ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI MANOLITIK LAUT

DARI PULAU PARI

APRIDAH CAMELIAWATI DJOHAN

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2012

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER

INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Isolasi dan Identifikasi Bakteri

Manolitik Laut dari Pulau Pari adalah karya saya dengan arahan dari komisi

pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi

mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan

maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan

dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir Tesis ini.

Bogor, September 2012

Apridah Cameliawati Djohan

NRP G851100061

ABSTRACT

APRIDAH CAMELIAWATI DJOHAN. Isolation and Identification of

Manolytic Bacteria from Pari Island. Under direction of LAKSMI AMBARSARI

and YOPI

Indonesia's tropical marine biodiversity of microorganisms have high

potential and commercial value. This study focused on the isolation and

identification of potential microbes which produce mannanase enzyme to

hydrolyze mannan and eventually produce manno-oligosaccharides. Sampling

was conducted in Pari island at Jakarta Bay area, the screening and observation of

mannanase enzyme activity from those marine biodiversity have been conducted.

The research succeed to collect 20 bacteria that could produce mannanase

enzyme, three of them have the most high activity from qualitative analysis based

on mannolytic index using congo red method for Pari 3, 4 dan 5 such as 4,33,

2,40, dan 2,60. Further quantitative analysis for these bacteria were conducted

such as activity of mannanase using dinitrosalicylic acid method and resulted the

highest activity is Pari 3 with 2,474 U/mL and Pari 4 with 1,193 U/mL both in the

second day of fermentation, whereas Pari 5 with 1,087 U/mL in the third day of

fermentation. Analysis 16S rRNA gene were showed that Pari 3, 4, and 5 are

domain Bacteria, filum Firmicutes, class Bacilli, ordo Bacillaceae and genus

Bacillus. For the spesific identification are using phylogenetic tree and concluded

that Pari 3 has similar sequence 91.1% with Bacillus safensis and 92% Bacillus

pumilus, from the both result showed the genetic relationship which is less than

97% in similarity therefore it was suggested that the bacteria Pari 3 is a new strain

and can be further investigated. Whereas The results of Pari 4 identification has

similar sequence 94.1% with Bacillus anthacis and 92.2% with the Bacillus

cereus in the genetic relationship. The results of Pari 5 identification has similar

sequence 97.1% with Bacillus anthracis and 95.2% with the Bacillus cereus in the

genetic relationship.

Keywords: Pari island, biodiversity microorganism, mannanase, marine bacteria,

16S rRNA

RINGKASAN

APRIDAH CAMELIAWATI DJOHAN Isolasi Dan Identifikasi Bakteri

Manolitik Laut Dari Pulau Pari. Dibimbing oleh LAKSMI AMBARSARI dan

YOPI

Biodiversitas mikroorganisme laut tropis Indonesia mempunyai nilai

potensi maupun komersial yang tinggi. Pengembangan ilmu bioteknologi memacu

teknik biomolekuler sebagai dasar penelitian yang bertujuan untuk

mengidentifikasi mikroorganisme yang telah diisolasi dari alam maupun dalam

melakukan rekayasa genetik yang dapat memodifikasi urutan basa sehingga dapat

diperoleh jenis enzim yang diinginkan. Sedangkan kemajuan teknik-teknik dalam

bidang enzimologi dapat dimanfaatkan untuk menganalisis kualitas enzim secara

kuantitatif untuk hasil yang lebih akurat.

Tesis ini terfokus pada identifikasi mikroba laut, pemanfaatan enzim laut

penghidrolisis senyawa polisakarida dan memperoleh bakteri manolitik potensial

penghasil enzim mananase. Sebagian besar enzim mananase komersial dihasilkan

dari mikroba yang berasal dari daratan sehingga adanya ketertarikan untuk

melakukan isolasi mikroba penghasil enzim mananase dari laut, tujuan melakukan

isolasi yaitu selain memanfaatkan kekayaan biodiversitas asli Indonesia juga

dapat melengkapi data mikroba potensial penghasil enzim mananase. Penelitian

ini bertujuan untuk mengeksplorasi, mengisolasi, skrining dan identifikasi bakteri

manolitik laut lokal dari pulau Pari Indonesia.

