17 

 

METODE

Lokasi dan Waktu

Penelitian dilakukan di Laboratorium Pengolahan Susu, Laboratorium

Mikrobiologi Hasil Ternak bagian Teknologi Hasil Ternak Fakultas Peternakan IPB

dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran UI. Penelitian dilakukan pada

bulan Pebruari - September 2011.

Materi

Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah susu sapi skim untuk

media pertumbuhan kultur starter. Susu kuda segar untuk adaptasi kultur campuran

dan pembuatan koumiss berasal dari peternakan kuda perah Cikampak. Kultur

bakteri asam laktat Lb. acidophilus Y-01, Lc. lactis ssp. lactis D-01 dan khamir Sc.

cereviceae merupakan koleksi Laboratorium Mikrobiologi Teknologi Hasil Ternak

Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor. Kultur bakteri patogen S.

Typhimurium ATCC 14028 dan M. tuberculosis H37RV merupakan koleksi

Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.

Media tumbuh yang digunakan adalah de Man’s Rogosa Sharpe Broth

(MRSB) untuk Lb. acidophilus, Lc. lactis ssp. lactis dan de Man’s Rogosa Sharpe

Agar (MRSA) untuk pengujian bakteri asam laktat; Nutrien Broth (NB) dan Potato

Dextrose Agar (PDA) sebagai media tumbuh Sc. cereviceae; Plate Count Agar

(PCA) untuk penghitungan jumlah mikroorganisme; Violet Red Bile Agar (VRBA)

untuk pengujian koliform; media tumbuh Lowenstein Jensen untuk M. tuberculosis

H37RV; media Nutrien Agar (NA) untuk S. Typhimurium ATCC 14028 dan Mueller

Hinton Agar (MHA) sebagai media konfrontasi produk koumiss terhadap

S. Typhimurium ATCC 14028. Bahan kimia yang digunakan adalah NaCl fisiologis

0,85%; alkohol 70%, safranin, kristal violet, asam alkohol, methylen blue, karbol

fuchsin dan spiritus.

Alat-alat yang digunakan untuk penumbuhan, perbanyakan dan pembuatan

media tumbuh kultur starter dan bakteri patogen adalah tabung reaksi, rak tabung

reaksi, inkubator, lemari es, mikroskop, cawan petri, pipet satu ml, heater-magnetic

stirrer, pembakar bunsen dan autoclave. Alat untuk pembuatan koumiss yaitu botol

steril, pengaduk kayu, termometer, gelas liter, gelas ukur, panci double plate dan

kompor gas; sedangkan untuk pengujian daya hambat antimikroba koumiss dengan

 

 

18 

 

S. Typhimurium ATCC 14028 dan M. tuberculosis H37RV menggunakan alat pipet

volumetrik, pipet man, tabung ulir kecil, tabung reaksi kecil, cawan Petri, jarum Ose,  

vortex-mixer, tabung berdiameter lima mm (corke borer), glass beed, nevlometer dan

jangka sorong.

Prosedur Penelitian

Penelitian terdiri atas beberapa tahap meliputi perbanyakan kultur, pembuatan

starter induk serta persiapan dan perbanyakan kultur uji bakteri patogen. Tahap

selanjutnya adalah pengujian kualitas mikrobiologi susu kuda, pembuatan koumiss

dan pengujian aktivitas daya hambat antimikroba koumiss pada bakteri S.

Typhimurium ATCC 14028 dan M. tuberculosis H37RV. Diagram alir penelitian

disajikan pada Gambar 6.

Persiapan Kultur Bakteri

Kultur bakteri koleksi yang digunakan adalah Lc. lactis D-01, Lb. acidophilus

Y-01, dan Sc. cereviceae, serta bakteri patogen S. Typhimurium ATCC 14028 dan

M. tuberculosis H37RV. Pemeriksaan morfologi dan sifat katalase untuk

mengetahui karakteristik kultur bakteri termasuk ke dalam persiapan kultur bakteri.

