WINTER Regulasi Epigenetik padaMigrasi dan Invasi Sel Trofoblastik ManusiaDosen Pembimbing : dr. Christofel P, Sp.OGDisusun Oleh : Laura Puspita (0761050049)

Journal Reading

01

Template

KEPANITERAAN KLINIK ILMU KEBIDANAN DAN KANDUNGAN RSUD BEKASI PERIODE SEPTEMBER 2011 - OKTOBER 2011

ABSTRACTHal yang sangat penting untuk reproduksi mamalia yang berhasil adalah kemampuan embrio yang sedang berkembang untuk berimplantasi pada dinding rahim dan membentuk pasokan nutrisi melalui plasentasi. Di sini, kami telah memeriksa regulasi epigenetik yang potensial pada migrasi dan invasi sel trofoblas manusia dengan menggunakan lini sel koriokarsinoma, BeWo. Pengobatan sel BeWo dengan inhibitor DNA methyltransferase, 5-aza-2-deoxycytidine (AZA), menghasilkan konversi morfologi sel menjadi fenotip yang tidak bermigrasi. Ini dicontohkan dengan kemampuan AZA untuk mencegah migrasi sel BeWo dalam penyembuhan luka dan tes migrasi transwell. Sebagai konsekuensinya, AZA menghambat invasi sel BeWo melalui membran basement yang dilarutkan. Pemeriksaan komponen dari kompleks persimpangan (junction) adherens penting untuk penentuan fenotip sel, mengungkapkan bahwa AZA secara khusus meningkatkan kadar E-cadherin dan plakoglobin (-Catenin) dari mRNA , tetapi tidak untuk -catenin dan -catenin.

Down Regulation : 1. The process by which a cell decreases the quantity of a cellular component, such as RNA or protein, in response to an external variable. (www.wikipedia.com) 2. A decrease in the number of receptors on the surface of target cells, making the cells more sensitive to a hormone or another agent. (www.medicine.net.com) Up Regulation : 1. The process by which a cell increases the quantity of a cellular component, such as RNA or protein, in response to an external variable. (www.wikipedia.com) 2. An increase in the number of receptors on the surface of target cells, making the cells more sensitive to a hormone or another agent. (www.medicine.net.com)

Implantasi membutuhkan sejumlah fungsi seluler yang berbeda-beda termasuk perlengketan ke sel endometrial, penyebaran yang embrionik trophoblast yang embrionik dan invasi sel trofoblastik ke dalam endometrium (1, 2). Kurangnya invasi trophoblastic menghasilkan laju keberhasilan buruk dari fertilisasi secara in vitro (37) dan secara patologis, dapat menghasilkan komplikasi kehamilan termasuk keguguran, preeklamsia, gangguan pertumbuhan intrauterine dan kelahiran prematur, abrupsio plasenta, dan kematian intrauterin (2). Sebaliknya invasi, yang berlebihan dari sel trofoblas ke dalam endometrium dikaitkan dengan plasenta acreta dan kanker yang invasif (koriokarsinoma) (8, 9). Dengan begitu, mekanisme yang diatur dengan ketat menguasai kemampuan trophoblastic ectoderm untuk menyerbu endometrial stoma.

Dalam konteks ini, molekul adherens junction (AJ) [E-cadherin, -, -, dan -catenin (plakoglobin)], mempunyai tugas pokok pada diferensiasi ,invasi, dan pembentukan kembali plasenta dari trophoblast (10 14). 4). E-cadherin adalah salah satu anggota kelompok Ca2_-dependent cellmolekul adesi sel. Lingkup intraseluler E-cadherin berinteraksi dengan sitoskeleton aktin melalui sejumlah AJ protein termasuk , -, -, dan catenin (plakoglobin) (15). Plakoglobin dan -catenin memperlihatkan homologi terbesar dan mengikat secara langsung ke ekor sitoplasma E-kaderin dengan cara khusus. Catenin kemudian menyangkutkan batas E-cadherin-catenin (-catenin atau plakoglobin) ke actin sitoskeleton. Ini secara umum disebut kompleks AJ. Gangguan pada ekspresi kompleks AJ, terutama E-cadherin, dihubungkan dengan invasi dan metastasis dari banyak kanker pada manusia (15, 16). Demikian pula, proses down-regulation dari ekspresi E-cadherin sudah dilaporkan di diferensiasi trophoblasts menjadi fenotip yang invasif (17). Ekaderin telah dilaporkan harus dibungkam dalam sel kanker yang berbeda dengan mekanisme yang berbeda, termasuk mutasi somatik, represi transkripsi, dan metilasi promotor (18).