Pengambilan sampel dilakukan di kawasan pulau Pari teluk Jakarta,

proses identifikasi dan pengamatan aktivitas enzim mannanase dilakukan

menggunakan metode kualitatif dengan pewarnaan congo red. Sedangkan untuk

analisis kuantitatif untuk menentukan besarnya aktivitas mananase yang

dihasilkan oleh bakteri, digunakan metode asam dinitrosalisilat. Secara molekuler

bakteri manolitik potensial dapat diidentifikasi genus, spesies serta pohon

kekerabatannya dengan menganalisis gen 16S rRNA yang bersifat spesifik untuk

setiap bakteri.

Hasil isolasi dan skrining telah berhasil diperoleh 20 bakteri yang dapat

menghasilkan enzim mananase dan tiga diantaranya mempunyai aktivitas tertinggi

berdasarkan analisis congo red yaitu Pari 3, 4 dan 5, dengan indeks manolitik

berturut-turut 4,33; 2,40; dan 2,60. Hasil analisis aktivitas enzim mananase pada

isolat Pari 3 pada hari kedua menunjukkan aktivitas tertinggi sebesar 2,474 U/mL,

dengan tipe enzim yang disekresikan yaitu eksoenzim karena dari pola

pemanfaatan substrat mannan sesuai dengan pertumbuhan jumlah sel.

Pari 4 mempunyai aktivitas tertinggi di hari kedua sebesar 1,193 U/mL.

Sedangkan untuk Pari 5 menunjukkan aktivitas tertinggi pada hari ketiga

yaitu 1,087 U/mL. Untuk isolat Pari 4 dan Pari 5 mempunyai pola enzim yang

serupa yaitu pola endoenzim yang bersifat random dalam pembentukan gula

reduksi sehingga pada polanya menunjukkan bahwa pemanfaatan substrat manan

tidak terpengaruh dengan jumlah sel yang terbentuk. Analisis lebih lanjut yaitu

amplifikasi gen 16S rRNA telah berhasil dilakukan. Hasil analisis diperoleh

bakteri Pari 3 yang mempunyai hasil kekerabatan 91,1% dengan Bacillus safensis

dan 92% dengan Bacillus pumillus. Dari keduanya menyatakan presentase

kekerabatan yang kurang dari 93% dan 97%. oleh karena itu dapat diduga bahwa

bakteri Pari 3 merupakan strain baru dan dapat diteliti lebih lanjut. Hasil

identifikasi bakteri Pari 4 mempunyai hasil kekerabatan 94,1% dengan Bacillus

anthracis dan 92,2% dengan Bacillus cereus. Hasil identifikasi bakteri Pari 5

mempunyai hasil kekerabatan 97,1% dengan Bacillus anthracis dan 95,2%

dengan Bacillus cereus. Menurut Schloss dan Handelsman 2004. bila kemiripan

maksimum ≥ 97% maka dianggap satu spesies yang sama, maka dapat

disimpulkan bahwa bakteri Pari 4 dan 5 merupakan Bacillus anthracis.

Penelitian ini sebagai langkah awal pemanfaatan dan eksplorasi

biodiversitas mikroba laut lokal Indonesia sebagai sumber penghasil enzim pada

umumnya dan enzim mananase pada khususnya. Akan sangat baik jika bakteri

manolitik potensial yang telah diisolasi dapat pula diidentifikasi gen penyandi

enzim mananasenya untuk dikembangkan secara rekayasa genetika dalam

memproduksi enzim mananase untuk skala industri atau komersial.