Pengujian morfologi starter dengan bantuan pewarnaan Gram untuk bakteri asam

laktat Lc. lactis D-01, Lb. acidophilus Y-01, khamir Sc. cereviceae dan bakteri

patogen S. Typhimurium ATCC 14028 dan pewarnaan Ziehl-Neelsen untuk

M. tuberculosis H37RV. Pengujian pewarnaan Gram mengacu pada Fitria (2009)

meliputi tahapan sebagai berikut: kultur bakteri dioleskan pada gelas obyek dengan

jarum Ose, kemudian kultur ditetesi kristal violet dan dibiarkan selama satu menit.

Preparat kemudian dibilas dengan akuades dan dikeringudarakan. Preparat yang

sudah kering ditetesi larutan lugol iodin dan didiamkan selama satu menit, kemudian

dibilas kembali dengan akuades. Preparat kemudian dikeringudarakan, selanjutnya

ditetesi dengan alkohol 95% sebagai bahan pemucat selama sekitar lima detik.

Preparat dibilas kembali dengan akuades dan dikeringudarakan. Pewarnaan terakhir

menggunakan safranin selama 30 detik dan dibilas kembali dengan akuades, lalu

preparat dikeringudarakan. Bakteri yang telah diwarnai diperiksa di bawah

mikroskop pada perbesaran 10 x 100.

Bakteri dikelompokkan menjadi bakteri Gram positif, bila dapat

mempertahankan zat warna ungu kristal dan tampak berwarna ungu tua. Kelompok

 

 

19 

 

bakteri Gram negatif akan terlihat berwarna merah, karena pada saat pencucian

dengan alkohol tidak dapat mempertahankan warna ungu yang berasal dari kristal

violet sehingga sewaktu pemberian pewarna tandingan dengan warna merah safranin,

bakteri akan menyerap warna tersebut dan mengakibatkan tampak berwarna merah.

Pewarnaan Ziehl-Neelsen diawali dengan pembuatan smear lonjong pada

gelas objek dengan diameter lebar dua cm dan panjang tiga cm, lalu difiksasi di atas

api bunsen hingga kering. Karbol fuchsin diteteskan, lalu dibakar dengan api bunsen

Persiapan kultur BAL dan khamir

Perbanyakan kultur

Pembuatan kultur starter

Lc. lactis D-01 Lb.acidophilus Y-01 Sc. cereviceae

Pewarnaan Gram

Pengujian sifat katalase

Persiapan media tumbuh dan inokulasi kultur

Kultur induk (mother starter) Feeder starter Kultur kerja (bulk starter)

Pemeriksaan viabilitas

Pembuatan starter koumiss

Susu skim

Susu kuda

Pembuatan koumiss Penyimpanan 0, 2, 4, 6, dan 8 hari

Pengujian karakteristik koumiss

Total Asam Tertitrasi (TAT)

TPC Koliform BAL Khamir

Pengujian daya hambat koumiss terhadap bakteri

patogen

S. Typhimurium ATCC 14028

M. tuberculosis H37RV

Gambar 6. Diagram Alir Penelitian

Persiapan kultur bakteri patogen

S. Typhimurium 14028 M. tuberculosis H37RV

Pewarnaan Gram

Pewarnaan Ziehl Neelsen

 

 

20 

 

dan didiamkan selama lima menit. Setelah itu dibilas dengan air, selanjutnya ditetesi

decolorizer berupa asam alkohol dan didiamkan selama 10-15 detik, kemudian

dibilas kembali. Larutan ketiga berupa methylen blue diteteskan dan didiamkan

selama 10-20 detik lalu dibilas dengan air mengalir dan didiamkan hingga preparat

kering. Identifikasi menggunakan mikroskop pada perbesaran 10 x100 (WHO,

1998).

Pengujian sifat katalase dilakukan dengan pengambilan satu Ose bakteri,

kemudian dioleskan pada gelas objek, selanjutnya ditetesi dengan satu tetes H2O2.

Apabila dihasilkan gelembung-gelembung gas O2, maka bakteri yang diperiksa

diklasifikasikan ke dalam kelompok bakteri katalase positif, sebaliknya apabila tidak

ditemukan gelembung gas, maka bakteri tersebut diklasifikasikan ke dalam

kelompok bakteri katalase negatif (Pelczar dan Chan, 2007).