Struktur kromatin dinamik yang mempengaruhi ekspresi gen diatur pola reversibel dari epigenesis dari metilasi DNA dan modifikasi histon (19). Enzim yang terlibat dalam proses ini termasuk DNA methyltransferases (DNMTs) (20), histone deacetylases (21), histone acetylase (22, 23), histone methyltranferases, dan dan methyl-binding domain protein MECP2 (24). Metilasi adalah satu di antara beberapa modifikasi pasca-sintetis yang cenderung terjadi pada DNA normal. Enzim yang bertanggung jawab atas proses ini pada mamalia adalah DNA methyltransferases (DNMTs) (20). DNMT-1 dilibatkan dalam pemeliharaan dari pola metilasi DNA spesifik selama replikasi DNA dan lebih suka bekerja di substrat hemimethylated CpG (20). Sebaliknya, DNMT-3a dan DNMT-3b menunjukkan aktivitas de novo methyltransferase (25). Kerusakan gen DNMT-1 atau DNMT-3b yang ditargetkan mematikan embrionik pada tikus (25), sedangkan pada gangguan DNMT-3a tikus mati sesaat sesudah kelahiran (26), hal ini memberikan kesan bahwa DNMTs penting untuk perkembangan normal dari embrionik.

02

BAHAN & METODE

KULTUR Garis sel koriokarsinoma BeWo, JAR, dan JEG-3 diperoleh dari American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Sel dikultur dalam DMEM/F12 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), ditambah dengan 10% serum janin sapi yang dipanaskan dan dilemahkan (Invitrogen Life Technologies), 2 mm l-glutamin (Invitrogen Life Technologies), 100 U / ml penisilin, dan 100 g / ml streptomisin (Invitrogen Life Technologies) dan dikultur pada suhu 37C dalam inkubator yang dilembabkan dengan CO2 5%. Sel-sel dipisahkan oleh tripsinisasi (1X tripsin EDTA; Invitrogen Life Technologies).

Pengobatan dengan AZA Sel BeWo, JAR, dan JEG-3 dikultur dalam ketiadaan atau kehadiran dari 10M AZA (Sigma, St Louis, MO) selama 48 jam. Morfologi, motilitas, dan invasi sel pada ada atau tidak adanya inhibitor diperiksa. Viabilitas sel ditentukan dengan pengecualian tripan biru.

03

HASIL

Untuk memeriksa potensi epigenetik dari fungsi regulasi sel trofoblas, maka pertama-tama kami menentukan apakah inhibisi farmakologi dari metilasi akan mengubah morfologi trofoblastik yang berasal sel koriokarsinoma. Garis sel BeWo koriokarsinoma yang berasal dari trofoblas dikultur pada media plastik dengan ketiadaan atau kehadiran 10 M AZA inhibitor DNA methyltransferase selama 48 jam dan filamen aktin divisualisasikan dengan FITC-phalloidin. sel BeWo yang diberi AZA berbentuk bulat, diperlihatkan sebagai koloni kecil karena penurunan motilitas, membentuk rumpun ketat dengan sedikit ekstensi, dan individu sel di perifer rumpun memperlihatkan beberapa tonjolan selular (Gambar 1, D dan E). Selain itu, pengobatan AZA pada sel BeWo mengakibatkan lokalisasi yang menonjol dari filamen aktin ke daerah kortikal dari sel dan generasi dari serat yang dititikberatkan akan melintasi sel (Gambar 1F). Jadi, pengobatan sel BeWo dengan AZA menghasilkan konversi morfologi sel BeWo ke fenotip nonmotile.

Selanjutnya penulis memeriksa kemampuan dari AZA untuk membatalkan migrasi dan sifat invasif dari sel BeWo menggunakan penyembuhan luka (Gambar 2A), dan uji migrasi (Gambar 2B), masing-masing. pengobatan sel BeWo dengan AZA sebagian besar membatalkan kemampuan sel untuk bermigrasi sepanjang garis demarkasi. Berkurangnya migrasi dan invasi sel BeWo yang diobati dengan AZA (Gambar 2C), dibandingkan dengan sel yang tidak diberi AZA, diamati dalam suatu proses pengujian. Sel BeWo menunjukkan fenotipe nonmigratori setelah pengobatan AZA tidak mampu melewati matrigel seperti halnya kontrol selsel yang diperlakukan seperti kendaraan (Gambar 2C).

Gambar 1. Penghambatan metilasi menghasilkan fenotip kurang invasif di sel BeWo. Morfologi sel BeWo diperiksa oleh mikroskop fase kontras dalam sel yang diberikan atau tidak diberikan 10 M AZA (A). FITC-phalloidin digunakan untuk memvisualisasikan organisasi dari filamen aktin sebagai respon terhadap AZA, di bawah 10x (B dan E) dan 40x pembesaran (C dan F).

Gambar. 2. Penghambatan metilasi menurunkan migrasi dan invasi sel dalam sel trofoblas. Daerah luka diamati di bawah 20x perbesaran dengan panah yang menunjukkan tepi luka (A dan B). Migrasi dan invasi sel BeWo dihitung dalam tidak adanya (kendaraan) atau adanya 10 M AZA (C). Data mewakili rata-rata dan SD dari sampel rangkap tiga. Tanda bintang menunjukkan signifikan statistik pada P< 0,05.Penghambatan metilasi meningkatkan ekspresi plakoglobin dan Ecadherin dalam sel BeWo

