PETUNJUK TEKNISPRAKTIKUM PATOLOGI KLINIK

Disusun Oleh:Assisten Patologi Klinik

LABORATORIUM PATOLOGI KLINIKFAKULTAS KEDOKTERAN HEWANUNIVERSITAS GADJAH MADAYOGYAKARTA2014

ERITROSIT

PENGHITUNGAN ERITROSIT1. PENGISIAN PIPET Gunakan pipet eritrosit standar yang bertanda 101, kemudian hisap darah sampai tanda 0,5. Jika darah melebihi tanda 0,5, maka darah dapat dikeluarkan dengan membuka jari dan ujung pipet dibersihkan dengan kertas saring atau tisu. Reagen : Larutan Gower Natrium sulfat anhidrous: 12,3 g Asam asetat glasial: 33,3 gAkuades: 200,0 ml Larutan HayemMerkuri klorida: 0,5 gNatrium klorida: 1,0 gNatrium sulfat: 5,0 gAkuades: 200,0 ml Larutan garam NaCL fisiologis a. Ujung pipet harus bersih (tidak boleh ada sisi darah) sebelum memasukkan pipet ke dalam larutan reagen. Larutan dihisap sampai tanda 101. Darah diencerkan dengan perbandingan 1: 200.b. Tempatkan pi[pet secara horizontal dan letakkan jari pada ujing tabung sebelum pipa karet ditarik.c. Pipet dibolak-balikan agar dapat campur homogen. Caranya tempatkan pipet horizontal, tutup ujung-ujungnya dengan jari telunjuk dan ibu jari kemudian gerakkan membentuk angka 8.

2. MENGHITUNG ERITROSITa. Daerah yang bergaris-garis dari homositometer dan kaca penutup harus dibersihkan dengan kertas tisu secara hati-hati.b. Tempatkan kaca penutup di atas kamar/bilik hitung (counting chamber) improved Neubaur ruling hemocytometer. Jagalah jangan sampai mengalir ke dalam parit di pinggirnya. Biarkan beberapa menit supaya sel-sel mengelilingi parit, perlu dihindari terhadap terjadinya evaporasi (penguapan) karena akan menyebabkan kesalahan.c. Periksa di bawah mikroskop, dengan perbesaran kecil cari ruang tengah dari 9 ruangan besar (lihat Gambar )d. Kemudian dengan perbesaran kuat, hitung semua eritrosit dalam 5 kotak dari 25 ruangan kecil. Tiap kotak (5 kotak) masing-masing dibagi menjadi 16 ruangan kecil. Jadi yang dihitung 80 ruangan kecil. Penghitungan dimulai dari ruangan kiri atas dari 4 persegi kecil ke kanan, kemudian dari baris kedua dari kanan ke kiri dan seterusnya.

Ketentuan untuk triple lines : sel-sel yang menempel pada garis atas dan kiri (garis yang tengah) dihitung, sedang yang menempel pada garis kanan dan bawah tidak dihitung. Ketentuan untuk double ruling : sel-sel yang menempel pada dinding atas dan garis luar kiri dihitung, yang pada garis bawah dan kanan tidak dihitung. Perhitungan : : Sel-sel yang terhitung X 10 (0,1 mm kedalam Haemocytometer) X 5 (1/5 dari 1 mm) X 200 (1 : 200) = jumlah eritrosit per mm.

3. PENETAPAN KADAR HEMOGLOBINa. Pemeriksaan dengan cara TalquistCara: Hisaplah darah pada kertas filter/ saring yang sudah tersedia dalam buku Talquist, kemudian cocokkan dengan warna standar secara seri pada kertas litographic yang menunjukkan kadar hemoglobin 10-100%. Pembacaan dalam g/100 ml darah. Cara ini tidak direkomendasikan karena hasilnya kurang akurat. Dalam hal ini mempunyai error atau kesalahan 30-50%. b. Pemeriksaan dengan hemoglobinometer SahliPada cara ini, warna akan dihasilkan pada larutan uji yang kemudian dibandingkan dengan larutan standar. Reagen : Asam klorida 0,1 NCara : Isilah tabung gelas dari hemoglobinometer Sahli dengan HCL 0,1 N sampai angka 10. Hisaplah darah (langsung dari hewan atau dari darah yang sudah diberi antikoagulan) sampai tanda garis (pada pipet hemoglobin 0,02 ml) Bersihkan pipet dengan kertas saring atau tisu. Tiuplah darah tersebut ke dalam tabung yang berisi HCL (ujung pipet terendam dalam cairan) dan cucilah pipetnya beberapa kali dengan menghisap dan meniupkan kembali larutan tersebut. Tunggulah kira-kira 5-10 menit. Tambahkan bertetes-tetes akuades (aduk baik-baik) sampai warnanya cocok dengan warna standar. Pembacaan dilakukan dengan angka Sahli atau mg% atau g/100 ml darah. Kalkulasi konsentrasi Hb dalam g/100 ml darah. Jika standar warna dinyatakan 100% mengandung 14,8 g, maka dapat dilakukan penghitungan sebagai berikut: 14,8 x pembacaan angka Sahli pada tabung = ------------------------------------------------------ 100 Angka kesalahan dapat mencapai 100% dengan cara visual ini. Pada kondisi anemia berat, angka kesalahan dapat besar karena warna yang dihasilkan sangat pucat dan tidak dapat dibandingkan dengan warna standar secara jelas.

c. Pemeriksaan dengan spektrofotometerCara: Tambahkan 0,02 ml darah ke dalam tabung uji yang telah mengandung 5 ml larutan Drabkins. Campurkan dengan baik dan biarkan selama 10 menit. Bacalah blangko yang mengandung larutan Drabkins pada panjang gelombang 540 m. Warna ini stabil ttapi tidak permanen. Kemudian angka yang diperoleh dicocokkan dengan data standar pada table yang tersedia.