Perbanyakan Kultur

Persiapan Media Tumbuh. Media tumbuh untuk masing-masing mikroflora

penyusun starter koumiss disiapkan sebelum melakukan perbanyakan kultur. Media

tumbuh untuk Lc. lactis ssp. lactis, Lb. acidophilus berupa de Man’s Rogosa Sharpe

Broth (MRSB) disiapkan, pada suhu inkubasi 37 oC. Media tumbuh untuk Sc.

cereviceae berupa Nutrien Broth pada suhu inkubasi 25 oC.

Inokulasi Kultur. Perbanyakan kultur dilakukan dengan cara penyegaran kultur

bakteri sebanyak 5% di dalam media yang sesuai dan diinkubasi pada suhu optimal

yang sesuai untuk masing-masing pertumbuhan mikroflora.

Pembuatan Starter dan Pemeriksaan Viabilitas

Persiapan Media Tumbuh. Media tumbuh adalah susu skim yang telah disterilisasi

pada suhu 115 oC selama tiga menit. Susu didistribusikan dalam tabung reaksi

ukuran 10 ml untuk penumbuhan starter induk.

Penyegaran Kultur Starter. Sebesar 5% kultur perbanyakan diinokulasi ke dalam

susu steril yang telah dipanaskan pada suhu 115 oC selama tiga menit, lalu diinkubasi

pada suhu 37 oC untuk Lc. lactis D-01 dan Lb. acidophilus Y-01 dan pada suhu 25 oC

untuk Sc. cereviceae sampai terjadi koagulasi. Kultur tersebut adalah kultur induk

(mother starter). Tahapan selanjutnya yaitu membuat feeder starter dengan cara

menambahkan 5% kultur induk ke media tumbuh baru dan diinkubasikan pada suhu

 

 

21 

 

37 oC. Bulk starter dibuat melalui penambahan 5% feeder starter ke dalam media

tumbuh baru dan diinkubasikan pada suhu 37 oC.

Pemeriksaan Viabilitas Kultur Starter Koumiss. Pemeriksaan viabilitas kultur

starter ini bertujuan untuk mengetahui jumlah koloni dalam starter kerja yang

ditentukan dengan memupukkan dan menumbuhkan kultur starter koumiss pada

media yang sesuai, untuk bakteri asam laktat (Lc. lactis D-01 dan Lb. acidophilus Y-

01) pada media MRSA dan khamir (Sc. cereviceae) pada media PDA.

Pembuatan Starter Koumiss. Bahan baku pembuatan media koumiss yaitu susu

segar yang dipanaskan pada suhu 65 oC selama 30 menit, lalu didinginkan hingga

suhu 28 oC. Koumiss dibuat dengan cara membagi tiga bagian yang sama, yaitu satu

bagian susu dinokulasi dengan Lc. lactis D-01, satu bagian susu diinokulasi dengan

Lb. acidophilus Y-01 lalu diinkubasi pada suhu 37 oC selama tujuh jam dan satu

bagian susu diinokulasi dengan Sc. cereviceae pada suhu 25 oC selama lima jam

(Gambar 7).

 

 

Gambar 7. Diagram Alir Pembuatan Starter Koumiss

Tambahkan satu bagian susu kuda yang telah dipasteurisasi 65 oC selama 30 menit dan telah didinginkan hingga suhu 28 oC

Dipanaskan 65 oC, 30 menit

Inkubasi 25 oC, 5 jam

Inkubasi 28 oC, 24 jam Starter koumiss terbentuk

Dicampur

Inkubasi 37 oC, tujuh jam

Satu bagian inokulasi Sc. cereviceae 

Satu bagian inokulasi Lb. acidophilus

Satu bagian, inokulasi Lc. Lc. lactis ssp. lactis

Dinginkan suhu 28 oC

Susu sapi skim

 

 

22 

 

Pembuatan starter koumiss diawali dengan pencampuran keseluruhan kultur,

baik Lc. lactis D-01, Lb. acidophilus Y-01 maupun Sc. cereviceae sebanyak 3%-5%

(v/v) ke dalam susu kuda yang telah dipanaskan 65 oC selama 30 menit, lalu

didinginkan hingga suhu 28 oC. Hasil campuran susu dan kultur starter diinkubasi

pada suhu 28 oC selama 24 jam sehingga terbentuk starter yang diinginkan

(modifikasi Rahman et al., 1992).

