UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN IDENTIFIKASI …perpustakaan.fmipa.unpak.ac.id/file/e jurnal...

Universitas Pakuan, Bogor

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN IDENTIFIKASI SENYAWA KIMIA

HASIL BIOPRODUKSI ISOLAT KAPANG ENDOFIT K.Cl.Sb.A.12 DARI

AKAR TANAMAN KUNYIT (Curcuma Longa L.) ASAL SUKABUMI

Syah Zena Amilia Putri 1), Drs. Husain Nashrianto 1) dan Bustanussalam 2)

Program Studi Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,

Universitas Pakuan Bogor

ABSTRAK

Antioksidan berfungsi mengatasi atau menetralisir radikal bebas dengan

menghambat atau mencegah terjadinya kerusakan tubuh. Kunyit (Curcuma longa L)

merupakan salah satu tanaman obat yang dapat digunakan sebagai antioksidan.

Penelitian ini bertujuan untuk menguji aktivitas antioksidan dan mengidentifikasi

senyawa kimia hasil bioproduksi isolat kapang endofit K.Cl.Sb.A.12 dari akar tanaman

kunyit (Curcuma longa L.) dengan cara fermentasi kedalam media Potato Sucrose

Broth (PSB) dan Potato Dextrose Broth (PDB). Hasil dari fermentasi diperoleh

biomassa dan filtrat kemudian masing-masing diekstrak dengan etil asetat diuji aktivitas

antioksidannya menggunakan metode peredaman radikal bebas (DPPH) dianalisis

dengan (KLT) kemudian dimurnikan dengan Kromatografi Kolom. Senyawa murni

diidentifikasi struktur kimianya menggunakan spektrofotometri UV-VIS,

Spektrofotometri Inframerah, dan Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-SM).

Hasil penelitian menunjukkan uji aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 dari

ekstrak etil asetat filtrat PDB sebesar 70,0 bpj merupakan ekstrak yang paling aktif

sebagai antioksidan. Hasil kromatografi kolom menunjukkan fraksi II memiliki aktivitas

antioksidan tertinggi nilai % hambat sebesar 31,22 %, kemudian dimurnikan dengan

metode KLT preparatif hasil analisis Pita 1 dari KLT preparatif berbentuk kristal

berwarna putih dengan berat 7,6 mg dapat diperkirakan bahwa isolat X yang terkandung

dalam fraksi II pita 1 adalah 1,3-Benzenediol,5-methyl.

Kata kunci : Isolat K.Cl.Sb.A.12, Potato Sucrose Broth (PSB), Potato Dextrose Broth

(PDB), Antioksidan, DPPH


PENDAHULUAN

Reaksi oksidasi terjadi setiap saat,

Ketika kita bernafas pun terjadi reaksi

oksidasi. Reaksi ini membentuk radikal

bebas yang sangat aktif, yang dapat merusak

struktur serta fungsi sel. Namun, reaktivitas

radikal bebas itu dapat dihambat oleh sistem

antioksidan yang melengkapi sistem

kekebalan tubuh (Winarsi, 2007).

Kunyit (Curcuma longa L) merupakan

salah satu tanaman obat yang dapat digunakan

sebagai antioksidan. Kunyit yang tergolong

dalam kelompok jahe-jahean (Zingiberaceae)

telah lama digunakan oleh masyarakat

Indonesia, terutama sebagai bumbu masak dan

jamu (Said, 2007).

Tumbuhan bersimbiosis dengan

mikroorganisme untuk membantu dalam

proses metabolisme dan menghasilkan

senyawa metabolit sekunder berupa senyawa

bioaktif (Simanjuntak dkk, 2002) .

Mikroba endofit adalah kelompok

mikroba yang hidup dalam jaringan tanaman

dimana tipe interaksi antara mikroba endofit

dengan tanaman inangnya, merupakan

hubungan yang saling menguntungkan

(simbiosis mutualisme) (Simanjuntak dkk,

2002) .

Telah dilakukan penelitian sebelumnya

untuk isolasi dan pemurnian kapang endofit

yang terkait dengan tanaman kunyit

(Curcuma longa L.) dari Sukabumi dan

Cibinong diperoleh 44 kapang endofit. Ada

Enam kapang yang menunjukkan aktivitas

antioksidan lebih dari 65% yaitu, K.Cl.Sb.R9

(93,58%), K.Cl.Sb.A11 (81,49%),

K.Cl.Sb.B1 (78,81%), K.Cl.Sb.R11 (71,67

%) dan K.Cl.Sb.A12 (67,76%) dari

Sukabumi dan K.Cl.Cb.U1 (69,27%) dari

Cibinong (Bustanussalam dkk, 2015).

Dalam penelitian ini, dilakukan

bioproduksi senyawa kimia isolat kapang

endofit K.Cl.Sb.A.12 yang berasal dari

bagian akar tanaman kunyit (Curcuma longa

L.) dengan cara fermentasi kedalam media

Potato Sucrose Broth (PSB) dan Potato

Dextrose Broth (PDB).

Mikroba endofit yang berasal dari


L.) isolat K.Cl.Sb.A.12 yang difermentasikan

dapat menghasilkan senyawa kimia yang

berkhasiat sebagai antioksidan dan dapat

ditentukan struktur kimianya.

