Pseudovitamin B adalah corrinoid dihasilkan oleh Lactobacillus reuteri CRL1098 dalam kondisi anaerob

Abstrak Kami telah dilaporkan sebelumnya pada kemampuan Lactobacillus reuteri untuk menghasilkan senyawa dengan aktivitas vitamin B. Di sini kita melaporkan karakterisasi kimia molekul oid seperti ini corrin. Kromatografi cair kinerja tinggi digabungkan ke ultraviolet dioda detektor array, spektrometri massa dan spektroskopi resonansi magnetik nuklir telah memungkinkan kita untuk mengidentifikasi senyawa sebagai Coa- [a- (7-adenyl)] - Cob-cyanocobamide atau pseudovitamin B. Molekul ini ers di ff dari cobalamin di a-ligan, di mana ia memiliki adenin bukan 5,6-dimethylbenzimidazole terikat dalam sebuah hubungan-glikosidik ke C-1 dari ribosa. L. reuteri adalah pertama bakteri asam laktat di mana produksi molekul cobalamin seperti telah diidentifikasi dan mikroorganisme pertama dilaporkan untuk menghasilkan eksklusif pseudo-B

.

1. Perkenalan

Lactobacillus reuteri adalah Gram-positif, heterofermentative bakteri asam laktat, sering ditemukan dalam saluran pencernaan manusia dan hewan lainnya. Sifat probiotik yang relevan seperti penurunan kadar kolesterol darah, dan aktivitas anti-peradangan langsung telah menunjukkan untuk mikroorganisme ini. Selama pertumbuhan pada glukosa dan di hadapan gliserol, L. reuteri memiliki kemampuan untuk memproduksi dan mengeluarkan reuterin (Gbr. 1). Antimikroba spektrum luas ini merupakan campuran dari monomer, terhidrasi bentuk dimerik monomer dan siklik dari 3 hydroxypropionaldehyde (3-HPA). Sintesis reuterin dimediasi oleh enzim tergantung B, gliserol dehidratase, yang mengkatalisis konversi gliserol 3-HPA. Kami telah melaporkan, sebelumnya, bahwa senyawa terisolasi di

bentuk siano yang dari L. reuteri CRL1098 mampu fi ful lling yang auksotrofik B

persyaratan tiga strain indikator. Dalam studi yang sama, DNA-urutan diprediksi untuk mengkodekan enzim dari jalur anaerobik B biosintesis yang diidentifikasi

dalam kromosom dari L. reuteri. Berbagai macam vitamin B 12 analog dapat ditemukan di alam. Mereka berbagi arsitektur struktural yang terdiri dari cincin corrin dengan ion kobalt chelated pada intinya. Cobalamin, yang corrinoid terbaik dipelajari, adalah cobamide di mana 5,6-dimethylbenzimidazole (DMB) adalah aglikon melekat pada sebuah-ligan

terikat dalam sebuah hubungan glikosidik-dari N-1 kepada-C 1 dari ribosa. B biosintesis hanya ditemukan di beberapa prokariota. Beberapa telah dijelaskan untuk mensintesis B

analog yang mengandung basa dalam sebuah-ligan selain DMB, yaitu Benzimidazole lainnya, purin dan senyawa fenolik. Di sini kita melaporkan karakterisasi kimia dari molekul corrinoid seperti terisolasi dari L. reuteri di cyanided nya

untuk m. Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) digabungkan ke dioda ultraviolet detektor array (UV-DAD) diikuti dengan spektrometri massa dan spektroskopi resonansi magnetik nuklir, kami telah menyimpulkan bahwa corrinoid yang dihasilkan

oleh L. reuteri CRL1098 dibudidayakan dalam kondisi anaerob adalah pseudovitamin B. Pertama kali dilaporkan pada tahun 1952 oleh P kelima er et al B12 analog ini ers di ff dari cobalamin di sebuah-ligan, di mana DMB muncul diganti dengan adenin. Karena sebagian besar struktur kekal, telah menyarankan bahwa molekul ini bisa berperan dalam menilai kemampuan enzim tergantung B untuk memanfaatkan kofaktor alternatif,