Pembuatan Koumiss

Koumiss dibuat dari susu kuda yang dipanaskan pada suhu 65 oC selama 30

menit dan setelah suhu mencapai 28 oC inokulasi dengan 30% starter. Setelah itu

diinkubasi pada suhu 28 oC selama 24 jam (modifikasi Rahman et al., 1992).

Diagram pembuatan koumiss disajikan pada Gambar 8.

 

 

Dinginkan hingga 5 oC dan disimpan

Pematangan 20 oC selama dua jam

Dikemas dalam botol

Dinginkan hingga 20oC

Inkubasi 28 oC selama 24 jam

Dicampur dan diaduk

Gambar 8. Diagram Alir Pembuatan Koumiss

Inokulasi dengan 30 % starter

Dinginkan suhu 28 oC

Dipanaskan 70 oC, 30 menit

Susu kuda

 

 

23 

 

Pengujian Karakteristik Mikrobiologis

Metode yang digunakan dalam penghitungan TPC, koliform, bakteri asam

laktat dan khamir yang terdapat dalam susu kuda adalah metode agar tuang (Fardiaz,

1992). Sebanyak satu ml susu kuda contoh dipipet ke dalam tabung reaksi berisi

sembilan ml larutan pengencer BPW steril yang selanjutnya merupakan faktor

pengenceran 10-1. Campuran dihomogenkan, kemudian diambil satu ml larutan dan

dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi sembilan ml larutan pengencer NaCl

fisiologis steril sebagai pengenceran 10-2. Pengenceran 10-3, 10-4, dan seterusnya

diperoleh dengan cara yang sama.

Setiap pengenceran yang dikehendaki untuk dipupukkan, dipipet secara

aseptik sebanyak satu ml. Hasil pengenceran dimasukkan ke dalam cawan petri, yang

kemudian dituangi dengan 15-20 ml media steril dan dihomogenkan dengan cara

cawan digerakkan membentuk angka delapan. Khusus untuk koliform media dituang

sebanyak 15 ml, dihomogenkan, lalu dibiarkan membeku. Setelah itu dibuat over lay

dengan cara 5 ml media dituang kembali secara merata ke seluruh permukaan.

Penghitungan jumlah mikroorganisme dilakukan dalam media Plate Count

Agar (PCA) dengan pengenceran 10-4, 10-5 dan 10-6, sedangkan penghitungan

bakteri asam laktat menggunakan media de Man Rogosa Sharpe Agar (MRSA) pada

pengenceran 10-4, 10-5 dan 10-6.

Penghitungan koliform dilakukan dalam media Violet Red Bile Agar (VRBA)

dengan pengenceran 10-1, 10-2 dan 10-3 dan penghitungan khamir dilakukan dalam

media Potato Dextrose Agar (PDA) dengan pengenceran 10-4, 10-5 dan 10-6.

Penghitungan dilakukan secara duplo. Cawan petri diinkubasi dengan keadaan

terbalik dalam inkubator bersuhu 37 oC selama 24 jam. Koloni mikroba yang

terbentuk dihitung berdasarkan Standard Plate Count (SPC) dengan rumus sebagai

berikut:

1 0,1 2

Keterangan :

N = Jumlah koloni yang berbeda dalam kisaran hitung (25-250 koloni) n1 = Jumlah cawan pertama yang koloninya dapat dihitung n2 = Jumlah cawan pertama yang koloninya dapat dihitung d = Pengenceran pertama yang dihitung

 

 

24 

 

Setelah dilakukan tahapan persiapan kultur dan telah didapat jumlah total mikroba,

maka selanjutnya dihitung pengenceran yang diperlukan saat mengerjakan uji difusi

agar sumur.

Pengukuran Nilai pH (AOAC, 2005). Nilai pH diukur dengan alat pH meter

(Schott instrumen lab 850) yang telah dikalibrasi dengan larutan buffer pada pH 7

dan 4. Sampel susu fermentasi dimasukkan ke dalam gelas ukur, kemudian elektroda

dari pH meter dimasukkan ke dalam gelas ukur yang telah diisi dengan susu

fermentasi, nilai pH tertera pada layar pH meter.