BAHAN DAN ALAT

Isolat kapang endofit K.Cl.Sb.A.12 dari


L.) yang berasal dari daerah Sukabumi.

Potato Dextrose Agar (PDA), Potato

Dextrose Broth (PDB), Potato Sucrose Broth

(PSB), alkohol 70%, etil asetat, metanol,

kloroform, metanol proanalisis, air suling

(aquades), n-heksan, silika gel 60, celite 545,

serium sulfat dan DPPH (1,1-difenil-2-

pikrilhidrazil).

Alat-alat gelas (beaker gelas, labu

erlenmeyer, tabung reaksi, gelas ukur, vial,

cawan petri, pipet tetes, pipet skala, corong

pisah), laminar Air Flow (LAF) (H.S 079S),


lampu spirtus, kapas, pinset, jarum Ose,

mikropipet, autoklaf, oven, kertas saring,

indikator PH universal, corong buncher,

bejana kromatografi (chamber), timbangan

analitik, penangas air, pengaduk magnetik,

rotary shaker (BIG Bill), pipa kapiler,

sonikator (Branson 1550), rotavapor (Janke

& Kunkel RV-05-ST), lempeng silika gel

GF254, Kolom kromatografi

Spektrofotometer UV-Vis, Spektrofotometer

Fourier Transfrom Infra Red (FTIR),

Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-

SM).

METODE PENELITIAN

Penelitian ini bertujuan untuk menguji

aktivitas antioksidan dan mengidentifikasi

senyawa kimia hasil bioproduksi isolat

kapang endofit K.Cl.Sb.A.12 dari akar

tanaman kunyit (Curcuma longa L.) asal

Sukabumi yang difermentasikan pada media

Potato Sucrose Broth (PSB) dan Potato

Dextrose Broth (PDB) dengan menggunakan

metode peredaman radikal bebas (Yan and

Chan, 1995) .

1. Kurva Pertumbuhan

1.1 Inokulasi Isolat Kapang Endofit

a) Media Potato Dextrose Agar (PDA)



L.) diinokulasikan pada media PDA di dalam

cawan Petri kemudian diinkubasi selama 5-7

hari pada suhu ruang ( 25 ).

b) Media fermentasi Potato Dextrose

Broth (PDB)

Isolat kapang endofit K.Cl.Sb.A.12

yang telah tumbuh di cawan Petri (working

culture), difermentasikan dengan cara dicetak

dengan sedotan yang steril kemudian diambil

dengan jarum Ose dan dinokulasikan ke

dalam 11 labu Erlenmeyer yang masing

masing berisi 80 mL media cair PDB.

Kemudian diinkubasi pada rotary shaker

dengan kecepatan 120 rpm pada suhu 20-

25 selama 22 hari.

1.2 Pembuatan Kurva Pertumbuhan

Setiap dua hari dilakukan pengambilan

sampel dengan cara diambil 1 buah

Erlenmeyer, biomassa hasil fermentasi

dipisahkan dari filtratnya dengan cara

disaring menggunakan kertas saring dan

filtratnya di cek pH dengan menggunakan pH

universal. Kemudian dikeringkan dengan

oven pada suhu 50-60 sampai kering,

Biomassa kering yang didapat kemudian

ditimbang dan bobot yang diperoleh

merupakan data untuk pembuatan kurva

pertumbuhan kapang endofit.

2. Bioproduksi Laboratorium

2.1 Inokulasi Isolat Kapang Endofit

a. Media Potato Dextrose Agar (PDA)



L.) diinokulasikan pada media PDA didalam

cawan Petri kemudian diinkubasi selama 5-7

hari pada suhu ruang ( 25 ).

b. Media fermentasi Potato Dextrose

Broth (PDB) dan Potato Sucrose Broth

(PSB)


Isolat kapang endofit K.Cl.Sb.A.12

yang telah tumbuh di cawan Petri (working

culture), difermentasikan dengan cara dicetak

dengan sedotan yang steril kemudian diambil

dengan jarum Ose dan dinokulasikan ke

dalam 2 labu Erlenmeyer yang masing

masing berisi 500 mL media cair PDB dan 2

labu Erlenmeyer masing masing berisi 500

mL media cair PSB. Kemudian diinkubasi

pada rotary shaker dengan kecepatan 120

rpm pada suhu 20-25 selama 12 hari.

2.2 Ekstraksi hasil fermentasi

Hasil fermentasi dari masing-masing

Erlenmeyer lalu dipisahkan antara filtrat dan

biomassa dengan cara disaring menggunakan

kertas saring dan corong buncher. Filtrat dari

empat Erlenmeyer diekstraksi sebanyak lima

kali dengan 100 mL etil asetat menggunakan

corong pisah, lalu didiamkan hingga terjadi

pemisahan antara fase etil asetat dan air. Fase

etil asetat dikumpulkan. Untuk biomassa

yang terdapat pada kertas saring dikeringkan

dalam oven bersuhu 50-60 hingga kering,

kemudian biomassa yang kering dipotong

kecil dan diekstraksi dengan cara maserasi

menggunakkan 50 mL etil asetat 3x24 jam

fase etil asetat dikumpulkan. Hasil ekstrak

dari filtrat dan biomassa dari masing-masing

fase diuapkan hingga didapat ekstrak kental

filtrat etil asetat PDB, ekstrak kental

biomassa etil asetat PDB, ekstrak kental

filtrat etil asetat PSB, ekstrak kental

biomassa etil asetat PSB.