Kata kunci: Pulau Pari, biodiversitas mikroorganisme, enzim mananase, bakteri

laut, 16S rRNA

© Hak Cipta milik IPB, tahun 2012

Hak Cipta dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan

atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,

penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau

tinjauan suatu masalah; dan pengutian tersebut tidak merugikan kepentingan

yang wajar IPB

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak bagian atau seluruh Karya tulis

dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI MANOLITIK LAUT

DARI PULAU PARI

APRIDAH CAMELIAWATI DJOHAN

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains pada

Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2012

Judul Tesis : Isolasi dan Identifikasi Bakteri Manolitik Laut dari Pulau Pari Nama : Apridah Cameliawati Djohan NRP : G851100061

Disetujui

Komisi Pembimbing

Dr. Laksmi Ambarsari, MS. Dr. Yopi

Ketua Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Biokimia Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS. Dr. Ir. Dahrul Syah, MS

Tanggal Ujian : 27 Agustus 2012 Tanggal Lulus:

Penguji Luar Komisi Pada Ujian Tesis : Dr. Ir. I Made Artika, M. App. Sc

PRAKATA

Segala puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Pengasih

atas kasih karunia-Nya sehingga tesis yang berjudul “Isolasi dan Identifikasi

Bakteri Manolitik Laut dari Pulau Pari” ini telah dapat diselesaikan. Tesis ini

dibuat sebagai salah satu syarat mahasiswa pascasarjana program S2 untuk meraih

gelar Magister pada Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Penyusunan

tesis ini melalui proses penelitian dan penulisan yang membutuhkan banyak

dukungan serta bantuan secara intelektual dan teknisnya, untuk itu melalui

kesempatan ini penulis menyampaikan terimakasih kepada berbagai pihak.

Ucapan terimakasih yang sebesar-besarnya penulis haturkan kepada :

1. Tim komisi pembimbing yang terdiri: (1) Dr. Laksmi Ambarsari, MS., sebagai

ketua komisi pembimbing yang telah banyak memberikan perhatian, bantuan,

dan meluangkan waktu untuk membimbing, dan berdiskusi. (2) Dr. Yopi,

sebagai anggota komisi pembimbing serta pembimbing selama melakukan

penelitian di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi di Pusat penelitian

Bioteknologi LIPI Cibinong.

2. Bapak Dr. Ir. I Made Artika, M. App. Sc., yang telah meluangkan waktu dan

berkenan menjadi penguji luar komisi serta memberi saran yang sangat

bermanfaat bagi penulis.

3. Ibu Prof. Dr. Maria Bintang, MS., selaku ketua program studi S2 Biokimia

yang telah meluangkan waktu dan berkenan menjadi moderator dalam ujian

siding tesis dan untuk segala doa, bantuan dan dukungan selama penulis

melaksanakan studi di program Magister Biokimia IPB.

4. Rekan-rekan di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi, Pusat Penelitian

Bioteknologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) di Cibinong,

Ahmad Thontowi, M.Si., Nanik Rahmani, M.Si., Ade Andriani S.Si.,

Alex Prima, S.Si., dan Awan Purnawan, S.Si., terimakasih atas senyum,

semangat, dukungan dan saran yang sangat membantu dalam menyelesaikan

tesis ini.

5. Dekan Sekolah Pascasarjana IPB beserta staf pegawai Pascasarjana IPB,

Ketua PS Biokimia atas perkenaan menerima dan membantu penulis selama

menjalani pendidikan S2 IPB.

6. Dosen-dosen IPB, terutama pada program studi Biokimia, Terimakasih atas

sumbangan ilmu pengetahuan yang sangat bermanfaat bagi penulis.

7. Teman-teman Biokimia angkatan 2010, Sri Anggarini Rasyid, Elizabeth

Situmorang, Martha Sari, Noni Mardian Trizana, dan Adios Boby serta teman-

teman yang tidak sempat penulis sebutkan namanya satu persatu, Terimakasih

atas persahabatan yang indah semasa menjadi mahasiswa Biokimia.

8. Terimakasih yang khusus dan mendalam penulis sampaikan kepada kedua

orang tua penulis, papi Djohan Hartanto (alm) dan mami Lili Suhartini, atas

segala doa, kasih sayang, dan dukungan selama membesarkan dan mendidik

penulis sehingga berhasil menempuh pendidikan hingga jenjang Magister.

