POTENSI FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL DAUN BINAHONG (Andredera cordifolia (Ten.) Steenis) SEBAGAI ANTIOKSIDAN

Sutanto 1), Sri Wardatun 2) dan Eka Wahyu Lestari 3)1) Program Studi Kimia FMIPA UNPAK - Bogor2, 3) Program Studi Farmasi FMIPA UNPAK - Bogor

Abstrak

Daun Binahong (Andredera cordifolia (Ten.) Steenis mengandung senyawa flavonid yang bersifat antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk menetapkan kadar flavonoid serta menguji potensi antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun Binahong. Penentuan kadar flavonoid dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometri melalui hidrolisis sebagai aglikon yang direaksikan dengan AlCl3 pada panjang gelombang 411 nm. Pengujian potensi antioksidan dilakukan dengan menggunakan metode DPPH pada panjang gelombang 517 nm dengan vitamin C sebagai pembanding. Hasil penentuan kadar flavonoid dalam fraksi etil asetat ekstrak etanol daun Binahong adalah sebesar 10,08%. Fraksi etil asetat ekstrak etanol daun Binahong memiliki nilai IC50 sebesar 21,020 ppm, sedangkan vitamin C sebagai senyawa pembanding memiliki nilai IC50 7,230 ppm.

Kata kunci: Binahong (Andredera cordifolia (Ten.) Steenis), flavonoid, DPPH

Potensi Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol Daun Binahong ....... (Sutanto, Sri dan Eka)Potensi Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol Daun Binahong ....... (Sutanto, Sri dan Eka)PENDAHULUANSenyawa-senyawa sintetik yang mempunyai aktivitas biologis sebagai antioksidan sintetik seperti butylated hydroxytoluen (BHT), butylated hydroxyanisole (BHA) dan tertbutylhydroxyquinone (TBHQ) baru-baru ini dilarang penggunaannya karena bersifat karsinogenik, maka eksplorasi bahan alami yang mempunyai aktivitas biologis sebagai antioksidan menjadi salah satu target para peneliti. Kekhawatiran terhadap efek samping antioksidan sintetik menjadikan antioksidan alami sebagai alternatif yang terpilih.Antioksidan adalah suatu substansi yang diperlukan tubuh untuk menetralisir radikal bebas dan mencegah kerusakan yang ditimbulkan radikal bebas terhadap sel normal. Berdasarkan beberapa penelitian yang telah dikembangkan, senyawa-senyawa yang mempunyai potensi sebagai antioksidan umumnya merupakan senyawa flavonoid, fenolat dan alkaloid.Hasil identifikasi struktur molekul senyawa kimia daun Binahong, dinyatakan mengandung steroid, flavonoid, saponin dan alkaloid (Aviana, 2006 dalam Anggraini, 2008). Adanya senyawa flavonoid menunjukkan bahwa tanaman Binahong memiliki aktivitas sebagai antioksidan. Binahong (Andredera cordifolia (Ten.) Steenis) merupakan salah satu tanaman obat yang mempunyai potensi besar ke depan untuk diteliti. Hal tersebut melatarbelakangi dilakukan analisis kandungan senyawa flavonoid pada daun Binahong yang dianggap berpotensi sebagai antioksidan alami. Penetapan kadar flavonoid ditetapkan kadarnya sebagai aglikon dengan terlebih dahulu melakukan hidrolisis dan selanjutnya dilakukan pengukuran serapan dengan mereaksikan AlCl3 pada panjang gelombang maksimum dengan waktu inkubasi yang optimum. Berdasarkan kadar flavonoid yang diperoleh dilakukan juga pengujian potensi antioksidan.

METODE PENELITIANBahanDaun Binahong, rutin, etanol 96%, metanol, HCl 25%, aseton, etil asetat, AlCl3 2%, asam asetat glasial, aquadest, DPPH, vitamin C dan bahan-bahan lain.

AlatNeraca digital, grinder, mesh 20, botol coklat, rangkaian alat refluks, sinkor, waterbath, alat-alat gelas, cawan penguap, cawan krus, tanur, moisture balance, spatel dan spektofotometer UV-Vis.

Pembuatan SimplisiaDaun Binahong yang telah dikumpulkan dibersihkan, dikeringkan di bawah sinar matahari selama 7 hari. Tahap selanjutnya simplisia kering digrinder sehingga menjadi simplisia serbuk sesuai dengan derajat kehalusan simplisia daun binahong (mesh 20), disimpan dalam wadah bersih dan tertutup rapat.

Analisis Karakteristik Serbuk Simplisia Analisis karakteristik serbuk simplisia daun Binahong dilakukan dengan menetapkan kadar air dan kadar abu.