2.3 Pengujian Aktivitas Antioksidan

antara Ekstrak Filtrat dan Biomassa

Aktivitas Antioksidan ditentukan

dengan metode peredaman radikal bebas

menggunakan DPPH. Nilai persen hambatan

pada filtrat dan biomassa ditentukan (Yan

and Chan, 1995).

2.3.1 Pembuatan larutan 0,4 mM DPPH

Sebanyak 7,9 mg DPPH (BM =

394,32) ditimbang dan dilarutkan dalam 50

mL metanol proanalisis, dihomogenkan,

kemudian ditempatkan dalam botol berwarna

gelap.

2.4.2 Pembuatan larutan blanko

Sejumlah 0,6 mL DPPH 0,4 mM

dimasukkan kedalam tabung reaksi skala,

lalu ditambahkan metanol proanalisis hingga

tanda batas (3 mL) kemudian dihomogenkan.

2.4.3 Pembuatan larutan uji

Sejumlah 2,5 mg ekstrak dari bagian

filtrat dan biomassa ditimbang menggunakan

timbangan analitik, kemudian dilarutkan

dengan metanol proanalisis sampai 5 mL

(500 bpj). Larutan ini merupakan larutan

induk. Kemudian pipet 30 L, 60 L, 150

L, 300 L dan 600 L larutan induk

tersebut kedalam tabung reaksi yang telah

ditera 3 mL untuk mendapatkan konsentrasi

sampel 5 bpj, 10 bpj, 25 bpj, 50 bpj dan 100

bpj. Pembuatan larutan uji dilakukan

sebanyak dua kali (duplo).

2.4.4 Pembuatan larutan kontrol positif

Sejumlah 2,5 mg Vitamin C ditimbang,

lalu dilarutkan dengan metanol proanalisis


sampai 5 mL (500 bpj). Larutan ini

merupakan larutan induk. Kemudian dipipet

18 L, 36 L, 54 L, 72 L dan 90 L

larutan induk tersebut kedalam tabung reaksi

yang telah ditera 3 mL untuk mendapatkan

konsentrasi sampel 3 bpj, 6 bpj, 9 bpj, 12 bpj

dan 15 bpj. Pembuatan larutan kontrol positif

dilakukan sebanyak dua kali (duplo).

2.4.5 Uji aktivitas antioksidan

Larutan uji dimasukkan ke dalam

masing-masing tabung reaksi. Lalu

ditambahkan 0,6 mL larutan DPPH 0,4 mM

kemudian ditambah metanol proanalisis

hingga 3 mL, kemudian dihomongenkan.

Larutan blangko, larutan uji, dan

larutan kontrol positif segera diinkubasi

selama 30 menit pada suhu 37 , kemudian

serapan dibaca pada panjang gelombang 517

nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis.

2.4.6 Analisis data uji aktivitas

antioksidan

Pada setiap ekstrak filtrat dan biomassa

dilakukan analisis uji aktivitas antioksidan

dengan cara serapan blanko, kontrol positif,

dan larutan uji yang telah diukur pada

Spektrofotometer UV-Vis dicatat kemudian

dicari persen hambatan aktivitas radikal

bebas dengan cara memasukkan hasil serapan

masing-masing sampel pada rumus sebagai

berikut :Hambatan radikal bebas

=

x 100%

Setelah itu, tentukan nilai IC50 dari

setiap ekstrak filtrat dan biomassa dengan

mencari persamaan garis dimana konsentrasi

sebagai sumbu x, dan persen hambat sebagai

sumbu y. Ditentukan ekstrak mana yang

memiliki aktivitas antioksidan tertinggi,

kemudian dilanjutkan pada tahap fraksinansi.

3. Fraksinasi dengan Metode

kromatografi Kolom

Fase etil asetat dari ekstrak yang

terpilih difraksinansi dengan kromatografi

kolom menggunakan fase gerak yang paling

cocok (sesuai hasil dari KLT), fase diam

yang digunakan adalah silika gel 60. Fase

gerak yang digunakan menggunakan sistem

gradien, yaitu kloroform-metanol dengan

perbandingan (15:1), (10:1), (8:1), (6:1),

(4:1), (2:1), (1:1). Fraksi yang memiliki pola

KLT yang sama digabung sehingga diperoleh

fraksi yang lebih sederhana (Harborne,

1987).

3.1 Pengujian Aktivitas Antioksidan Fraksi

Kolom

Uji antioksidan fraksi dari hasil

kromatografi kolom dengan metode

peredaman radikal bebas menggunakan

DPPH (1,1-difenil-2-pikrihidrazil) (Yan and

Chan, 1995).

3.1.1 Pembuatan larutan 0,4 mM DPPH

Sebanyak 7,9 mg DPPH (BM =

394,32) ditimbang dan dilarutkan dalam 50

mL metanol proanalisis, dihomogenkan,

kemudian ditempatkan dalam botol berwarna

gelap.