Total Asam Tertitrasi (TAT) (Nielsen 2003). Sejumlah volume tertentu sampel

susu fermentasi ditambah tiga tetes Phenopthalein (PP) sebagai indikator, kemudian

campuran tersebut dititrasi dengan larutan NaOH 0,1 N hingga terbentuk warna

merah muda pertama yang tidak hilang. Nilai derajat keasaman dapat dihitung

melalui konversi nilai keasaman menjadi persentase asam laktat sebagai berikut:

persen asam laktat .

100%

Keterangan:

N= normalitas titran (NaOH)

V1= Volume titran (ml)

V2= Volume sampel (ml)

Eq. Wt = Berat ekuivalen asam (asam laktat = 90,08)

Pengujian Aktivitas Daya Hambat Antimikroba Koumiss terhadap Salmonella Typhimurium

Pengujian aktivitas daya hambat antimikroba koumiss terhadap bakteri

Salmonella Typhimurium dilakukan dengan metode difusi agar sumur (modifikasi

Wiryawan et al., 2009). Perlakuan yang dilakukan berupa susu kuda pasteurisasi,

filtrat dan koumiss. Filtrat merupakan hasil sentrifugasi koumiss 6.000 rpm selama 20

menit. Filtrat koumiss digunakan sebagai perlakuan pembanding dan susu kuda

pasteurisasi sebagai kontrol.

Persiapan Bakteri S. Typhimurium ATCC 14028. Bakteri patogen yang

digunakan adalah bakteri yang berumur 24 jam. Bakteri patogen dengan populasi

awal minimal 108 cfu/ml (standar Mc Farland no. 0,5) untuk metode spread plate,

 

 

25 

 

sedangkan untuk metode pour plate perlu diencerkan dalam media NaCl fisiologis

hingga populasi 106 cfu/ml.

Evaluasi Metode Konfrontasi Koumiss terhadap S. Typhimurium ATCC 14028

(Modifikasi Savadogo 2006 dan NCCLS). Pengujian aktivitas antimikroba koumiss

terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 dilakukan dengan metode difusi agar sumur

pour plate (Gambar 9) dan spread plate (Gambar 10).

Keterangan: 1= dimasukkan 50 µl koumiss

2= dimasukkan 50 µl filtrat koumiss

3= dimasukkan 50 µl susu kuda pasteurisasi

diencerkan hingga 106 cfu/ml

bakteri S. Typhimurium ATCC 14028 dipipet satu ml ke dalam cawan petri berdiameter 100 mm

dihomogenkan, dan dibiarkan hingga agar memadat

ditambahkan Muller Hinton Agar suhu 50 oC sebanyak 20 ml

dibuat 3 lubang atau sumur dengan corke borer pada media agar yang telah padat, kemudian ditambahkan Bacteriological Agar pada dasar lubang sumur

1

diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam lalu diamati dan diukur diameter penghambatan setiap sumur 

bakteri S. Typhimurium ATCC 14028 berumur 24 jam 108 cfu/ml (standar Mc. Farland no. 0,5)

1

2 2

3 3

Gambar 9. Diagram Alir Metode Difusi Agar Sumur Pour Plate

 

 

26 

 

Metode pour plate dilakukan dengan cara sebanyak satu ml kultur bakteri S.

Typhimurium ATCC 14028 yang telah diencerkan dengan populasi 106 cfu/ml,

dipipet ke dalam cawan petri, lalu ditambahkan media Muller Hinton Agar (MHA)

pada suhu 50 oC sebanyak 20 ml/cawan dengan diameter 100 mm, kemudian

dihomogenkan dengan cara digerakkan membentuk angka delapan. Media MHA

berisi bakteri indikator dibiarkan memadat.

  Metode spread plate dilakukan dengan menggores bakteri standar 0,5 Mc.

Farland tanpa perlu diencerkan secara merata, setelah media MHA dituang ke dalam

cawan dan memadat. Setelah itu dibuat sumur difusi berdiameter lima mm dengan

alat pelubang atau cork borer, lalu bagian bawah sumur dilapisi dengan media

Bacteriological Agar untuk menghindari koumiss merembes di dasar sumur.