4. PENETAPAN NILAI HEMATROKITCara: Isilah tabung mikrokapiler yang khusus dibuat untuk penetapan mikrohematokrit dengan darah sampai tabung. Tutuplah ujung satu dengan bahan penutup khusus. Masukkanlah tabung kapiler itu ke dalam sentrifus khusus yang mencapai kecepatan lebih dari 16.000 rpm (setrifus hematokrit). Pusingkanlah selama 3-5 menit. Bacalah nilai hematokrit dengan menggunakan grafik atau alat khusus.

5. PENETAPAN TOTAL PROTEIN PLASMA (TPP) DAN FIBRINOGENCara: Mikrohematokrit pada pemeriksaan PCV diatas dipotong pada lapisan plasmanya. Selanjutnya plasma diteteskan pada alat TS-meter. Kemudian dilihat kandungan total proteinnya pada alat tersebut (dalam g/100 ml). Untuk pemeriksaan kadar fibrinogennya, satu mikrohematokrit yang lain dipanaskan dengan suhu 56-58C dalam waterbath selama 2 menit. Selanjutnya disentrifus selama 5 menit, setelah itu lapisan plasma yang jernih dipotong dan diteteskan pada alat TS-meter. Kemudian dilihat kadar fibrinogennya pada alat tersebut (dalam g/100 ml).

PENETAPAN NILAI MCV, MCH, MCHCa) MCV = Mean Corpuscular Volume = nilai rata-rata volume eritrosit MCV = PCV (%) x 10 ----------------------------- jumlah eritrosit (jt/mm)Misal : MCV = 45% x 10 ------------- 5 = 90 /fl (femtoliter)b) MCH = Mean Corpuscular Hemoglobin = nilai rata-rata kandungan hemoglobin pada eritrosit MCH = Hb (g/100 ml) x10-----------------------------jumlah eritrosit (jt/mm) Misal : MCH = 15 x 10 ----------- 5 = 30 g (mikro mikro gram) / pg (picogram) c) MCHC = Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration = nilai rata-rata konsentrasi hemoglobin pada setiap eritrosit MCHC = Hb (g/100 ml) x 100 --------------------------PCV (%) Misal : MCHC = 15 x 100 ------------45= 33,3%

LEUKOSIT

I. PENGHITUNGAN LEUKOSIT1. Alat dan Bahana. Sampel darah.b. Reagen yang digunakan: Larutan Turk ato Rees Eckerc. Kamar hitungd. Mikroskope. Pipet leukosit 11f. Deck glass

2. Metode:a. Hisap darah dengan pipet leukosit sampai 0,5b. Kemudian ditambahkan reagen larutan Turk sampai angka 11c. Campur homogen dengan memutar pipet membentuk angka delapan.d. Teteskan sampel yang telah homogen dikanan/kiri kamar hitung.e. Lihat dan hitung menggunakan mikroskop perbesaran 10xf. Metode Penghitungan: Cari 9 runag besar, kemudIan hitung Jumlah leukosit pada 4 ruang besar dari 9 ruang sebelumnya.

II. DIFERENSIASI LEUKOSIT1. TUJUAN Mengetahui morfologi masing-masing leukosit Mengetahui jumlah relatif dan jumlah absolut leukosit

2. FUNGSI UTAMA Respon sistemik individu Derajat virulensi agen penyakit Derajat keparahan dari proses penyakit Lamanya proses penyakit

Leukosit Granulosit Neutrofil Eosinofil Basofil Agranulosit Monosit LImfositNeutrofil Mengandung granula yang memberikan warna indefereent dan tidak merah ataupun biru. Merupakan komponen terbesar dari leukosit Fungsi utama dalam fagositosis dan bakterisidal.

Eosinofil Tampak sebagai granula berwarna merah di sitoplasmanya Pada umumnya ada 10% dari total leukosit Granula biasanya sedikit, ameboid, dan beberapa fagositosis.

Basofil Tampak sebagai granula berwarna biru dan jarang terdapat dalam darah normalnya. Granula mengandung heparin yang mencegah blood clotting.