Pembuatan EkstrakEkstrak dibuat dengan dua tahap, pertama dengan metode maserasi selanjutnya diekstraksi kembali dengan menggunakan refluks. Ekstrak yang sudah direfluks dimasukkan ke tabung sedimentasi dan diuapkan dengan sinkor sampai seluruh pelarut menguap. Rendemen yang diperoleh dihitung dengan menggunakan rumus:

Ekstrak kering daun Binahong kemudian dihidrolisis dengan HCl 25%, kemudian difraksinasi menggunakan corong pisah dengan pelarut eil asetat.Uji FitokimiaUji fitokimia dilakukan secara kualitatif pada ekstrak etanol daun Binahong untuk mengetahui adanya kandungan steroid, flavonoid, saponin dan alkaloid.Uji Steroid: 1 ml ekstrak etanol daun Binahong dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml, ditepatkan sampai batas dengan etanol, disaring ke dalam cawan porselen dan diuapkan sampai kering. Residu ditambahkan eter, kemudian dipindahkan ke dalam plat tetes, ditambahkan 3 tetes asam asetat dan 1 tetes H2SO4 pekat (uji Lieberman-Buchard). Warna hijaus atau biru menunjukkan adanya steroid.Uji Flavonoid: 1 ml ekstrak etanol daun Binahong dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, ditepatkan sampai batas dengan aquadest, dipanaskan selama 5 menit lalu disaring. Sebanyak 10 ml filtrat ditambahkan 0,5 gram serbuk magnesium, 2 ml alkohol klorhidrat (campuran HCl 3% dan etanol 96% dengan perbandingan 1:1) dan 20 ml amil alkohol kemudian dikocok dengan kuat. Terbentuknya warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid.Uji Saponin: 1 ml ekstrak etanol daun Binahong dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, ditepatkan sampai batas dengan aquadest, kemudian dipanaskan selama 5 menit lalu disaring. Sebanyak 10 ml filtrat dikocok dalam tabung reaksi bertutup kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Adanya saponin ditunjukan dengan terbentuknya buih yang stabil.Uji Alkaloid: 1 ml ekstrak etanol daun Binahong dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, ditepatkan sampai batas dengan aquadest, kemudian dipanaskan selama 5 menit lalu disaring. Sebanyak 2 ml filtrat ditambahkan 1 ml HCl pekat dan 9 ml aquadest, dipanaskan di penangas air selama 2 menit, didinginkan, disaring, kemudian dibagi dalam 3 tabung reaksi. Tabung pertama ditambahkan pereaksi Mayer, hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya endapan putih. Pada tabung kedua ditambahkan pereaksi Bouchardat, hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya endapan coklat kehitaman. Sedangkan pada tabung ketiga ditambahkan pereaksi Dragendorf, hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya endapan berwarna merah bata.

Penetapan Kadar Flavonoid1. Persiapan larutan blankoDi pipet 1 ml AlCl3 2%, ditambahkan 10 ml larutan standar rutin 5 ppm, kemudian ditepatkan sampai 25 ml dengan asam asetat glasial 5% (dalam metanol).2. Pembuatan deret larutan standar rutinLarutan standar rutin dibuat dalam beberapa konsentrasi, yaitu 5, 10, 15, 20 dan 25 ppm.3. Penetapan panjang gelombangmemipet 10 ml larutan standar rutin 5ppm, ditambah 1 ml larutan AlCl3 2% (dalam asam asetat glasial 5%), dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml, ditambahkan asam asetat glasial 5% (dalam metanol) sampai batas, larutan diinkubasi pada suhu 37C selama 30 menit dan dilakukan pengukuran serapan pada panjang gelombang 380 nm 780 nm.4. Penetapan waktu inkubasiPenetapan waktu inkubasi optimum dilakukan dengan menggunakan larutan standar rutin 5 ppm, yaitu dengan cara dimasukkan 10 ml larutan standar rutin ke dalam labu ukur 25 ml, ditambah 1 ml larutan AlCl3 2% (dalam asam asetat glasial 5%), ditepatkan sampai batas dengan asam asetat glasial 5% (dalam metanol), kemudian serapan diukur pada panjang gelombang maksimum pada waktu 10, 20, 30, 40, 50 dan 60 menit.5. Pembuatan kurva kalibrasi larutan standar rutinPembuatan kurva kalibrasi dilakukan dengan cara memasukkan 10 ml larutan standar rutin (5, 10, 15, 20 dan 25 ppm) ke dalam labu ukur 25 ml, ditambahkan 1 ml larutan AlCl3 2% (dalam asam asetat glasial 5%) dan asam asetat glasial 5% (dalam metanol) sampai batas, didiamkan selama waktu inkubasi optimum dan dilakukan pengukuran serapan pada panjang gelombang maksimum, dibuat kurva kalibrasi antara konsentrasi larutan dengan nilai serapan yang diperoleh dan dicari persamaanya dibuat persamaan kurva .6. Penetapan kadar flavonoidPenetapan kadar flavonoid dibuat dengan cara memipet 10 ml fraksi etil asetat ekstrak etanol daun Binahong dan dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml dan ditambahkan 1 ml AlCl3 2% (dalam asam asetat glasial 5%), ditepatkan sampai batas dengan asam asetat glasial 5% (dalam metanol), didiamkan selama waktu inkubasi optimum dan dilakukan pengukuran serapan pada panjang gelombang maksimum, kadar flavonoid fraksi etil asetat ekstrak etanol daun Binahong ditentukan dengan persamaan kurva kalibrasi larutan standar rutin.

