Acara IIIISOLASI MIKROBIA

Tujuan : Mengetahui cara melakukan isolasi bakteri menggunakan medium buatanTujuan khusus : 1. Mengisolasi khamir

2. Mengisolasi bakteri proteolitik 3. Mengisolasi bakteri asam laktat

Dasar Teori :

Mikrobia dapat dibiakkan dengan memperhatikan faktor nutrisi serta kebutuhan akan oksigen (gas O2 atau udara). Cara menumbuhkan mikroba yang anaerob sangat berbeda dengan mikrobia aerob. Menanam mikroba yang aerob relatif lebih mudah daripada yang anaerob.

Ada beberapa cara penanaman mikroba aerob namun tergantung pada tujuan penanamanya. Berdasarkan atas bentuk dan cara menanamnya dapat dibedakan menjadi ;

1. Biakan agar tegak (agar deep culture)2. Biakan agar miring (agar slant culture)3. Biakan cair (broth culture)

Sedangkan mikroba anaerob, oksigen dari udara bersifat toksik, maka oksigen itu harus dikeluarkan dari dalam medium. Ada beberapa cara untuk menumbuhkan mikroba anaerob, yaitu ;1. Menggunakan medium yang diperkaya

Cara ini adalah cara yang paling sederhana dan paling banyak digunakan. Medium diperkaya yang digunakan adalah thioglychollate-cair, thioglychollate-agar, agar otak dan lain-lain. Medium - medium tersebut mengandung bahan - bahan yang dapat menyerap oksigen sehingga suasana dalam medium menjadi anaerob. Misalnya medium thioglychollate-agar dalam petridisk yang ditutup dengan penutup Brewer (lihat gambar 1). Penutup tersebut dibuat sedemikian rupa sehingga menyinggung permukaan agar pada bagian tepinya dan memisahkan sebagian kecil udara kurang dari 1 mm tebalnya diatas permukaan agar. Bagian tepi dari penutup membentuk semacam cincin dengan bagian agar. Bahan - bahan pereduksi dalam medium dapat menghisap seluruh oksigen dari udara yang tertutup dan menyebabkan suasana menjadi anaerob.

2. Menghilangkan oksigen bebas dengan pembakaranCara ini memerlukan penyungkup yang dapat ditutup rapat misalnya Eksikator.

penyungkup tersebut ditambahkan dengan fosfor murni (P4). Selama ada oksigen, fosfor akan teroksidasi dan membentuk fosfor pentaoksida. Untuk mencegah peracunan fosfor maka pada dasar penyungkup ditambahkan air yang akan menyerap atau melarutkan fosfor pentaoksida. Cara yang juga banyak digunakan ialah dengan alat khusus yang dilengkapi dengan katalisator platina asbes yang dipanaskan untuk mempercepat reaksi antara hidrogen dengan oksigen di dalam atmosfernya.

3. Absorpsi oksigen secara kimiaCara ini banyak digunakan didalam laboraturium. Alat dan bahan yang diperlukan

ialah eksikator, asam pirogalol dan alkali (KOH). Untuk setiap liter eksikator diberi 12,5 cc

larutan KOH 20% dan 10 cc larutan asam pirogalol 40%. Mula - mula kedua larutan tersebut di tempatkan secara terpisah pada dasar eksikator. Setelah biakan murni mikroba anaerob dimasukan dan eksikator ditutup, kemudian eksikator tersebut dimiringkan sehingga kedua larutan tersebut tercampur. Warna campuran berubah menjadi coklat kehitaman. Campuran larutan tersebut akan menyerap oksigen yang terdapat didalam ruangan eksikator sehingga keadaanya menjadi anaerob.

gambar 1. Petridish dengan penutup Brewer1. Petridisk2. Medium3. Penutup Brewer4. Ruangan udara5. Penutup Brewer

4. Mendesak oksigren dengan gas-gas inertOksigen yang terdapat didalam bejana untuk menyimpan biakan murni. Mikroba

anaerob dapat didesak secara mekanik dengan gas hidrogen atau gas nitrogen. Untuk cara ini menggunakan alat Novy. U ntuk menimbulkan suasana anaerob didalam bejana penyimpanan maka di pakai satu indikator yaitu campuran larutan NaOH 1/60 N, larutan methylene bkue 0,05% dan larutan glukosa 6% pada perbndingan volume yang sama. Campuran ini sebelum dipakai harus digojok terlebih dahulu. Dalam keadaan tereduksi (tidak ada oksigen) maka methylene blue tidak berwarna dan apabila terdapat oksigen makan methylene blue akan berwarna biru.