3.1.2 Pembuatan larutan blanko


Sejumlah 0,6 mL DPPH 0,4 mM

dimasukkan kedalam tabung reaksi skala,

lalu ditambahkan metanol proanalisis hingga

atas tanda (3 mL) kemudian dihomogenkan.

3.1.3 Pembuatan larutan uji

Sejumlah 2,5 mg ekstrak dari fraksi

kolom ditimbang menggunakan timbangan

analitik, kemudian dilarutkan dengan

metanol proanalisis sampai 5mL (500 bpj).

Larutan ini merupakan larutan induk.

Kemudian 600 L larutan induk dipipet

kedalam tabung reaksi yang telah ditera 3 mL

untuk mendapatkan konsentrasi sampel 100

bpj. Pembuatan larutan uji dilakukan

sebanyak dua kali (duplo).

3.1.4 Uji aktivitas antioksidan

Larutan uji dimasukan ke dalam

masing-masing tabung reaksi. Lalu

ditambahkan 0,6 mL larutan DPPH 0,4 mM

kemudian ditambah metanol proanalisis

hingga 3 mL, kemudian dihomongenkan.

Larutan blangko dan larutan uji segera

diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 ,

kemudian serapan dibaca pada panjang

gelombang 517 nm menggunakan

spektrofotometer UV-Vis.

3.1.5 Analisis data uji aktivitas antioksidan

Analisis uji aktivitas antioksidan

dengan cara serapan blanko dan larutan uji

yang telah diukur pada Spektrofotometer

UV-Vis dicatat kemudian dicari persen

hambatan aktivitas radikal bebas dengan cara

memasukkan hasil serapan masing-masing

sampel pada rumus sebagai berikut :

Hambatan radikal bebas

=

x 100%.

4. Kromatografi Lpis Tipis (KLT

Preparatif)

Fraksi paling aktif sebagai senyawa

antioksidan dipilih untuk diidentifikasikan

dilakukan pemurnian terhadap fraksi

menggunakan metode KLT preparatif dengan

cara menotolkan fraksi berupa pita pada

lempeng silika sebagai fase diam kemudian

dielusi dengan menggunakan fase gerak

kloroform-metanol (2:1). Bercak pita yang

muncul dianalisis pada cahaya ruang lalu

dengan sinar UV pada panjanag gelombang

254 nm dan 366 nm. Pita yang muncul

dilakukan pemisahan dengan pengerokan,

hasil pengerokan dilarutkan dengan metanol

pro analisis, lalu dipekatkan. Hasil dari

pemurnian KLT peparatif ini yang akan

ditentukan struktur kimianya (Harborne,

1987).

5. Penentuan Struktur Kimia Senyawa

Aktif (Harborne, 1987)

5.1 Analisis Spektrofotometri UV/Vis

terhadap isolat murni

Isolat murni yang didapat dari hasil

pemurnian kromatografi kolom diidentifikasi

menggunakan spektrofotometri UV-Vis pada

panjang gelombang 200-400 nm

menggunakan metanol pro analisis sebagai

blanko dan juga digunakan sebagai pelarut.

Analisis ini digunakan untuk mengetahui


panjang gelombang maksimum dan gugus

kromofor yang terdapat dalam isolat .

5.2 Analisis Spektrofotometri FTIR terhadap

isolat murni

Isolat murni diidentifikasi

menggunakan spektrometri FTIR pada

bilangan gelombang 600-4000 cm-1

dengan

cara menggerus ekstrak kering dari isolat

bersamaan dengan KBr hingga halus dan

homogen. Setelah diperoleh isolat yang telah

homogen dimasukkan ke dalam

spektrofotometer FTIR untuk menentukan

gugus fungsi yang terdapat dalam isolat

5.3 Analisis dengan Kromatografi Gas-

Spektrometri Massa (KG-SM)

Isolat murni diidentifikasi

menggunakan KG-SM untuk menentukan

bobot molekul senyawa dan fragmentasinya.

Sejumlah isolat murni dilarutkan dalam

metanol pro analisis kemudian diinjeksikan

ke dalam KG-SM lalu diinterpretasikan

spektrum massanya dibandingkan dengan

data library.

HASIL DAN PEMBAHASAN

1. Kurva Pertumbuhan

Tujuan dari pembuatan kurva

pertumbuhan ini adalah untuk menentukan

waktu yang diperlukan dalam melakukan

bioproduksi terhadap kapang endofit

K.Cl.Sb.A.12. Lamanya waktu untuk

melakukan bioproduksi ditentukan dengan

menggunakan waktu pada saat terjadinya

fase stasioner pada kapang endofit, karena

pada fase ini senyawa yang dihasilkan

diharapkan dalam jumlah maksimal sebelum

memasuki fase kematian yang akan

menyebabkan terjadinya kematian sel

sehingga senyawa hasil bioproduksi pun akan

berkurang. Kurva pertumbuhan dari isolat

kapang endofit K.Cl.Sb.A.12 dapat dilihat

dari Gambar 1.