Uji Aktivitas Antioksidan1. Persiapan larutan pereaksi (blanko)Dipipet 1 ml larutan DPPH 1 mM, ditambahkan metanol sampai 10 ml. Larutan blanko diinkubasi pada temperatur 37C selama 30 menit.2. Penetapan panjang gelombangSebanyak 1 ml larutan DPPH 1 mM, ditambahkan metanol sampai 10 ml, diinkubasi pada temperatur 37C selama 30 menit, diukur serapannya pada panjang gelombang 380-780 nm.3. Penentapan waktu inkubasiSebanyak 1 ml larutan DPPH 1 mM, ditambahkan metanol sampai 10 ml, diinkubasi pada temperatur 37C, diukur pada panjang gelombang maksimum pada 10, 20, 30, 40, 50, dan 60 menit.4. Pembuatan deret larutan vitamin CLarutan vitamin C dibuat dalam beberapa konsentrasi, yaitu 5, 10, 15, 20 dan 25 ppm.5. Pembuatan larutan ujiFraksi etil asetat ekstrak etanol daun Binahong yang digunakan berdasarkan hasil perhitungan kadar flavonoid. Larutan uji dibuat dalam beberapa konsentrasi, yaitu 2,192 ppm, 4,385 ppm, 6,577 ppm, 8,769 ppm, 10,962 ppm, 13,154 ppm, 15,346 ppm, 17,539 ppm, 19,731 ppm dan 21,923 ppm.6. Uji reaksi antioksidan dengan DPPHDeret larutan uji ditambahkan masing-masing 1 ml larutan DPPH 1 mM, didiamkan selama waktu inkubasi dapa suhu 37C, diukur pada panjang gelombang maksimum. Nilai persentase hambatan terhadap DPPH dihitung dari rumus berikut:

Hasil dan pembahasanHasil Pembuatan SimplisiaDaun Binahong segar sebanyak 10 kg dikeringkan dan diserbukkan. Bobot akhir serbuk simplisia yang diperoleh 620 gram sehingga dapat diketahui susut pengeringan simplisia daun Binahong adalah 0,94%.Penetapan kadar air dan kadar abu perlu dilakukan sebelum melakukan ekstraksi dengan tujuan untuk memberikan batasan minimal atau rentang besarnya kandungan air dan kadar abu dalam suatu bahan (Depkes RI, 2000). Penetapan kadar air dilakukan dengan menggunakan moisture balance dengan dua kali pengulangan. Hasil penetapan kadar air simplisia daun Binahong diperoleh sebesar 8,18%. Hasil tersebut memenuhi standar kadar air simplisia secara umum yang tercantum dalam Materi Medika Indonesia (Depkes, 1989) yaitu tidak lebih dari 10%. Semakin kecil kandungan air dalam suatu simplisia, maka akan sangat berguna untuk memperpanjang daya tahan serbuk simplisia selama penyimpanan. Sedangkan hasil penetapan kadar abu simpisia daun Binahong diperoleh sebesar 15,97%. Hasil tersebut tidak memenuhi standar kadar abu simplisia secara umum yang tercantum dalam Materi Medika Indonesia (Depkes, 1989), yaitu tidak lebih dari 12%. Penetapan kadar abu simplisia dilakukan untuk memberikan gambaran kandungan senyawa anorganik yang terkandung dalam simplisia, baik yang berasal dari tanaman secara alami maupun kontaminan selama proses pembuatan simplisia.