dan dalam memahami dampak B12 analog vitamin B 12

metabolisme

2. Bahan dan metode

2.1. Persiapan budaya dan sel-ekstrak

Budaya L. reuteri CRL1098 diinokulasi dalam media uji vitamin B-bebas (Difco), tumbuh pada 37? C selama 16 jam dan ditransfer tiga kali. Kondisi pertumbuhan ff erent dua di, dengan dan tanpa menambahkan DMB (100 mg / l), yang digunakan dalam studi ini. Sel-ekstrak dibuat dari 10 L kultur batch yang fl ushed dengan campuran 95% N, yang mengandung sekitar 50 lg = L dari corrinoid. Setelah panen, sel dicuci dua kali dalam 0,1 M fosfat bu ff er, pH 7,0, disuspensi kembali dalam 10 mL bu ekstraksi ff er terdiri dari 0,1 M Na dan 5% CO 2 HPO42, pH 4,5 (asam sitrat) dan mengandung 0.005% KCN. Suspensi sel dipisahkan dalam 10 aliquot 1 mL masing-masing, terganggu dengan 1 g manik-manik kaca (0,1 mm diameter) dalam FastPrep FP120 (Qbiogene, 122)

Carlsbad, California.) Dan lagi digabungkan. Ekstraksi bu ff er kemudian

ditambahkan sampai volume fi nal dari 20 mL dan diautoklaf (120? C untuk

15 menit). Campuran dibersihkan dengan sentrifugasi (8000 g untuk

10 menit), dan supernatan melewati sebuah Isolute fase padat

ekstraksi (SPE) kolom (500 mg C18 end-capped kolom dengan 3 ml a

volume reservoir) yang sebelumnya diaktifkan dengan 2 ml asetonitril.

Kolom dicuci dua kali dengan 2 volume air suling untuk menghilangkan

garam dan kontaminan hidrofilik lainnya. Selanjutnya, corrinoid yang

dielusi dengan 1 volume 50% asetonitril dan terkonsentrasi

sampai kering dalam vakum pada 30? C. Residu dilarutkan dalam 5 ml steril

air suling dan disimpan dalam gelap pada? 20? C sampai digunakan lebih lanjut.

2.2. Isolasi Corrinoid

Corrinoid itu dimurnikan dari sel-ekstrak L. reuteri oleh reverse

kromatografi fase cair kinerja tinggi (RP-HPLC) dengan

Waters (Milford, MA) 600E sistem gradien otomatis controller, sebuah

250 dengan 3-mm Betasil kolom fenil (Thermo Hypersil-Keystone,

Waltham, MA), dan Array SPD-M10A VP Diode Detector (Shimadzu

Korporasi, Kyoto, Jepang). Fraksi menunjukkan UV-DAD

spektrum yang sama dengan cyanocobalamin dikumpulkan secara manual

dan lyophilised pada 30? C.

2.3. Spektrometri massa

Sampel dikumpulkan dari RP-HPLC dilarutkan dalam 100 llof

larutan air yang mengandung 30% asetonitril dan 0,1% asam format.

Spektrometri massa analisis dari corrinoid puri fi kasi dari L. reuteri

dilakukan pada triple-quadrupole spektrometer massa Quatro II

(Micromass, Inc., Altrincham, Inggris) yang dilengkapi dengan electrospray ion-

isasi (ESI) penyelidikan, dioperasikan dalam modus ion positif. Percobaan

dilakukan dengan ketentuan sebagai berikut: tegangan kapiler

4.2 kV, kerucut tegangan 36 V, tegangan ekstraksi 5 V, suhu sumber

80? C, suhu desolvation 120? C.

2.4. Spektroskopi resonansi magnetik nuklir

Resonansi magnetik nuklir Proton (

1

H NMR) spektrum diperoleh

pada spektrometer Bruker DRX500 (Bruker, Rheinstetten, Jerman)

menggunakan 5 mm penyelidikan terbalik-deteksi kepala. Sampel puri fi kasi

dari RP-HPLC lyophilised pada 30? C dan dilarutkan dalam 10%

D

O, yang memungkinkan deteksi resonansi amida. Spectra dicatat

di 303 K dengan pra-saturasi sinyal air, menggunakan 8,25 s

lebar pulsa yang berhubungan dengan 75? sudut ip fl dan penundaan pengulangan

3s.