Gambar 1. Kurva pertumbuhan isolat kapang

endofit K.Cl.Sb.A.12

Berdasarkan hasil kurva pertumbuhan

yang diperoleh maka ditentukkan waktu

untuk fermentasi pada tahap bioproduksi

akan dilakukan selama 14 hari, karena pada

hari ke-14 kapang sedang berada dalam

keadaan stasioner dimana senyawa yang

dihasilkan berada dalam keadaan cukup

konstan sehingga diharapkan senyawa yang

dihasilkan oleh kapang cukup banyak.

1.1 Pengukuran pH

Hasil pengukuran pH dari filtrat

fermentasi kapang endofit K.Cl.Sb.A.12

ditunjukan oleh Tabel 1.

-2,22E-16 0,05

0,1 0,15

0,2 0,25

0,3 0,35

0,4 0,45

0,5 0,55

0,6

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Bob

ot

bio

mass

a

ker

ing (

gra

m)

Hari Ke-

Kurva Pertumbuhan

K.Cl.Sb.A.12


Tabel 1. Hasil pengukuran pH fermentasi

isolat kapang endofit K.Cl.Sb.A.12

Waktu (Hari) pH

Blanko 4

Hari ke-2 5

Hari ke-4 5

Hari ke-6 5

Hari ke-8 5

Hari ke-10 5

Hari ke-12 6

Hari ke-14 6

Hari ke-16 6

Hari ke-18 6

Hari ke-20 6

Hari ke-22 6

Hasil pengukuran pH menunjukkan

kapang endofit K.Cl.Sb.A.12 tumbuh pada

kisaran pH 4-6, Hal ini dimungkinkan pada

pH 6 kapang sudah tidak berada pada kisaran

pH pertumbuhan optimalnya perubahan pH

ini bisa disebabkan karna akumulasi zat-zat

ekskresi kapang.

2. Bioproduksi Laboratorium

Bioproduksi laboratorium dilakukan

untuk memperoleh ekstrak hasil fermentasi

kapang, baik ekstrak filtrat maupun biomassa

dalam jumlah yang banyak. Bioproduksi

yang dilakukan dengan fermentasi isolat

K.Cl.Sb.A.12 pada 2000 mL media PDB dan

2000 mL media PSB, kemudian diekstraksi

dengan etil asetat. Fase etil asetat yang

diperoleh dikumpulkan dan dikeringkan

hingga diperoleh ekstrak kering. Ekstrak

kering masing-masing fase ditimbang

bobotnya ditunjukan filtrat etil asetat PDB

sebesar 41,8 mg, biomassa etil asetat PDB

sebesar 10,6 mg, filtrat etil asetat PSB 30,3

mg, dan biomassa etil asetat PSB 33,3 mg.

2.1 Pengujian aktivitas antioksidan ekstrak

filtrat dan ekstrak biomassa menggunakan

DPPH 0,4 mM

Ekstrak etil asetat filtrat dan biomassa

PDB, ekstrak etil asetat filtrat dan biomassa

PSB dilakukan uji aktivitas antioksidannya

menggunakan metode peredaman radikal

bebas DPPH dengan menggunakan kontrol

positif vitamin C.

Pengujian ini bertujuan untuk memilih

salah satu diantara ekstrak tersebut diatas

yang mempunyai aktivitas antioksidan paling

tinggi. Hasil uji aktivitas antioksidan dapat

dilihat Gambar 2

Gambar 2.Hasil uji aktivitas antioksidan

Dari hasil uji aktivitas antioksidan

diketahui bahwa IC50 ekstrak etil asetat filtrat

PDB lebih kecil dibandingkan ekstrak yang

lain dengan nilai IC50 sebesar 70,0 bpj

merupakan ekstrak yang paling aktif sebagai

antioksidan dibandingkan dengan ekstrak

yang lain. Penggunaan vitamin C sebagai

2,07 70,0

2442,68

201,42

679,92

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500

IC5

0 (b

pj)

Ekstrak

Vitamin C

Ekstrak Filtrat PDB

Ekstrak Biomassa PDB

Ekstrak Filtrat PSB

Ekstrak Biomassa PDB


kontrol positif dilakukan untuk

membandingkan data aktivitas antioksidan

dari ekstrak filtrat dan biomassa karena

vitamin C sudah terbukti memiliki aktivitas

yang sangat aktif sebagai antioksidan dengan

nilai IC50 sebesar 2,07 bpj. Ekstrak filtrat

PDB dipilih untuk dilanjutkan pada tahap

fraksinasi kromatografi kolom.

2.2 Analisis dengan kromatografi lapis

tipis

Berdasarkan hasil uji aktivitas

antioksidan dengan metode peredaman

radikal bebas bahwa ekstrak etil asetat filtrat

PDB memiliki aktivitas antioksidan tertinggi

dibandingkan dengan ekstrak lain. Dilakukan

analisis kromatografi lapis tipis dengan

menggunakan fase gerak n-heksan- etil asetat

(5:1) dan kloroform-metanol (9:1). Analisis

ini bertujuan untuk mengetahui pola bercak

yang terdapat pada ekstrak etil asetat filtrat

PDB dan mencari fase gerak yang sesuai

untuk pemisahan pada kromatografi kolom.