9. Kakak tersayang Felinawati Djohan, Djeppy Hartono Djohan dan Frangky

Hartono Djohan atas segala doa dan dukungannya selama penulis mengikuti

pendidikan Magister di IPB.

10. Terimakasih untuk sahabat-sahabat terbaik dan terkasih, Michael H.B

Lumintang, Lidya Huang Huang, Swastika Praharyawan dan Ashif Irvan

Yusuf atas segala doa, dukungan serta semangatnya selama penulis

menempuh pendidikan Magister di IPB.

Penulis menyadari dalam penulisan serta penyusunan tesis ini masih

banyak kekurangan dan keterbatasan dari segi materi maupun segi sistematika,

oleh karena itu penulis dengan segala kerendahan hati terbuka untuk menerima

kritik dan saran yang bersifat membangun demi penyempurnaan penyusunan tesis

ini. Akhirnya semua budi baik yang diberikan kepada penulis semoga diterima

dan dibalas berlipat ganda oleh Tuhan Yang Maha Esa. Penulis menyampaikan

permohonan maaf apabila penulis melakukan kesalahan baik yang disengaja

maupun tidak semasa menyelesaikan studi magister ini. Semoga tesis ini dapat

bermanfaat bagi penulis khususnya maupun bagi rekan-rekan mahasiswa.

Bogor, September 2012

Apridah Cameliawati Djohan

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 17 April 1983 dari ayah Djohan

Hartanto (alm) dan ibu Lili Suhartini. Penulis merupakan Putri bungsu dari empat

bersaudara. Pada tahun 2006 penulis lulus dari program studi Kimia di Sekolah

Tinggi Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Bogor. Pada Tahun 2006 hingga

saat ini penulis bekerja di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi di Pusat

Penelitian Bioteknologi Lembaga ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) sebagai

peneliti. Pada Tahun 2010, penulis mendapatkan kesempatan untuk menempuh

Program Magister Sains di IPB. Penulis memilih program studi Biokimia dalam

melanjutkan studinya. Saat ini penulis aktif melakukan penelitian khususnya di

bidang enzimologi dan fermentasi yang mencakup tema tentang Biorefinery

dengan memanfaatkan mikroorganisme seperti bakteri, ragi, dan kapang.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR GAMBAR ………........................................................................ i

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................ ii

PENDAHULUAN......................................................................................... 1

Latar Belakang............................................................................. 1

Hipotesis ………………………………………………………. 3

Tujuan Penelitian ........................................................................ 3

Manfaat Penelitian …………………………………………….. 3

TINJAUAN PUSTAKA................................................................................ 5

Manan.......................................................................................... 5

Enzim Mananase.......................................................................... 6

Mikroba Manolitik...................................................................... 8

Manfaat Enzim Mananase........................................................... 10

Bioinformatika……………………………................................ 12

16S rRNA………....................................................................... 12

Identifikasi 16S rRNA dengan Metode PCR.............................. 14

Ribosomal Database Project (RDP) ………............................... 15

METODOLOGI…………............................................................................ 17

Waktu dan Tempat penelitian..................................................... 17

Cara Kerja…………................................................................... 17

HASIL DAN PEMBAHASAN.................................................................... 23

Isolasi dan Purifikasi Bakteri manolitik Laut….......................... 23

Aktivitas Enzim Mananase…………………………………...... 27

DNA Genom............................................................................... 30

Amplikon Gen 16S rRNA........................................................... 31

Pohon Filogenetik Pari 3…………………...….......................... 32

Pohon Filogenetik Pari 4 dan 5................................................... 33

SIMPULAN DAN SARAN ………………………………………………. 37

Simpulan …………………………………………………….… 37

Saran …………………………………………………………... 38

DAFTAR PUSTAKA.................................................................................... 39

LAMPIRAN……………………………………………………………….. 43

i

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1. Hemiselulosa....................................................................................... 5

