ISOLASI DNA RONGGA MULUT

Tujuan :1. Memahami definisi,aspek dari isolasi dan ekstraksi isolasi DNA RM2. Memahami Peran RM sebagai sources dari specimen pemeriksaan DNA3. Melakukan ekstraksi dan isolasi DNA sederhana

Landasan TeoriIsolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA, dan diperlukan upaya memecahkan dinding sel dan memberan inti dalam proses ekstraksi DNA. Proses tersebut dilanjutkan dengan pemisahan DNA dari berbagai komponen sel yang lain. Proses pengeluaran DNA dengan cara ekstraksi ataupun dilisiskan biasanya ditambahan buffer untuk mencegah kerusakan DNA. Proses selanjutnya adalah pemisahan DNA dari komponen sel lain maupun kontaminan termasuk sel debris yang dapat dilakukan dengan metode sentrifugasi. Setelah dilakukan ekstraksi, akan dilanjutkan dengan proses presipitasi DNA dengan menggunakan etanol absolut atau isopropanol. Hal ini bertujuan untuk mendapatkan endapan DNA ketika dilakukan sentrifugasi. Presipitasi pada sampel darah dilakukan dengan salting-out yaitu memisahkan supernatan dari protein atau sel debris dengan pemberian larutan garam berkonsentrasi tinggi. Beberapa hal yang dapat terjadi selama proses ekstraksi DNA antara lain: DNA yang patah pada saat proses isolasi, DNA terdegradasi oleh enzim, terjadi kontaminasi polisakarida, dan metabolit sekunder yang ikut terisolasi.

Metode dan Cara Kerja :

1. METODE ISOLASI DNA DENGAN DNAZOL DARI SAMPEL SALIVAa. Sampel saliva dimasukkan kedalam tabung sentrifusb. Sampel disentrifus dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menitc. Supernatan hasil pemusingan dibuangd. Endapan / pellet ditambah dengan DNAZol 1 cc kemudian divortexe. Inkubasi selama 15 menitf. Tambahkan chloroform 0,2 cc kemudian divortexg. Centifuge 8000 rpm selama 15 menith. Ambil supernatan dengan hati-hati, lalu dimasukkan kedalam eppendorf tube barui. Tambahkan isopropanol 0,5 cc, dihomogenkan dengan cara dibolak balik dengan pelan.j. Inkubasi 15 menitk. Centrifuge 12.000 rpm selama 10 menitl. Buang supernatanm. Cuci pellet dengan etanol 70 % sebanyak 0,5 ccn. Centrifuge 12.000 rpm selama 5 menito. Buang supernatan.p. Pellet ditambah aquadest steril sebanyak 50 l.

2. METODE ISOLASI DENGAN DNAZOL DARI SAMPEL DARAHa. Ambil tabung sentrifus 15 cc dan masukkan reagen DNAZOL sebanyak 1 ccb. Tambahkan darah 0,5 cc dan vortex dengan segerac. Inkubasi selama 15 menitd. Tambahkan chloroform 0,2 cc dan vortexe. Inkubasi selama 15 menitf. Sentrifus 8000 rpm selama 15 menitg. Ambil supernatan dengan hati-hati, masukkan dalam tabung eppendorf baruh. Tambahkan isopropanol 0,5 cc inkubasi selama 5 menit, kemudian bolak-balik dengan pelani. Sentrifus 12.000 rpm selama 10 menitj. Buang supernatank. Cuci pellet dengan ethanol 70% sebanyak 0,5 ccl. Sentrifus 12.000 rpm selama 5 menitm. Buang supernatann. Pellet ditambah DW sebanyak 50 ul.Hasil Praktikum dan Rangkuman :

No.FotoKeterangan

1.

Alat dan bahan

2.

Conucal tube

3.

DNAZol

4.

Hasil centrifuge

5.

Alat centrifuge

6.

Spesimen saliva

7.Sampel setelah ditambah kloroform.

8.

Sampel setelah ditambah etanol

9.

. Sampel setelah ditambah isopropanol.

10.

Tahap vortex setelah sampel diberi DNAzol.