Hasil Pembuatan EkstrakPembuatan ekstrak etanol daun Binahong dilakukan dengan 2 tahap, tahap pertama adalah proses maserasi, karena maserasi merupakan cara yang mudah dan sederhana dan dapat dilakukan pada suhu kamar dalam botol coklat. Penggunaan botol coklat dimaksudkan agar selama proses maserasi ekstrak yang dihasilkan tidak terkena cahaya yang nantinya akan berpengaruh selama analisis. Proses maserasi sangat menguntungkan, karena dengan perendaman sel serbuk akan mengalami pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar sel, sehingga metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik. Tahap ekstraksi berikutnya adalah proses pemanasan dengan metode refluks. Proses refluks ini ditujukan untuk lebih mempermudah proses ekstraksi setelah sampel dimaserasi, dengan harapan sampel akan terekstraksi secara maksimal. Ekstrak yang diperoleh kemudian diuapkan dengan menggunakan sinkor sampai seluruh pelarut menguap dan menjadi ekstrak kering. Ekstrak kering yang dihasilkan sebesar 0,136 gram dengan rendemen sebesar 2,52%. Hal tersebut menunjukan bahwa dalam 5,4 gram serbuk simplisia yang digunakan terdapat 2,52% ekstrak etanol daun Binahong.Menurut Harbone (1987) analisa flavonoid lebih baik dengan memeriksa aglikon yang terdapat dalam ekstrak tumbuhan yang telah dihidrolisis, oleh karena itu dalam penelitian ini ekstrak kering dihidrolisis dengan asam klorida 25%. Proses hidrolisis bertujuan untuk memisahkan senyawa glikon dengan senyawa aglikon, karena flavonoid yang terdapat dalam tumbuhan biasanya berupa flavonoid dengan gula terikat (glikon) dan jarang sekali ditemukan hanya flavonoid tunggal. Flavonoid dengan gula terikat menyebabkan flavonoid lebih mudah larut dalam air, sedangkan flavonoid tanpa gula terikat (aglikon) cenderung lebih mudah larut dalam pelarut semi polar sampai non polar seperti etil asetat dan n-heksan. Penggunaan etil asetat pada proses fraksinasi diharapkan agar dapat menarik secara maksimal senyawa aglikon.

Hasil Uji FitokimiaMenurut Aviana (2006) dalam Anggraini (2008) daun Binahong dinyatakan mengandung steroid, flavonoid, saponin dan alkaloid. Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa daun Binahong memberikan hasil positif pada semua uji fitokimia sesuai dengan literatur.

Hasil Penentuan Kadar FlavonoidPenentuan kadar flavonoid ekstrak etanol daun Binahong dilakukan dengan metode spektrofotometri UV-Vis. Tahap yang dilakukan adalah menetapkan panjang gelombang maksimum, penetapan waktu inkubasi optimum dan pembuatan deret larutan standar dengan menggunakan rutin. Hasil penetapan panjang gelombang maksimum yang didapat adalah 411 nm.Tahap berikutnya penetapan waktu inkubasi optimum yang ditujukan untuk menentukan waktu inkubasi yang memberikan serapan stabil atau waktu yang dibutuhkan oleh suatu zat agar dapat bereaksi secara maksimal. Waktu inkubasi optimum yang didapat pada menit ke 20, yang ditunjukkan dengan tidak adanya lagi penurunan nilai serapan.Kurva kalibrasi dibuat dengan menggunakan larutan standar rutin. Kurva kalibrasi dibuat untuk menentukan kadar suatu senyawa yang belum diketahui konsentrasinya. Hasil pengukuran absorban larutan standar rutin dapat dilihat pada Gambar 1.Persamaan yang didapat adalah y = 0,057x - 0,0992 dengan linearitas sebesar 0,9939. Besarnya linearitas ini mendekati satu, sehingga dapat dikatakan bahwa absorban merupakan fungsi yang nilainya berbanding lurus dengan konsentrasi.

Gambar 1. Kurva kalibrasi larutan standar rutin

Nilai serapan dari fraksi etil asetat ekstrak etanol daun Binahong yang diperoleh sebesar 1,157. Berdasarkan persamaan kurva kalibrasi diperoleh kandungan senyawa flavonoid fraksi etil asetat ekstrak etanol daun Binahong adalah sebesar 10,08%.