2. Pemotongan Heteromannan oleh Komplek Enzim Mananase............ 7

3. Lokasi Sampling di Pulau Pari Kepulauan Seribu DKI Jakarta......... 23

4. Bakteri Manolitik Laut Potensial Penghasil Enzim Mananase........... 24

5. Hasil Analisis Kualitatif Bakteri Manolitik Metode Congo Red ….. 25

6. Aktivitas Mananase dan Jumlah Sel Bakteri Pari 3…………….…... 28

7. Aktivitas Mananase dan Jumlah Sel Bakteri Pari 4............................ 29

8. Aktivitas Mananase dan Jumlah Sel Bakteri Pari 5............................ 29

9. Elektroforegram Genom Bakteri Manolitik Laut …......................... 30

10. Elektroforegram Amplikon Hasil Identifikasi 16S rRNA................... 31

11. Pohon Filogenetik Bakteri Manolitik Laut Pari 3.............................. 33

12. Pohon Filogenetik Bakteri Manolitik Laut Pari 4 dan 5……............ 34

ii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1. Diagram Alir Penelitian ...................................................................... 43

2. Hasil Contiq Bakteri Manolitik Laut Pari 3…………………………. 44

3. Hasil Contiq Bakteri Manolitik Laut Pari 4…………………………. 45

4. Hasil Contiq Bakteri Manolitik Laut Pari 5…………………………. 46

5. Kromatogram Bakteri Manolitik Laut Pari 3………………………... 47

6. Kromatogram Bakteri Manolitik Laut Pari 4………………………... 48

7. Kromatogram Bakteri Manolitik Laut Pari 5………………………... 49

8. Analisis Identifikasi Bakteri Manolitik Laut Pari 3............................. 50

9. Analisis Identifikasi Bakteri Manolitik Laut Pari 4............................. 51

10. Analisis Identifikasi Bakteri Manolitik Laut Pari 5............................. 52

1

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Indonesia merupakan negara bahari yang mempunyai kekayaan biodiversitas

mikroorganisme laut yang potensial untuk pengembangan ilmu pengetahuan

maupun nilai komersial dalam meningkatkan industri dalam negeri. Kemajuan

bidang bioteknologi menstimulasi berkembangnya penelitian dan eksplorasi

kekayaan biodiversitas mikroorganisme laut asli Indonesia untuk melengkapi

database mikroorganisme potensial yang saat ini belum banyak dilakukan.

Pemanfaatan biodiversitas mikroba laut semakin diharapkan secara maksimal

untuk menghasilkan terobosan baru melalui produk hasil metabolisme, bioproses

maupun kemampuannya menghasilkan jenis enzim yang spesifik. Tingginya

permintaan pasar akan produk-produk baru dan mempunyai tingkat efisiensi yang

tinggi dalam proses produksi sangat dibutuhkan dalam bidang industri seperti

pangan fungsional, farmasi, peternakan, bioenergi, lingkungan dan kesehatan. Saat

ini pemanfaatan teknologi enzimatik dalam dunia industri sedang pesat dilakukan,

salah satu enzim yang mempunyai peranan penting tersebut adalah enzim

mananase. Enzim mananase merupakan enzim yang dapat mengkatalisis reaksi

hidrolisis dari ikatan β-1,4-manosidik dari rantai manan, glukomanan, dan

galaktomanan. Enzim mananase dapat digunakan dalam aplikasi teknologi enzim

pada industri yang beragam seperti makanan, pakan, farmasi, kertas maupun dalam

industri gas sebagai stimulasi maupun perlakuan awal terhadap biomasa

lignoselulosa sebagai bahan untuk biofuel generasi kedua (Songsiriritthigul et al.

2010).