2

3. Hasil

Selama pemurnian, UV-DAD spectra data dan retensi

kali diperoleh RP-HPLC analisis menunjukkan bahwa L. reuteri

CRL1098 tumbuh di bawah kondisi anaerob menghasilkan satu

cobalamin seperti molekul besar, dalam rasio P100: 1 sehubungan

spesies corrinoid kecil lainnya. The identifikasi dan karakterisasi

dari cobamide utama yang dihasilkan oleh ini

ketegangan didasarkan pada penerapan tiga di teknik ff erent:

RP-HPLC isolasi digabungkan ke spektrum UV-DAD

tekad, analisis spektrometri massa dan spektroskopi NMR

studi.

3.1. Isolasi Corrinoid

Untuk mengisolasi dan memurnikan corrinoid asli diproduksi oleh L.

reuteri, sel-ekstrak dielusi pada kolom C18-SPE diikuti

RP-HPLC. Sel-ekstrak dari L. reuteri mengungkapkan

puncak dengan waktu retensi 36,31 menit (Gambar. 2A). Meskipun

puncak ditampilkan spektrum UV-DAD yang sama, retensi ini

Waktu tidak setuju dengan salah satu standar cyanocobalamin

(37,83 menit). Spektrum standar menunjukkan puncak

absorbansi maksimal pada 350 nm dan dua lainnya di 512 dan

550 nm, masing-masing. Pola yang sama diamati ketika

yang cobamide terisolasi diproduksi oleh L. reuteri dianalisis

(Gambar. 2B). Pola kromatografi identik dan UV-spektrum

dicatat untuk corrinoids diisolasi dari L. reuteri

CRL1098 tumbuh di ada atau tidaknya DMB.

3.2. Spektrometri massa

Data spektrometri massa (Gambar. 3) yang diperoleh untuk corrin- yang

OID diproduksi oleh L. reuteri memberikan bukti bahwa lengkap

molekul memiliki nilai m / z sangat mirip dengan salah satu dari Methylcobalamin,

1.344,6 dan 1.344,8, masing-masing. Dalam kedua massa

spektrum senyawa terisolasi dan dari standar,

puncak sesuai dengan perpindahan dari kedua b-ligan

bersama dengan ribosil terikat aglikon (m / z 1.183,6) dan cobinamide

(M / z 971,6) yang diidentifikasi. Kehadiran puncak tersebut dalam

spektrum massa sampel kami sangat sugestif bahwa itu adalah

memang B

analog.

Namun, ketika semua sinyal ditampilkan pada spektrum massa

12

dianggap secara rinci, fraksi-fraksi di mana hanya bagian atas

ligan tidak hadir, mengungkapkan variasi massa 15,1 untuk

standar Methylcobalamin (m / z 1.329,7) dan 26,0 untuk

senyawa hasil isolasi (m / z 1.318,6), sesuai dengan perpindahan

dari metil dan siano radikal, masing-masing. Ini

tersirat bahwa a-ligan Methylcobalamin dan terisolasi

senyawa di ff ered sekitar 11 unit massa.

Sebuah puncak dengan nilai m / z dari 359,3 adalah diidentifikasi di methylcobalamin

standar, tapi tidak dalam corrinoid puri fi kasi dari

L. reuteri. Puncak ini berasal dari ligan yang lebih rendah di mana

DMB adalah aglikon terpasang oleh glikosil terikat dari N-1

ke C-1 dari ribofuranose 3-fosfat. Sebaliknya, puncak lain

hadir dalam spektrum massa corrinoid puri fi kasi dari

L. reuteri dengan nilai m / z dari 348,2, sekali lagi menyiratkan

variasi massa sekitar 11 di a-ligan. Lebih Lanjut,

puncak dengan nilai m / z dari 456,9 dan 486,5, sesuai

untuk berlainan fraksinasi di mana cincin corrin

dan ligan atas mengungsi (Gambar. 4A), bisa diidentifikasi

dalam standar methylcobalamin tapi tidak di corrinoid yang

puri fi kasi dari L. reuteri. Oleh karena itu, kemungkinan bahwa senyawa

diproduksi oleh L. reuteri memiliki DMB di ligan rendah

dikesampingkan.

