesia

(SNI) ISO 6887-1: 2012. 2012.

Penyiapan Contoh Uji, Suspensi Awal,

Dan Pengenceran Awal Untuk

Pengujian Mikrobiologi. Badan

Standarisasi Nasional Indonesia.

Azhari, Asmahan. 2011. Isolation and

Identification of LAB Isolated from

Traditional Drinking Yoghurt in

Khartoum State, Sudan. Current

Research in Bacteriology 4(1) :16-22.

Barrow, G.I. and R. Feltham. 1993. Cowan

and Steel’s Manual for

11

the identification of medical bacteria. 3rd

ed. Cambridge University Press: Great

Britain.

Beasley, Shea. 2004. Isolation, Identification

and Exploitation of LAB from Human

and Animal Microbiota. Academic

Dissertation in Microbiology, Faculty of

Agriculture and Forestry and Viikki

Graduate School in Biosciences

University of Helsinki.Finland.

Candra, Joddi. 2006. Isolasi dan

Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari

Produk Bekasam Ikan Bandeng (Chanos

Chanos). [Skripsi]. Fakultas Perikanan

dan Ilmu Kelautan. Institu Pertanian

Bogor.

Carol, A., V. Reene., and L.M.T. Dicks.

2011. Horizontal Gene Transfer

Amongst Probiotic Lactic Acid Bacteria

and Other Intestinal Microbiota: What

Are The Possibilities?. Arch Microbiol.

193:157-168.

Casiano-Colón A, and R.E. Marquis. 1998.

Role of The Arginine Deiminase System

In Protecting Oral Bacteria and An

Enzymatic Basis for Acid Tolerance.

Appl Environ Microbiol. 54(6):1318–

1324.

De Angelis, M., L. Mariotti., J. Rossi., M.

Servili., P. F. Fox.,G. Rollan and

M.Gobbetti. 2002. Arginine Catabolism

By Sourdough Lactic Acid Bacteria:

Purification And Characterization Of

The Arginine Deiminase Pathway

Enzymes From Lactobacillus

Sanfranciscensis CB1. Applied And

Environmental Microbiology 68(12):

6193-6201.

Dibner, J.J. and J.D. Richards. 2005.

Antibiotic growth promoters in

agriculture: History and mode of action.

Poul. Sci. 84: 634–643.

Drider, D., G. Fimlan., Y. Hechard., L. M.

McMullen and H. Prevost. 2006. The

Continuing Story of Class IIa

Bacteriocins. Microbiol Mol Biol Rev

70: 564–582.

Freitas, M., E. Tavan., C. Cayuela., L. Diop.,

C. Sapin and G. Trugnan. 2003. Host-

Pathogens Cross-Talk. Indigenous

Bacteria and Probiotics Also Play The

Game. Biology of the Cell 95 : 503–506.

Ghazi, F., D. E. Henni., Z. Benmechernene

and M. Kihal. 2009. Phenotypic and

Whole Cell Protein Analysis by SDS-

PAGE for Identification of Dominants

Lactic Acid Bacteria Isolated from

Algerian Raw Milk. World Journal of

Dairy & Food Sciences 4 (1) : 78-87.

Havenaar, R and J.H.J. Huis in’t Veld. 1992.

Selection of Strains for Probiotic Use.

Dalam: Fuller, R. (ed.). Probiotics : The

Scientific Basic. London.209-224.

Jacobsen, C.N., V.R. Nielsen., A.E.

Hayford., P.L. Moller., K.F.

Michaelsen., A.P. Erregard., B.

Sandstrom., M. Tvede and M. Jakobsen.

1999. Screening of Probiotic Activities

of Forty Seven Strains of Lactobacillus

spp. by In Vitro Techniques and

Evaluation of The Colonization Ability

of Five Selected Strains in Human. Appl.

Environ. Microbiol. 65 : 4949-4956.

Kusumawati, N. 2002. Seleksi Bakteri Asam

Laktat Indigenus sebagai Galur

Probiotik dengan Kemampuan

Mempertahankan Keseimbangan

Mikroflora Usus Feses dan Mereduksi

Kolesterol Serum Darah Tikus. [Tesis].