5. Penanaman mikroba parasit obligatMikroba parasit obligat merupakan mikroba yang tidak dapat ditanam dalam

medium buatan. Untuk menanamnya diperlukan jaringan hidup. Sebagai medium jaringan maka digunaka embrio ayam, plasma darah ( yang mengandung sedikit jaringan hidup ), potongan embrio ayam, kaldu, larutan garam khusus dan lain-lain.

Isolasi Mikrobia

Isolasi mikrobia dapat dilakukan dengan berbagai macam cara. Namun untuk pelaksanaannya harus diperhatikan hal – hal penting, seperti :a) Sifat – sifat spesies mikrobia yang akan diisolasib) Tempat hidup atau asal mikrobia tersebutc) Medium untuk pertumbuhannya yang tidak sesuaid) Cara menanam mikrobia tersebute) Cara inkubasi mikrobiaf) Cara menguji untuk mengetahui mikrobia yang telah berupa biakan murni dan sesuai dengan

yang dimaksudg) Cara memeliara mikrobia yang telah diisolasi tetap biakkan murni

Isolasi bakteri dapat dilakukan dengan 3 macam cara, yaitu 1. Cara Goresan (Streak Plate Method)

Cara ini didasarkan pada penggoresan bakteri kedalam sebuah medium supaya bahan yang mengandung bakteri pada permukaan medium agar menyesuaikan dalam petridish. Setelah diinkubasi pada bekas goresan yang akan ditumbuhin koloni – koloni terpisah yang mungkin itu dari sel bakteri, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut.

2. Cara Taburan/ Tuang (Pour Plate Method)Cara ini dengan menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada

temperature 50ºC dengan suspense yang mengandung bakteri, dan menuangkannya kedalam petridisk steril. Setelah inkubasi maka akan terlihat koloni – koloni yang tersebar dipermukaan agar yang mungkin berasal dari satu sel bakteri, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut.

3. Cara rataan (Surface Plate Method)Cara ini dengan meratakan bakteri keseluruh permukaan medium pada petridisk

dengan bantuan drigalsky. Setelah diinkubasi maka akan dilihat persebaran koloni yang tumbuh dari sel bakteri, sehingga dapat diisolasi lbih lanjut.

Alat dan bahan 1. Teknik isolasi khamir

Alat : petridisk, pinset, jarum ose, lampu bunsen, inkubatorBahan : tape, medium YEPD (Yeast Extract Pepton Dextrose)

2. Teknik isolasi bakteri proteolitikAlat : petridish, tabung reaksi,timbangan,microtube,micropipette, microtip, inkubatorBahan : limbah ikan peda, medium skim milk agar

3. Teknik isolasi bakteri asam laktatAlat : petridish, tabung reaksi, timbangan, microtube, mikropipet, drigalsky, inkubator,

spuit.Bahan : ikan peda, aquadest steril (untuk seri pengeceran), medium GYP (Glucose 1%,

Yeast extract 0,5%, Pepton 0,5%) agar + CaCO3 0,5%

Cara Kerja1. Teknik isolasi khamir

Cara goresan (streak plate method)

Jarum ose disterilkan dengan cara memijarkannya pada lapmpu Bunsen

Tape ditusuk dengan menggunakan jarum ose

Goreskan ose tersebut kepermukaan medium agar YEPD dengan menggunakan pola goresan sebagai berikut :

1 2 3

Nb : ose selalu disterilkan sebelum memulai goresan dengan pola baru

Beri etiket, bungkus dan inkubasi selama 24-48 jam atau lebih

Amati pertumbuhan khamir yang membentuk koloni tunggal

2. Teknik isolasi bakteri proteolitikCara penaburan (surface plate method)

Limbah pencucian ikan

Diambil 100 µl

Buat seri pengenceran(jangan lupa divortex untuk menghomogenkan larutan)

100µm 100µm 100µm

10-2 10-3 10-4 10-5

Ratakan dengan drigalsky

Beri etiket, bungkus dan inkubasi 24 jam

Amati pertumbuhan bakteri yang membentuk zona bening

3. Teknik isolasi bakteri asam laktatCara tuang terbuka (pour plate method)

Buka bagian perut ikan peda

Keluarkan isinya dan timbang sebanyak 1 Gram

Larutkan dalam 9 ml aquadest steril

Vortex

Buat seri pengenceran

Aquadest steril 900 µm

10-2 10-3

GYP + CaCO3

Beri etiket, bungkus dan inkubasi 24 jam

Amati pertumbuhan bakteri yang membentuk zona bening