Pada praktikum ini, digunakan spesimen saliva sebagai bahan percobaan isolasi DNA rongga mulut karena mudah didapat. Selain saliva, bahan lain yang dapat digunakan untuk isolasi dan ekstraksi DNA antara lain: darah, rambut, sperma, dan tulang. Hasil dari praktikum ini adalah terdapatnya endapan DNA saliva dan supernatan pada tabung. Supernatan tersebut dibuang, sedangkan endapan saliva dapat digunakan untuk pemeriksaan lebih lanjut, seperti PCR, RFLP, cloning, dan sekuensing. Beberapa hal yang dapat terjadi selama proses ekstraksi DNA adalah: bentukan DNA yang patah selama proses isolasi, DNA terdegradasi oleh enzim nuclease, terjadi kontaminasi oleh polisakarida, serta metabolit sekunder yang ikut tersiolasi.

Jawaban Pertanyaan :1. Apakah yang dimaksud dengan isolasi dan ekstraksi DNA ? Isolasi DNA adalah proses pemisahan DNA dari jaringan sampel. Ekstraksi DNA adalah proses pengambilan DNA murni dengan cara memisahkan DNA dari komponen sel yang lain.

2. Mengapa saliva dapat digunakan sebagai sampel DNA ? Karena saliva mengandung sel-sel yang memiliki inti, sehingga terdapat DNA pada kromosom yang terletak di dalam inti sel.

3. Selain pemeriksaan DNA ? GCF (Gingival Crevicular Fluid), gigi, serta mukosa rongga mulut.

4. Bagaimana prinsip dasar isolasi dan ekstraksi DNA ? Prinsip dasar isolasi dan ekstraksi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari berbagai komponen lainnya. Hasil dari proses tersebut merupakan tahapan penting untuk langkah berikutnya dan harus dilakukan dengan baik dan bebas kontaminasi. Pada saat pengambilan, spesimen masih tercampur dengan sel debris dan komponen sel yang lain sehingga perlu dilakukan pemisahan untuk mendapatkan DNA murni. Proses pemisahan tersebut dapat dilakukan dengan teknik sentrifugasi sehingga didapatkan larutan supernatan pada bagian atas tabung dan endapan DNA spesimen di bagian dasar tabung.

5. Jelaskan secara singkat metode ekstraksi DNA dalam praktikum ini beserta alasan penggunaan bahan-bahan yang ada ! Spesimen saliva yang sudah dimasukkan dalam tabung kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama lima menit sehingga didapatkan pellet dan supernatan. Pada tahap presipitasi setelah supernatan dibuang, lalu ditambahkan DNAZol ke dalam pellet supaya protein dalam sampel mengalami denaturasi. Kemudian dilakukan proses di atas mesin vortex, dan dilanjutkan dengan inkubasi selama lima menit sehingga didapatkan presipitat. Setelah itu dilakukan sentrifugasi terhadap presipitat tersebut dengan kecepatan 8000 rpm selama tiga menit, kemudian terbentuk pellet dan supernatan. Bagian supernatan kembali dibuang, sedangkan pellet dimasukkan ke dalam tabung eppendorf baru. Untuk mendapatkan endapan DNA, ditambahkan isopropanol 0,5 cc ke dalam sampel saliva, lalu dilakukan proses homogenisasi dan diinkubasi selama lima menit. Kemudian sampel disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama tiga menit dan dibuang supernatannya sehingga didapat presipitat DNA yang diinginkan. Presipitat tersebut kemudian diberi 0,5 cc etanol 70%, lalu disentrifugasi kembali dan dibuang supernatannya. Pada tahap terakhir, pellet diberi 50 mikro liter aquadest.

Kesimpulan:Dari hasil praktikum yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa:1. Saliva dapat digunakan sebagai bahan pemeriksaan DNA yang akurat dengan teknik pengambilan yang mudah. 2. Proses sentrifugasi dalam proses isolasi dan ekstraksi DNA bertujuan untuk memisahkan DNA dari komponen-komponen lain yang ikut terambil. 5