Spektrum massa direkam untuk senyawa terisolasi

menunjukkan puncak sesuai dengan tunggal perpindahan

yang siano radikal (m / z 1.318,6), yang sesuai dengan

substitusi dalam ligan yang lebih rendah dari bagian DMB oleh

adenin. Juga puncak diamati dengan nilai m / z dari 348,2

dikuatkan substitusi ini, dan dengan demikian, menjelaskan di ff eh

ence dari 11 unit massa yang disebutkan di atas. Pengamatan ini tersirat

bahwa corrinoid diekstrak dari L. reuteri benar-benar

Coa- [a- (7-adenyl)] - Cob-cyanocobamide, umumnya dikenal sebagai

pseudo-B

. Selain itu, puncak diamati pada spektrum

dengan nilai m / z dari 433,3 dan 457,1 konsisten dengan ini

12

diusulkan struktur dan mewakili berlainan terpecah dari

lebih rendah ligan yang mengandung adenin bukan DMB

(Gambar. 4B).

3.3. Spektroskopi resonansi magnetik nuklir

Selain itu,

1

H NMR diambil dari corrinoid yang

puri fi kasi dari L. reuteri (Gbr. 5) menunjukkan kesamaan mencolok

dengan menerbitkan NMR spektrum pseudovitamin B

. Sebenarnya,

perbandingan antara sinyal yang diperoleh dan yang diperoleh

untuk pseudovitamin B

oleh manusia et al Ho ff. [17] menunjukkan hanya enam

sinyal yang tidak hadir dalam spektrum diterbitkan. Akan Tetapi,

Sinyal ini juga tidak hadir dalam spektrum lainnya

corrinoids, dan oleh karena itu, kita telah mengasumsikan mereka disebabkan

baik oleh kontaminan kecil (puncak ditandai 2, 4 dan 5 di

Gambar. 5), atau dengan bahan yang digunakan selama persiapan sampel

(Puncak ditandai 1, 3 dan 6 pada Gambar. 5). Selain itu, kehadiran

dalam

1

12

H NMR spektrum sinyal yang tajam karakteristik

sekitar 8 ppm merupakan indikasi yang sangat unshielded aromatik

proton dalam struktur, yang, dengan sendirinya, aturan keluar identifikasi

dari corrinoid sebagai cobalamin atau faktor A, kedua molekul

kurang proton tersebut. Pseudovitamin B

, Di sisi lain,

memiliki proton tersebut dalam strukturnya.

A

1

12

H korelasi homonuclear spektrum direkam dan

menunjukkan tidak ada korelasi terlihat tiga sinyal di bawah lapangan

(8-9 ppm) (data tidak ditampilkan). Hal ini sesuai dengan

struktur yang diusulkan untuk sebuah-ligan dari corrinoid asli

L. reuteri, dan menolak kemungkinan adanya

[N8-metil] -adeninyl-cobamide.

12

4. Diskusi

The corrinoid diekstraksi oleh L. reuteri dalam kondisi anaerob

telah diidentifikasi sebagai Coa- [a- (7-adenyl)] - Cob-cyanocobamide,

umumnya dikenal sebagai pseudovitamin B

. Itu

Hasil yang diperoleh melakukan spektrometri massa dan nuklir

spektroskopi resonansi magnetik memungkinkan kita untuk mengidentifikasi

corrin cincin dengan atom kobalt pada intinya, siano radikal

sebagai b-ligan, dan adenin sebagai aglikon terikat oleh glikosil a

link dari N-1 ke C-1 dari ribosa membentuk

a-ligan.

Selama pemurnian dari corrinoid diproduksi oleh L. reuteri,

yang selisih di ff dalam waktu retensi antara sampel dan

standar cyanocobalamin disarankan disebabkan oleh perbedaan

di negara fosforilasi molekul. Ini adalah

didukung oleh laporan sebelumnya pada sintesis in vitro dari

cobalamin nukleotida lingkaran [18], di mana, senyawa itu

diidentifikasi sebagai cyanocobalamin-5

0

-phosphate menggunakan spektrometri massa.

Berdasarkan hal ini, kami mengumpulkan puri fi kasi molekul

dengan sama UV-DAD spektrum sebagai cyanocobalamin dan dilakukan

analisis spektrometri massa untuk characterisa- molekul

tion. Mengingat semua analog cobalamin dikenal [12],

12

pseudovitamin B

adalah satu-satunya dengan penuh konsistensi spektral

berdasarkan spektrum massa dikumpulkan. Analog ini memiliki

struktur mirip dengan cobalamin kecuali untuk ligan yang lebih rendah,

di mana, yang bagian DMB diganti dengan adenin.