Penentuan Potensi AntioksidanMetode yang digunakan untuk penentuan potensi antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun Binahong adalah metode DPPH. Metode DPPH dipilih karena sederhana, mudah, cepat dan peka serta hanya memerlukan sedikit sampel. Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun Binahong dibandingkan dengan aktivitas vitamin C.Prinsip dari metode DPPH adalah pengukuran penangkapan radikal bebas sintetik dalam pelarut organik pada suhu 37C oleh fraksi etil asetat dari ekstrak etanol daun Binahong. Proses penangkapan radikal ini melalui mekanisme pengambilan atom hidrogen dari fraksi etil asetat oleh radikal bebas sintetik sehingga radikal bebas menjadi stabil.Tahap awal pengujian antioksidan adalah penetapan panjang gelombang dan penetapan waktu inkubasi optimum. Panjang gelombang maksimum DPPH yang didapatkan dalam penelitian ini adalah 517 nm. Waktu inkubasi optimum ditentukan dengan menggunakan larutan blanko dengan tujuan untuk mencari waktu yang optimum agar senyawa uji dapat bereaksi secara maksimum. Waktu inkubasi optimum didapat pada menit ke 40.Penangkapan radikal oleh fraksi etil asetat ekstrak etanol daun Binahong diamati dari perubahan warna DPPH dari ungu menjadi kuning. Fraksi etil asetat ekstrak etanol daun Binahong dapat dikatakan sebagai suatu senyawa penangkap radikal, karena warna DPPH yang awalnya berwarna ungu menjadi pudar ketika penambahan fraksi etil asetat dari ekstrak etanol daun Binahong, gambar perubahan warna DPPH dapat dilihat pada Gambar 2 di bawah ini:

Gambar 2. Perubahan warna DPPH

Vitamin C digunakan sebagai pembanding, karena vitamin C merupakan suatu senyawa yang murni yang memiliki daya hambat cukup tinggi terhadap radikal bebas, selain itu vitamin C mudah mengalami oksidasi oleh radikal bebas karena mempunyai ikatan rangkap dan dengan adanya 2 gugus -OH yang terikat pada ikatan rangkap tersebut, radikal bebas akan menerima atom hidogen dan menyebabkan muatan negatif pada atom oksigen yang selanjutnya akan dinertalisir melalui resonansi, sehingga menghasilkan radikal bebas yang stabil dan tidak membahayakan. Reaksi oksidasi vitamin C oleh radikal bebas dapat dilihat pada gambar 3.

Gambar 3. Reaksi oksidasi vitamin Cdengan DPPHHasil dari penentuan aktivitas antioksidan menunjukkan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun Binahong memiliki potensi sebagai antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 21,020 ppm, sedangkan vitamin C sebagai senyawa pembanding memiliki nilai IC50 7,230 ppm. Grafik penentuan IC50 dapat dilihat pada Gambar 4.

Gambar 4. Grafik Hubungan antara Konsentrasi dengan Inhibisi

Fraksi etil asetat ekstrak etanol daun Binahong mempunyai potensi sebagai antioksidan dengan IC50 sebesar 21,020 ppm. Potensi tergolong sangat aktif karena nilai IC50 kurang dari 50 ppm. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh senyawa flavonoid dan senyawa golongan polifenol yang dikandungnya. Senyawa flavonoid merupakan senyawa pereduksi yang baik dengan jumlah gugus hidroksil yang cukup banyak. Semakin tinggi kadar flavonoid maka semakin tinggi juga potensi antioksidannya dan semakin banyak gugus hidroksil bebas yang dapat menyumbangkan hidrogen maka akan semakin banyak juga proses reduksi yang dapat dilakukan terhadap DPPH.

KESIMPULAN1. Kandungan flavonoid fraksi etil asetat ekstrak etanol daun Binahong sebesar 10,08%.2. Fraksi etil asetat ekstrak etanol daun Binahong berpotensi sangat aktif sebagai antioksidan dengan IC50 sebesar 21,020 ppm, sedangkan Vitamin C (sebagai pembanding) berpotensi sangat aktif sebagai antioksidan 3 kali lebih besar dari fraksi etil asetat ekstrak etanol daun Binahong dengan IC50 sebesar 7,230 ppm.SARAN1. Dilakukan penetapan kadar aglikon flavonoid ekstrak etanol dengan menggunakan pelarut fraksinasi yang lebih non polar.2. Menguji potensi antioksidan ekstrak etanol daun Binahong dan membandingkannya dengan potensi antioksidan senyawa rutin.

DAFTAR PUSTAKA

Anggraini, Y. 2008. Skripsi: Uji Efektivitas Sediaan Salep Ekstrak Daun Binahong (Andredera cordifolia (Ten.) Steenis) dengan Basis Salep yang Berbeda Untuk Penyembuhan Luka Pada Mencit Jantan (Mus musculus albinus). FMIPA UNPAK Bogor

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1989. Materi Medika Indonesia. Departemen Kesehatan Jakarta

. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Departemen Kesehatan Jakarta

Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, Diterjemahkan: K. Padmawinata dan I. Soediro, Terbitan kedua. Institut Teknologi Bandung Bandung