Kromatogram KLT dapat dilihat pada

Gambar 3.

Gambar 3. Kromatogram KLT ekstrak

K.Cl.Sb.A.12

Fase diam : silika gel GF254

Pereaksi semprot : serium sulfat

Keterangan : B = Biomassa

F = Filtrat

Hasil eluasi menunjukkan bahwa eluen

kloroform-metanol (9:1) memberikan pola

pemisahan bercak yang lebih terpisah dan

lebih bisa mengeluasi senyawa sehingga

tidak ada yang tertinggal dititik awal KLT.

3. Fraksinasi dengan kromatografi kolom

Ekstrak etil asetat dari filtrat PDB

selanjutnya difraksinasi dengan metode

kromatografi kolom menggunakan eluen

campuran kloroform-metanol yang telah

diperoleh pada analisis KLT. Fraksinasi ini

bertujuan untuk memisahkan senyawa-

senyawa yang terdapat didalam ekstrak.

Fase gerak yang digunakan adalah

kloroform-metanol dengan perbandingan

(15:1) ~ (1:1). Sedangkan fase diam yang

digunakan adalah silika gel 60, dengan

dimensi kolom 3x40 cm. Hasil fraksinasi

diperoleh 49 fraksi dengan volume masing-

masing 10 mL. Lalu fraksi-fraksi tersebut

dianalisis KLT dengan selang penotolan

setiap 3 fraksi. Hasil kromatogram dapat

dilihat pada Gambar 4.

Gambar 4. Kromatogram KLT fraksi hasil

kromatografi kolom

n-heksan–etil

asetat (5:1)

1 4 7 10 13 16 19 22 25 25 28 34 31 37 40 43 46 49

Kloroform-metanol (9:1) Kloroform-metanol (5:1)

Kloroform–

metanol (9:1)

Ekstrak

PDB

Ekstrak

PDB Ekstrak

PSB

Ekstrak

PSB


Senyawa yang memiliki pola

kromatogram yang sama kemudian digabung

karena dianggap memiliki kandungan

senyawa yang sama. Setelah dilakukan

penggabungan diperoleah 3 fraksi yang

kemudia dilakukan penotolan kembali

dengan KLT menggunakan fase gerak

kloroform : metanol (5:1) untuk melihat

bercak-bercak yang dihasilkan. Hasil

fraksinasi kromatografi kolom pertama dapt

dilihat pada Gambar 5

(a) (b)

Gambar 5. Kromatogram KLT fraksi

gabungan hasil fraksinasi kromatografi

kolom

Fase gerak : Kloroform-metanol (5:1)


Keterangan :(a) setelah disemprot serium

sulfat kemudian dikeringkan dan

dipanaskan diatas pemanas plat

sampai timbul bercak

(b) Sinar UV = 254 nm

Masing-masing fraksi yang diperoleh

kemudian ditimbang. Hasil penimbangan

ketiga fraksi gabungan tersebut dapat dilihat

Tabel 2.

Tabel 2. Hasil fraksi kromatografi kolom

Gabungan

fraksi

Kelompok

fraksi

Bobot

(mg)

1-10 I 30

11-40 II 40

41-49 III 10

Ketiga fraksi tersebut diuji aktivitas

antioksidannya untuk mengetahui fraksi

mana yang memiliki persen hambat

antioksidan yang paling tinggi.

3.1 Uji aktivitas antioksidan dengan metode

peredaman Radikal bebas DPPH terhadap

hasil kelompok fraksinasi kromatografi

kolom

Kelompok fraksi yang telah diperoleh

dari penggabungan fraksi-fraksi hasil

kromatografi kolom diuji aktivitas

antioksidannya mnggunakan metode

peredaman radikal bebas DPPH 0,4mM.

Dalam pengujian ini hanya terbatas pada

perhitungan persen hambat karena

keterbatasan jumlah bahan uji yang ada.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi II

memiliki persen hambat paling besar

daripada fraksi lainnya. Hasil pengujian

aktivitas antioksidan terhadap fraksi

kromatografi kolom dapat dilihat pada Tabel

3.

Tabel 3. Persen hambat kelompok fraksi

kromatografi kolom dengan konsentrasi 100

bpj

Sampel % Hambat

Fraksi I 25,74

Fraksi II 31,22

Fraksi III 23,19

Pengujian aktivitas antioksidan ekstrak

dari filtrat PDB diperoleh nilai % hambat

69,56% pada konsentrasi 100 bpj .Sementara

setelah difraksinasi persen hambatnya

mengalami penurunan menjadi 31,22% pada

konsentrasi 100 bpj. Hal ini disebabkan di


dalam ekstrak terdapat senyawa yang bersifat

SEES (secondary Efficacy Enhancing

Substantance) artinya senyawa yang ada

didalam ekstrak bekerja secara sinergi dan

apabila difraksinansi, ekstrak menjadi

terpisah sehingga kesatuan ekstrak menjadi

berubah dan senyawa yang tadinya bersifat

dapat meningkatkan antioksidan menjadi

hilang (Setianti, 2015).