Keterangan: 1= dimasukkan 50 µl koumiss

2= dimasukkan 50 µl filtrat koumiss

3= dimasukkan 50 µl susu kuda pasteurisasi

MHA dibiarkan hingga padat

bakteri S. Typhimurium ATCC 14028 berumur 24 jam 108 cfu/ml (standar Mc. Farland no. 0,5) dituang di atas MHA, kemudian dihomogenkan

dibuat 3 lubang atau sumur dengan corke borer pada media agar yang telah padat, kemudian ditambahkan Bacteriological Agar pada dasar lubang sumur

1

diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam lalu diamati dan diukur diameter penghambatan setiap sumur 

Muller Hinton Agar suhu 50 oC sebanyak 20 ml dituang ke dalam cawan berdiameter 100 mm

1

2 2

3 3

Gambar 10. Diagram Alir Metode Difusi Agar Sumur Spread Plate

 

 

27 

 

Sebanyak 50 μl koumiss dipipet ke dalam sumur, lalu cawan beserta isi diletakkan

dalam refrigerator suhu empat derajat celcius selama 30 menit untuk memberi

kesempatan koumiss berdifusi ke dalam agar. Cawan selanjutnya diinkubasi pada

suhu 37 oC selama 24 jam. Diameter penghambatan berupa zona bening di sekeliling

sumur diukur dengan jangka sorong pada empat tempat yang berbeda, lalu hasil

pengukuran dirata-ratakan.

Penetapan Konsentrasi Koumiss untuk Penghambatan M. tuberculosis H37RV

Penetapan konsentrasi ini dilakukan untuk mengetahui persentase koumiss

yang tepat untuk ditambahkan ke dalam media Lowenstein Jensen dan dapat

menghambat pertumbuhan M. tuberculosis H37RV. Pembuatan Media Lowenstein

Jensen dilakukan dengan terlebih dahulu homogenisasi telur, penimbangan media

Lowenstein Jensen dan pembuatan media untuk pengujian penghambatan

(Sjahrurachman, 2008). Penanaman bakteri Mycobacterium tuberculosis H37RV

dilakukan setelah media penghambatan disiapkan. M. tuberculosis H37RV yang

telah ditanam, diinkubasi selama delapan minggu dengan pengamatan dilakukan

pada minggu keempat, keenam dan kedelapan.

Homogenisasi Telur. Telur bebek segar dibersihkan dengan cara digosok dengan

sikat dan sabun serta dicuci dengan air mengalir. Setelah itu telur dikeringkan dan

direndam dalam etanol 70% selama 15 menit. Telur dipecahkan dengan terlebih

dahulu membakar cangkang lalu ditampung di dalam gelas beker. Homogenisasi

telur dengan blender selama dua menit (jangan sampai terbentuk gelembung).

Larutan telur disaring dengan corong steril yang telah dilapisi dengan kasa steril.

Larutan telur diukur sehingga didapatkan satu l larutan.

Persiapan media Lowenstein Jensen. Media LJ (garam-garam, L-Asparagine)

dilarutkan dalam 600 ml. Gliserol sebanyak 12 ml dan 20 ml larutan malachite green

2% ditambahkan ke dalam larutan. Larutan dihomogenisasi hingga tercampur

sempurna kemudian disterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 121 oC selama

15 menit. Media yang telah steril didinginkan sampai suhu 50 oC dan ditambahkan

telur homogen sebanyak satu l yang telah dipersiapkan secara steril dan perlahan-

lahan (pembentukan gelembung dihindari). Media yang telah siap dituang ke dalam

tabung ulir sebanyak 6-8 ml dan dimasukkan oven pada suhu 85 oC selama 45 menit

pada posisi miring 30o.

 

 

28 

 

Media Lowenstein Jensen Resistensi. Pengujian aktivitas daya hambat dengan cara

menambahkan koumiss dengan persentase tertentu ke dalam media LJ. Persentase

yang diuji sebesar 5%;7%;10%;12%;14% dan 20%. Setelah itu baru dilakukan

inokulasi bakteri Mycobacterium tuberculosis H37RV.