Penelitian mengenai mikroorganisme penghasil enzim mananase dari darat,

seperti actinomycetes, kapang, aspergillus, fungi dan bakteri telah banyak

dilakukan sehingga informasi tentang gen yang menyandi enzim mananase yang

telah dikloning maupun disekuen berasal dari mikroba darat dapat diperoleh, jenis

enzim ini mempunyai kemampuan untuk mengikat β-manan dan aktivitas katalitik

yang tinggi dalam mendepolimerisasi substrat polisakarida (Tanaka et al. 2009).

Oleh sebab itu timbul ketertarikan untuk melakukan penelitian, eksplorasi dan

isolasi mikroorganisme potensial penghasil enzim mananase dari perairan laut

2

Indonesia yang masih jarang dilakukan. Mikroba mannolitk adalah mikroba yang

dapat menghasilkan enzim mananase yang dapat menghidrolisis polisakarida

kompleks menjadi molekul sederhana seperti manno-oligosakarida dan mannosa.

Pada umumnya enzim mananase dihasilkan dari mikroorganisme seperti bakteri,

namun adapula yang dihasilkan dari tanaman dan hewan. Enzim mananase yang

dihasilkan oleh mikroorganisme mempunyai keunggulan tersendiri yaitu bersifat

lebih ekonomis, mudah dan efisien dalam memproduksinya. Proses karakterisasi

dan fermentasi enzim mananase dari mikroba mempunyai waktu proses yang lebih

cepat dibandingkan dengan enzim dari tanaman dan hewan.

Senyawa polisakarida yang terdapat di perairan laut sangat bervariasi karena

sesuai dengan jenis monomer yang menyusunnya yaitu agar, kitin, manan, xylan

dan selulosa. Pemanfaatan produk polisakarida dalam negeri sangat terbatas

walaupun sumbernya berlimpah karena Indonesia merupakan negara tropis yang

kaya akan biodiversitas tanaman tropis, tingginya biaya pengembangan produk

polisakarida dan sistem pengolahan yang tradisional menyebabkan Indonesia

seringkali menjual bahan mentah dan mengimpor produk yang sudah jadi dengan

harga impor yang lebih mahal dari ekspor bahan mentah. Diharapkan dari

penelitian ini dapat mengembangkan potensi mikroba lokal dan menghasilkan

enzim potensial untuk industri serta mulai memanfatkan teknologi rekayasa

genetik dan teknologi enzimatis sehingga dapat dengan maksimal memanfaatkan

biomassa polisakarida, karena selain bersifat renewable, teknologi di atas lebih

ramah lingkungan.

Enzim dari mikroba laut lokal belum banyak diteliti maupun dikembangkan

pada tingkat laboratorium maupun komersial. Enzim laut memiliki karakter

berbeda dengan enzim dari mikroba biasa sehingga penelitian biodiversitas

mikroba laut dan karakter enzim penghidrolisis polisakarida laut menjadi hal yang

menarik untuk dikaji. Biomassa juga mempunyai peranan penting dalam proses

produksi enzim yaitu sebagai sumber karbon sedangkan pemanfaatan biomassa

yang spesifik dapat mengetahui kemampuan mikroba untuk menghasilkan enzim

yang spesifik pula. Penelitian yang dilakukan sebelumnya telah menghasilkan

enzim mananase termofilik laut dari bakteri Rhodothermus marinus, mikroba ini

diisolasi dari perairan laut yang mempunyai suhu tinggi sehingga mempunyai

3

aktivitas enzim mananase yang cukup unik dalam mendegradasi sumber manan

seperti galaktomannan pada substrat locust bean gum, mikroba manolitik laut ini

telah diketahui menghasilkan enzim mananase glikosidasi famili 26 yang bersifat

termofilik yaitu tahan hingga temperatur 85°C setelah melalui proses karakterisasi

enzim dan analisis sekuen DNA (Politz et al. 2000). Mikroba penghasil enzim

mananase dari darat dapat berupa aktinobakteri seperti Cellulomonas fimi,

actinomicetes dari kelompok streptomicetes seperti Streptomyces galbus dan

Streptomyces lividans yang mempunyai karakterisitik enzim yang unik karena

dapat mendegradasi berbagai jenis substrat manan (Stoll et al. 1999).