4. Pemurnian fraksi II dengan KLT

preparatif

Hasil analisis KLT menunjukkan fraksi

II yang memiliki % peredaman radikal bebas

tertinggi. Tetapi fraksi ini mempunyai

beberapa bercak sehingga perlu dilakukan

pemurnian dengan KLT preparatif dengan

menggunakan fase gerak kloroform-metanol

(2:1). Pola kromatogram fraksi II dari hasi

KLT preparatif menunjukkan adanya 1 pita

yang diduga mengandung isolat X. Gambar

KLT preparatif fraksi II dapat dilihat pada

Gambar 5.

Gambar 5. Kromatogram KLT-preparatif

fraksi II dibawah sinar UV = 254 nm

Fase gerak : kloroform-metanol (2:1)


Keterangan : setelah dilihat dibawah UV

254, bercak tersebut ditandai dan dikerok.

Pita 1 setelah dikerok dari hasil KLT

prepartif diduga senyawa murni berbentuk

kristal, beratnya 7,6 mg dan berwarna putih.

Kemudian dilakukan dengan KLT kembali

untuk melihat kemurniannya, hasil KLT

dapat dilihat pada Gambar 6. Hasilnya

terlihat ada 1 spot dibawah sinar UV = 254

nm yang artinya senyawa tersebut sudah

murni, sedangkan hasil KLT dengan penanda

gerak DPPH di peroleh spot berwarna kuning

artinya senyawa tersebut memiliki aktivitas

antioksidan.

(a) (b)

Gambar 6. Kromatogram KLT Pita 1 hasil

KLT Preparatif

Fase gerak : Kloroform-metanol (2:1)


Keterangan : (a) Disemprot DPPH kemudian

dikeringkan plat sampai timbul

spot

berwarna kuning

(b) Sinar UV 254

5. Identifikasi struktur kimia isolat x

5.1 Spektrofotometri UV-Vis

Pengujian spektrofotometri UV-Vis

yang dilakukan pada panjang gelombang

200-400 nm, menunjukkan bahwa puncak

maksimum yang terdapat pada panjang

gelombang 308 nm dengan nilai serapan

Pita 1


0,952. Hasil spektrum beserta serapan dapat


Gambar 7. Spektrum hasil spektrometri UV-

Vis Isolat X.

5.2 Spektrofotometri FTIR

Spektrum dari FTIR yang digunakan

untuk melihat gugus fungsi dalam senyawa

berdasarkan bilangan gelombang dapat

dilihat pada Gambar 8. Interprestasi yang

dilakukan berdasarkan spektrum FTIR

ditunjukkan dalam Tabel 4.

Gambar 8. Spektrum hasil spektrometrin

FTIR isolat X

Tabel 4. Hasil interpretasi spektra FTIR dari

isolat X

N

o

Frekuens

i

Rentang

frekuens

i (cm-1

) *

Tipe

ikata

n *

Tipe

senyawa

*

1 3585,42 3200-

3600 v

O-H Fenol,

Hidroksil

2 2925,81

2858,31

2859-

2970 v

C-H Alkana

3 1591,16 1500-

1600 v

C=C Cincin

aromatik

4 1463,87

1411,80

1340-

1470 s

C-H Alkana

5 1151,42

1078,13

1050-

1300

C-O

Alkohol,

eter

6 997,13

881,41

690-900 C-H Cincin

Aromatik

Keterangan :

s : strong, m : medium, v : variable, b : broad

: Tabel frekuenasi dan panjang gugus fungsi dari

Principles of Instrumental Analysis Sixth Edition (

Skoog, 2007).

5.3 Kromatografi Gas-Spektrometri Massa

Analisis KG-SM untuk isolat X

memberikan beberapa puncak kromatogram

yang menunjukkan adanya beberapa senyawa

kimia dalam isolat X. Senyawa kimia yang

tekandung dalam isolat X terutama senyawa

dengan waktu retensi (Rt) 10,338 menit,

sedangkan senyawa yang lebih kecil dengan

waktu retensi (Rt) 25,379. Satu senyawa

utama dengan waktu retensi 10,338 menit

diidentifikasikan sebagai senyawa m/z 124.05

yang memiliki nilai kemiripan dengan

database Willey09th.L diatas 90%,

sedangkan satu senyawa dengan waktu

retensi 25,379 menit diidentifikasikan

sebagai senyawa m/z 678.43 yang memiliki


kemiripan diatas 80, dimana semakin tinggi

nilai persen kemiripan dari suatu puncak hal

ini menandakan kemiripan suatu sneyawa

dengan database Willey09th.L.

Kromatogram KG-SM isolat X dapat


Gambar 9. Kromatogram KG-SM dari Isola

X

Tabel 5. Beberapa kandungan senyawa isolat

X hasil analisis KG-SM

Hasil analisis dengan KG-SM menggunakan

database Willey09th.L didapat kemungkinan

senyawa yang terdapat pada isolat X adalah

senyawa 1,3-Benzenediol,5-methyl karena

memiliki puncak kromatogram yang

maksimum dan tingkat (qual) lebih dari 90%.