Program Studi Ilmu Pangan. Institut

Pertanian Bogor.

Laudanno, O. M., L. Vasconcelos., J.

Catalana and J.A. Cesolari. 2006.

Anti-Inflammatory Effect of Bioflora

Probiotic Administered Orally or

12

Subcutaneously with Live or Dead

Bacteria. Dig Dis Sci 51: 2180–2183

Lengkey, H.A.W., R. L. Balia., I. Togoe., B.

A. Tasbac and M. Ludog. 2009.

Isolation and Identification of Lactic

Acid Bacteria from Raw Poultry Meat.

Biotechnology in Animal Husbandry 25

(5-6): 1071-1077.

Lestari, R. 2004. Pengaruh umur, Pakan,

dan Kesehatan Terhadap

Kerontokan Bulu Orangutan

(Pongo pygmaeus) di Taman Safari

Cisarua Bogor. [Skripsi]. Fakultas

Kedokteran Hewan. Institut

Pertanian Bogor.

Lin W. H., C. F. Hwang, L. W. Chen and H.

Y. Tsen. 2006. Viable Counts,

Characteristic Evaluation for

Commercial Lactic Acid Bacteria

Products. J. Food Microbiol. 23: 74-81.

Lundeen, S.G and D. C. Savage. 1992.

Multiple Forms of Bile Salt Hydrolase

from Lactobacillus sp. Strain 100-100.

Journal of Bacreriology. 174(22): 7217-

7220.

Minarwanto, Hendra. 2008. Studi Aktivitas

Harian Orangutan (Pongo pygmaeus

wurmbii, Grove, 2001) Di Orangutan

Care Center And Quarantine Pangkalan

Bun, Kalimantan Tengah. [skripsi].

Fakultas Kehutanan. Institu Pertanian

Bogor.

Ngatirah, A., E. S. Harmayanti dan T. Utami.

2000. Seleksi Bakteri Asam Laktat

Sebagai Agensia Probiotik yang

Berpotensi Menurunkan Kolesterol.

Prosiding Seminar Nasional Industri

Pangan. PATPI (II) : 63-70.

Pertiwi, Widimartani. A. 2008. Profil

Mikroflora Feses Dan Usus Tikus Putih

(Rattus Norvegicus) Dengan Konsumsi

Daging Yang Difermentasi Oleh

Lactobacillus Plantarum.[Skripsi].

Fakultas Peternakan. Institut Pertanian

Bogor.

Salminen, S and A. V. Wright. 1998. Lactic

Acid Bacteria: Microbiology and

Functional Aspecs 2 nd

ed. Marcel

Dekker, Inc. New York.

Sanchez, I., S. Sesena and L. Palop. 2003.

Identification of lactic acid bacteria from

spontaneous fermentation of ‘Almagro’

eggplant by SDS-PAGE whole cell

protein fingerprinting. Int. J. Food

Microbiol. 2555: 181-189.

Savadogo, A., C. Ouattara., I. Bassol and S.

Traore. 2006. Review Bacteriocins

and lactic acid bacteria. African

Journal of Biotechnology 5 (9):

678-683

Schrezenmeir, J. M. and de Vrese . 2008.

Probiotics, Prebiotics, and Synbiotics.

Adv Biochem Engin/Biotechnol (111):

1–66.

Smet, I.D., L. van Hoorde, M.V. Woestyne,

H. Christiaens and W. Verstraete. 1995.

Significance of Bile Salt Hydrolytic

Activities of Lactobacilli. J. Appl.

Bacteriol. 79 : 292-301.

Tilley, L and P. Smith.1980.The 5-minute

veterinary Consult.

Wijayanto, Umar. 2009. Analisis In Vitro

Toleransi Isolat Bakteri Asam Laktat

Asal Daging Sapi Terhadap pH

Lambung, pH Usus dan Garam Empedu

sebagai Kandidat Probiotik. [Skripsi].

Fakultas Peternakan. Institut Pertanian

Bogor.

Zavaglia, A. G., G. Kociubinski, P. Perez

and G. De Antoni. 1998. Isolation and

Characterization of Bifidobacterium

Strains for Probiotic Formulation. J.

Food Protect. 61(7) : 865-873.

13