Pengobatan dengan AZA pada sel BeWo concordantly meningkatkan kadar protein dari plakoglobin oleh 50% 1,2% dan E-cadherin oleh 44,6% 4,5%, seperti yang diamati oleh Western blot analysis (Gambar 4A). Sekali lagi, -aktin digunakan sebagai ekspresi dan kontrol pemuatan dan tidak terdapat perubahan di antara kondisi eksperimental. Lokalisasi yang tepat dari plakoglobin dan E-kaderin ke lokasi komunikasi interseluler diperlukan untuk menghasilkan fungsi yang baik dari AJ (30). Oleh karena itu kami menggunakan mikroskop confocal laser scanning untuk memeriksa efek inhibisi dari DNA methyltransferase dengan AZA pada lokalisasi plakoglobin dan E-kaderin di sel BeWo. Kami mengamati bahwa pengobatan sel BeWo dengan AZA meningkatkan lokalisasi dari plakoglobin dan Ecadherin ke lokasi/tempat komunikasi/kontak interseluler (Gambar 4B). Dengan demikian, penghambatan metilasi dalam sel BeWo mengakibatkan peningkatan ekspresi dari plakoglobin dan Ecadhderin oleh aktivasi transkripsi dari promotor

Ekspresi seiring plakoglobin dan E-kaderin diperlukan untuk penghambatan motilitas sel BeWoEkspresi dari plakoglobin dan E-cadherin adalah negatif terkait dengan migrasi seluler (31, 32) dan ekspresi yang dipaksa baik dari protein telah ditunjukkan untuk mengembalikan sel menjadi suatu fenotip epitel dan mencegah migrasi (27,33). Peningkatan ekspresi dari plakoglobin dan Ecadherin yang diamati pada pengobatan dengan AZA pada sel BeWo dapat bertanggung jawab atas penghambatan migrasi oleh AZA yang diamati pada sel BeWo. Karena itu kami menguji pengaruh ekspresi yang dipaksa dari plakoglobin dan E-cadherin pada motilitas sel BeWo. Sel BeWo secara sementara tertransfiksi dengan pengkodean vektor ekspresi dari plakoglobin dan E-cadherin manusia dan diuji untuk mengetahui kemampuan mereka untuk bermigrasi dalam ruang transwell. Ekspresi yang dipaksakan dari plakoglobin atau E-cadherin menghasilkan penghambatan sederhana tapi signifikan dari motilitas sel, sedangkan bersamaan ekspresi paksa dari plakoglobin dan E-cadherin secara signifikan menghambat kemampuan sel BeWo untuk bermigrasi di ruang transwell (Gambar 5A). Ekspresi dipaksa dari plakoglobin dan E-cadherin mengakibatkan peningkatan ekspresi protein oleh masing-masing 49,8% 2,3% dan 31,5% 2,5%, sebagaimana ditentukan oleh analisis Western blot (Gambar 5B). Jadi, ekspresi sederhana yang ditingkatkan oleh plakoglobin dan Ecadherin cukup untuk menghambat migrasi sel trofoblastik.

04

DISKUSI & KESIMPULAN

Ektoderm trofoblastik dari embrio yang sedang berkembang diperlukan untuk perlengketan dan kemudian invasi ke dalam endometrium uterus, dan luasnya invasi dari trofoblastik primer menentukan efisiensi plasenta selanjutnya, kelangsungan hidup janin dan kinerja (34). Secara signifikan, hanya 22,8% dari hasil konsepsi menghasilkan kelahiran hidup dan banyak dari konsepsi itu tidak berkembang untuk lahir hidup karena kegagalan implantasi embrio (35). Jadi, penggambaran dari mekanisme molekuler yang mengatur migrasi sel trofoblastik sangat penting untuk memahami regulasi yang tepat dari plasentasi.

Pada sel epitel, beberapa AJ memainkan peran penting dalam pemeliharaan adhesi sel-sel, dan hilangnya fungsi AJ mengakibatkan disosiasi sel-sel (30) dan sangat terlibat dalam perkembangan dan metastasis tumor (32, 36). Dalam jaringan neoplastik, represi dari ekspresi gen plakoglobin dan E-kaderin merupakan langkah penting dalam memungkinkan sel tumor untuk bermigrasi dan menyerang jaringan sekitarnya (27, 33, 37-39). Dalam hal ini, hipermetilasi dari E-cadherin dan baru-baru ini juga promotor plakoglobin telah didokumentasikan dengan baik dalam banyak jenis kanker pada manusia termasuk kanker paru-paru (40), kanker ovarium (41), kanker prostat (42) dan karsinoma sel ginjal (43), sehingga menghasilkan penurunan ekspresi gen PLAKOGLOBIN dan E-CADHERIN (39, 42, 44).

Gambar. 7. Migrasi sel BeWo dihambat oleh deplesi gabungan DNMT-3a dan DNMT-3b. Migrasi sel BeWo ditentukan dalam ketiadaan atau kehadiran vektor ekspresi siRNA DNMT sendiri atau dalam kombinasi, seperti yang ditunjukkan. Vektor dengan urutan acak digunakan sebagai kontrol. Data mewakili rata-rata dan SD dari sampel rangkap tiga. Tanda bintang menunjukkan signifikansi statistik pada P