Gambar 10. Spektra massa fragmentasi

senyawa isolat X pada waktu retensi 10,338

Berdasarkan hasil interprestasi dari tiga

instrumen yang didapat, dimana pada spektra

UV-Vis terdapat serapan pada panjang

gelombang diatas 200 nm yang menunjukkan

adanya gugus kromofor dan diduga

merupakan suatu ikatan rangkap. Pada

spektra FTIR didapat munculnya fenol,

hidroksil, alkana, cincin aromatik, alkohol,

eter. Pada kromatogram KG-SM didapat

beberapa peak (puncak) dimana suatu

diantaranya memiliki nilai kemiripan (qual)

paling tinggi yaitu 93% dan menurut

Willey09th.L adalah suatu senyawa 1,3-

Benzenediol,5-methyl. Dari semua hasil

analisis yang didapat, disimpulkan bahwa

senyawa isolat X hasil bioproduksi isolat

K.Cl.Sb.A.12 yang difermentasi dalam media

1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0 4 0 . 0 0

5 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0

1 5 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0

2 5 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0

3 5 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0

4 5 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0

5 5 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0

6 5 0 0 0 0

7 0 0 0 0 0

7 5 0 0 0 0

T im e -->

A b u n d a n c e

T I C : A K A R K U N Y I T . D \ d a t a . m s

1 0 . 3 4 2

1 0 . 7 5 9

1 0 . 9 4 61 2 . 6 8 21 3 . 9 3 0

1 4 . 4 1 3

1 4 . 5 9 61 9 . 6 1 5

2 5 . 3 8 32 5 . 4 5 2

2 5 . 6 2 6

2 5 . 7 3 3

2 5 . 7 9 7

N

o

Waktu

retensi

(menit)

Bobot

moleku

l (m/z)

Qual

(%)

Kemungkinan

senyawa

menurut

database

Willwy09th,L

Perkiraan

Struktur

Molekul

1 10,338 124.05 93 1,3-

Benzenediol,5

-methyl

2 25,379 678.43 83 7,13,19,25-

Tetra-tert-

butyl-

27,28,29,30-

tetrahydroxy-

2,3-bishomo-

3-oxacalix


PDB diduga merupakan 1,3-Benzenediol,5-

methyl. Perkiraan struktur dapat dilihat pada

Gambar 11.

Gambar 11. 1,3-Benzenediol,5-methyl

KESIMPULAN

1. Hasil uji aktivitas antioksidan dengan nilai

IC50 dari ekstrak etil asetat filtrat PDB

adalah sebesar 70,0 bpj merupakan

ekstrak yang paling aktif sebagai

antioksidan.

2. Fraksi II memiliki nilai % hambat

tertinggi sebesar 31,22 %.

3. Hasil analisis Pita 1 dari KLT preparatif

berbentuk kristal berwarna putih dengan

berat 7,6 mg dapat diperkirakan bahwa

isolat X yang terkandung dalam fraksi II

pita 1 adalah 1,3-Benzenediol,5-methyl.

DAFTAR PUSTAKA

Bustanussalam , Fauzy R, Eris S, Sylvia J.R.

L, Tiwit W, Harmastini l, Sukiman and

Partomuan S. 2015. Screening for

Endophytic Fungi from Tumeric Plant

(Curcuma Longa L) of Sukabumi and

Cibinong with Potencyas Antioxidant

Compound Producer. Pakistan Journal

of biological Sciences 18 (1):

42-45.

Harborne, J. B. 1987. Metode Fitokimia,

Penuntun Cara Modern Menganalisa

Tumbuhan. Terbitan Kedua.

Terjemahan Kokasih Padmawinata dan

Iwang Soediro, Penerbit ITB,

Bandung.

Said Ahmad. 2007. Khasiat dan Manfaat

Kunyit , Sinar Wadja Lestari, Jakarta,

hal 4-11.

Setianti, Priskila. A. 2015. Isolasi dan

identifikasi senyawa antioksidan hasil

bioproduksi kapang endofit

(K.Cl.Sb.R9) dari rimpang kunyit

(Curcuma longa linn.) Asal Sukabumi,

Skripsi Universitas Pancasila, Jakarta,

hal 41.

Simanjuntak P, Parwati T, Bustanussalam,

Titik K. Prana, dan Shibuya H Kurnia .

2002. Produksi Alkaloid Kuinina Oleh

Beberapa Mikroba Endofit Dengan

Penambahan Zat Induser (Studi

Mikroba Endofit Tanaman Cinchona

Sp. (2)) , Majalah Farmasi

Indonesia, Faculty of Pharmacy and

Pharmaceutical Sciences, Fukuyama

University, Fukuyama, Japan 13 (1) : 1-6.

Winarsi, Hery. 2007. Antioksidan Alami dan

Radikal Bebas potensi dan

aplikasinya dalam kesehatan, Kanisius,

Yogyakarta, hal 11-20.

Yan, G.C. and H.Y. Chen. 1995. Antioxidant

activity of various tea extracts in

relation to their antimutagenicity.

J.Agric. Food Chem., 43: 27-37

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN IDENTIFIKASI …perpustakaan.fmipa.unpak.ac.id/file/e jurnal...

Documents

Transcript of UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN IDENTIFIKASI …perpustakaan.fmipa.unpak.ac.id/file/e jurnal...