Monosit Merupakan sel terbesar dari komponen leukosit yang lain. Bersifat fagositik dan berkembang sebesar makrofag ketika keluar dari sirkulasi darah dan masuk ke jaringan.Limfosit Merupakan sel yang sering ditemukan dalam leukosit setelah neutrofil terutama pada ruminansia. Ukuran dan penampilannya bervariasi dengan nucleus yang relatif besar, dikelilingi sejumlah sitoplasma. Fungsi utama berupa respon terhadap benda asing dengan membentuk antibody. Sitoplasma terwarnai biru terang dan mengandung sedikit organela. Berdasarkan fungsinya terbagi menjadi 3 yaitu: Limfosit B Limfosit T NK (Natural Killer cell)Ketiganya tidak dapat dibedakan secara morfologi.

III. PEMBUATAN PREPARAT APUS DARAH Sampel darah dicampur dengan baik sebelum diambil dengan pipet kapiler/batang gelas. Satu tetes kecil darah diletakkan dekatv dengan ujung gelas obyek. Tempatkan gelas obyek yang kedua dengan bagian ujumg menyentuh permukaan gelas obyek yang pertama sehingga membentuk sudur 30-45. Tariklah gelas obyek ke samping dan biarkan darah mengalir dengan daya kapiler, sehingga mencapai bagian gelas obyek. Selanjutnnya doronglkah gelas obyek kedua dengan sudut yang sama sehingga membentuk lapisan yang tipis. Tebalnya preparat apus tergantung pada besarnya tetesan darah, sudut yang terbentuk dan kecepatan dorongan. Biarkan preparat apus mengering di udara terbuka. Pengeringan tidakl boleh dengan cara pemanasan atau peniupan, sebaiknya dengan cara mengayun-ayunkan preparat yang kita pegang. Keriputnya eritrosit disebabkan pengeringan yang lambat. Untuk mendapatkan hasil yang baik maka proses pewarnaan tidak boleh lebih dari 1 jam setelah pembuatan preparat apus. Jika karena sesuatu sebab pewarnaan tidak dapat segera dilakukan maka preparat apus difiksir dengan metil alkohol (methanol).

IV. PEWARNAAN GIEMSAReagen Giemsa : 1 tetes pewarna Giemsa stock dilarutkan dalam akuades buffer 1 ml. Cara : Preparat apus darah difiksir dengan methanol selama 3-5 menit. Preparat kemudian dibiarkan di udara. Setelah kering preparat direndam ke dalam larutan Giemsa yang baru dibuat selama 15-60 menit. Stock Giemsa diencerkan 1: 9 dengan akuades buffer atau dalam jumlah kecil kita dapat membuat dengan perbandingan 1 tetes pewarna dalam 1 ml akuades buffer. Cucilah preparat dengan air baik-baik dan biarkan mengering di rak. Amatilah di bawah mikroskop.Pemeriksaan leukosit dilakukan untuk mengetahui differensial (hitung jenis) leukosit dimana paling sedikit dihitung 100 bentuk leukosit. Tiap-tiap jenis leukosit yang ada diperhitungkan dalan persen.Identifikasi morfologi meliputi :Ukuran selSitoplasma: - warna granula jumlah relativeinti sel : - bentuk warna nukleoli

V. PENGHITUNGAN DIFFERENSIAL LEUKOSITJika presentase dari 1 jenis leukosit naik, kemungkinan disebabkan oleh kenaikan dari jumlah tipe atau jenis leukosit yang lain.Nilai relatif = presentase tiap jenis leukositNilai absolut = nilai relatif x jumlah total leukositInterpretasi berdasarkan nilai absolute.

VI. METODE PEMBACAAN PREPARAT APUS DARAHa. Straight edge b. Cross sectionalc. Batlement

ANALISA URINEI. TUJUAN:1. Mengetahui sifat sifat fisika urine yang meliputi kuantitas, warna, kejernihan, berat jenis, dan bau.2. Menganalisis sifat-sifat kimia urine yang meliputi pH, protein, dan glukosa.3. Menganalisa kualitas urine yang benda-benda keton, bilirubin, darah, dan adanya sedimen di dalam urine sebagai deteksi keadaan ginjal, saluran urine, serta organ lain yang bersangkutan.

II. PEMERIKSAAN FISIKA URINEA. KUANTITASNormal: tergantung makanan, cuaca, dan latihanB. WARNANormal : kuning pucat-kuning coklatC. KEJERNIHANNormal : jernihPada kuda keruh dan berkabut karena adanya kristal CaCO3D. BAUNormal : asam-asam organic yang mengalami penguapanE. BERAT JENISDengan urinometer atau TS meter

III. PEMERIKSAAN KIMIA URINEa. pHTergantung diet, spesies, dan metabolismeUji : kertas lakmus, kertas labstick atau selfstickPerubahan warna cocokkan dengan warna tabel

IV. PEMERIKSAAN KUALITAS URINEa. SedimenCara kerja :1) Ambil 7 -8 ml urine masukkan ke dalam tabung sentrifuge, sentrifuge selama 5 menit pada 1500-2000 rpm2) Tuangkan cairan ke atas, sisakan sebanyak 0,5 ml (cairan + sedimen) dan kocoklah.3) Dengan pipet halus, taruhlah 2 tetes dari sedimen di atas object glass secara terpisah tutup dengan deck glass.4) Periksa di bawah mikroskop5) Gunakan perbesaran 10 x dan 40 x. 8