Hasil spektrometri massa dilaporkan di sini memungkinkan identifikasi

dari beberapa puncak sesuai dengan fraksinasi dari

ligan yang lebih rendah yang mengandung basis adenin (Gambar. 3B). Tambahan

Studi NMR dilakukan untuk con fi rm identitas

dari corrinoid tersebut. Gabungan dari semua informasi spektral

mengakuisisi menjelaskan bahwa corrinoid yang diekstrak dari

L. reuteri memang pseudo-B

12

.

Baru-baru ini, para Blub gen telah terbukti diperlukan untuk

12

biosintesis aerobik DMB di Sinorhizobium meliloti [19].

Hal ini terlibat dalam fragmentasi dan kontraksi fl avin

mononukleotida untuk membentuk

DD-erythrose 4-fosfat dan DMB

dengan adanya oksigen. Genom se- baru-baru ini dirilis

quence L. reuteri JCM1112 (DOE Joint Genome Institute,

GeneBank Aksesi no. CP000705) tidak memiliki homolog

Blub dan pertumbuhan bakteri asam laktat ini terganggu

dengan adanya oksigen. Akibatnya, kita mempertimbangkan

Kehadiran jalur tersebut dalam L. reuteri menjadi tidak mungkin. Salmo-

nella enterica telah dilaporkan untuk dapat menggabungkan exog-

DMB pribumi ke dalam ligan yang lebih rendah menghasilkan cobalamin [20].

Kita tidak bisa mendeteksi perilaku yang sama untuk L. reuteri

CRL1098, yang tidak benar-benar tak terduga. Keduanya fenotip

dan filogenetis, dua spesies ini cukup berbeda,

dan dengan demikian, tidak mengherankan bahwa mereka memiliki berlainan

kapasitas serapan.

Beberapa genera cyanobacteria telah dilaporkan mengandung

pseudo-B

12

antara lain corrinoids [21,22]. Hal yang sama berlaku

untuk Clostridium cochlearium [17], yang lain bakteri Gram-positif

dengan kandungan G + C rendah dalam DNA-nya. Menariknya, L. reuteri

adalah mikroorganisme pertama dilaporkan biosynthesize

pseudovitamin B

12

sebagai produk corrinoid yang satunya. Pseudo-B

tidak tersedia secara komersial dan sampai sekarang pasokan memiliki jadi-

lely mengandalkan biosintesis dipandu atau sintesis kimia [23-25].

12

Vitamin B

dan beberapa analog yang bertindak sebagai kofaktor, katalis

metil transfer dan karbon-backbone penataan ulang

reaksi. Perbandingan kofaktor e FFI keampuhan dari erent di ff

analog memungkinkan penjelasan enzyme yang kompleks

interaksi kofaktor. Penelitian selanjutnya dari kemampuan B

12

tergantung

enzim untuk menggunakan pseudo-B

sebagai kofaktor, dapat mengandalkan

pada L. reuteri untuk penyediaan. Pada akhirnya, ini akan membantu dalam

yang ortir e ff untuk menjelaskan relevansi ligan yang lebih rendah dan

Co-N koordinasi untuk aktivitas enzimatik.

Pada manusia, dalam studi vitro pada B

12

mengikat protein memiliki

menunjukkan bahwa hanya faktor intrinsik dapat menyajikan sebuah hambatan nyata

untuk penyerapan pseudo-B

12

12

[25]. Namun, perbandingan

in vivo membentuk keampuhan e FFI B

a-ligan selain DMB untuk memperbaiki B

12

12

analog dengan

defisiensi tetap

12

harus dilakukan. L. reuteri adalah bakteri asam laktat fi pertama dilaporkan

untuk menghasilkan molekul cobalamin seperti. Selain sistem

memproduksi pseudovitamin B

ditandai di sini,

kemungkinan untuk insinyur produksi corrinoids lain

saat ini sedang diselidiki. L. reuteri memiliki GRAS

Status (umumnya dianggap aman), dan oleh karena itu, bisa

akhirnya dapat digunakan untuk meningkatkan nilai gizi fermentasi

makanan dan pakan produk.

12