Inokulasi Bakteri Mycobacterium tuberculosis H37RV. Inokulasi diawali dengan

persiapan suspensi bakteri Mycobacterium tuberculosis H37RV dengan konsentrasi

standar 0,5 Mc. Farland lalu diencerkan hingga 103 cfu/ml. Pengenceran dilakukan

dengan menambahkan 1% bakteri (v/v) ke dalam lima ml NaCl fisiologis. Sebanyak

100 µl suspensi bakteri diinokulasi ke dalam media resistensi yang telah disiapkan

dengan menggunakan pipet man secara duplo. Setelah itu suspensi diratakan pada

seluruh permukaan media resistensi. Inkubasi tabung-tabung media dengan posisi

horizontal dengan sudut kemiringan 30o ke dalam inkubator suhu 37 oC selama satu

malam dengan tutup longgar. Setelah inkubasi, tutup tabung dieratkan dan tabung

ditegakkan menjadi posisi vertikal. Pembacaan pertumbuhan koloni dilakukan pada

hari ke 28 dan 42.

Pengujian Penghambatan M. tuberculosis H37RV

Pengujian untuk bakteri M. tuberculosis H37RV dilakukan dengan membuat

media penghambatan yaitu menambahkan koumiss yang telah mengalami perlakuan

penyimpanan dengan persentase sesuai hasil penetapan ke dalam media Lowenstein

Jensen. Penanaman dan pengujian penghambatan dilakukan sesuai dengan metode di

atas.

Pembacaan Uji Penghambatan M. tuberculosis H37RV

Hasil resistensi dibaca pertama kali pada hari ke-28. Jika pembacaan pada

hari ke-28 tersebut adalah resisten, maka tidak perlu diadakan pembacaan ulang,

sehingga produk dinyatakan resisten terhadap Mycobacterium tuberculosis. Jika hasil

pembacaan pada hari ke-28 adalah sensitif maka perlu dilakukan pembacaan ulang

pada hari ke-42 untuk meyakinkan hasil pembacaan pada hari ke-28.

Rancangan

Analisis Data

Analisis data yang digunakan dalam penelitian ini adalah analisis deskriptif

dengan perlakuan pemberian antimikroba pada taraf kontrol (susu kuda pasteurisasi),

 

 

29 

 

pemberian filtrat koumiss dan pemberian koumiss serta perlakuan penyimpanan

koumiss hari ke-0, 2, 4, 6 dan 8 untuk pengujian terhadap S. Typhimurium ATCC

14028. Perlakuan untuk Pengujian M. tuberculosis H37RV yaitu perlakuan

penyimpanan koumiss hari ke-0, 2, 4, 6 dan 8. Analisis data untuk M. tuberculosis

H37RV menggunakan rancangan non-parametrik uji Cohran. Model statistik yang

digunakan sebagai berikut:

M. tuberculosis H37RV

Uji Cohran (Daniel, 1990)

1 ∑ – 1∑

 

Keterangan:

Q = Statistik Cohran C = Jumlah ulangan N = Jumlah total perlakuan R = Jumlah total ulangan

Jika hasil zona penghambatan bakteri M. tuberculosis H37RV menunjukkan

perbedaan diantara taraf perlakuan yang diberikan, maka analisis akan dilanjutkan

dengan uji banding nilai tengah Cohran. Pengolahan data dibantu dengan software

statistik program MedCalc 11.5.0.0.

Peubah yang Diamati

Peubah yang diamati dalam penelitian ini adalah karakteristik mikrobiologis

susu kuda dan koumiss berupa jumlah TPC, koliform, bakteri asam laktat dan khamir

serta aktivitas daya hambat antimikroba terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 dan

pengujian penghambatan koumiss terhadap M. tuberculosis H37RV. Aktivitas daya

hambat antimikroba dihitung berdasarkan diameter zona bening di sekeliling sumur

(mm), sedangkan pengujian penghambatan terhadap Mycobacterium tuberculosis

H37RV dilihat berdasarkan jumlah koloni yang masih tumbuh. Penilaian dengan

skor yaitu 0 (tidak tumbuh) dan 1 (tumbuh).