Tujuan Penelitian

Tujuan umum dari penelitian ini adalah untuk mengeksplorasi kekayaan

biodiversitas mikroorganisme laut lokal Indonesia. Tujuan khusus penelitian ini

antara lain 1) Mengetahui apakah mikroorganisme laut khususnya bakteri laut

mempunyai kemampuan untuk menghasilkan enzim mananase potensial. 2)

Mengisolasi, skrining dan mengidentifikasi bakteri manolitik laut lokal dari pulau

Pari Indonesia. 3) Melengkapi data base mikroba potensial penghasil enzim

mananase.

Hipotesis

Kekayaan biodiversitas mikroorganisme laut lokal Indonesia dapat

menghasilkan enzim mananase potensial.

Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan enzim mananase potensial

dari mikroba lokal untuk kebutuhan penelitian maupun industri dan mendapatkan

informasi data base mikroba laut lokal potensial penghasil enzim mananase.

4

5

TINJAUAN PUSTAKA

Manan

Manan merupakan senyawa hemiselulosa yang terdapat di alam dan

merupakan polisakarida kedua yang sangat melimpah setelah selulosa. Manan

dapat diklasifikasikan menjadi macam tipe dari mannopolisakarida yaitu linier

manan, galaktoglukomanan, galaktomanan, dan glukomanan (Zahura et al. 2011).

Manan terdiri atas susunan gula sederhana manosa, galaktomanan terdiri atas

manosa dan galaktosa, glukomanan terdiri atas manosa dan glukosa, sedangkan

galaktoglukomanan tersusun dari manosa, galaktosa dan glukosa (Sachselehner et

al. 2000). Struktur manan berbentuk linier atau bercabang yang dapat pula

ditemukan sebagai heteroglikan pada tumbuhan tingkat tinggi, variasi struktur

senyawa kompleks hemiselulosa mannan (Gambar 1).

Gambar 1. Kelompok Hemiselulosa: (a) Manan (b) Galaktomanan (c)

Glukomanan (d) Galaktoglukomanan (Dhawan et al. 2007)

6

Manan terutama terdapat pada kayu lunak, endosperma kopra, kelapa

sawit, kopi, dan locust bean gum. Locust bean gum adalah substrat yang

mengandung galaktomanan yang berasal dari tanaman Ceratonia siliqua. Locust

bean gum dapat menginduksi sekresi enzim mananase yang dapat menghidrolisis

rantai tulang punggung galaktomanan maupun rantai sampingnya. Locust bean

gum terdiri atas komponen galakto-D-manoglikan 88%, pentan 4%, protein 6%,

selulosa 1%, dan mineral 1% (Sumardi 2004).

Enzim Mananase

Enzim adalah biokatalisator yang berfungsi untuk mempercepat laju reaksi

kimia dalam suhu dan derajat keasaman yang spesifik. Enzim juga dapat berupa

protein sederhana atau protein yang terikat pada gugus non-protein, enzim bersifat

spesifik untuk substrat tertentu. Enzim dapat diklasifikasikan berdasarkan

beberapa reaksi seperti reaksi oksidasi-reduksi, perpindahan komponen kimia,

hidrolisis, pengurangan atau penambahan suatu zat kimia, isomerasi, dan adanya

unit substrat yg berikatan (polimerasi) (Lehninger et al. 2004).

Enzim merupakan biokatalisis yang penggunaannya dibatasi oleh suhu,

tekanan, pH, dan kekuatan ion. Enzim juga merupakan zat yang dapat bereaksi di

dalam sel hidup, enzim mengkatalisis semua aspek metabolisme sel seperti dalam

proses pencernaan makanan yang meliputi hidrolisis senyawa protein,

karbohidrat, dan lemak menjadi molekul yang lebih kecil; penyimpanan dan

perpindahan energi kimia serta pembentukkan struktur penyusun sel

(Purawadaria et al. 1994).

Enzim mananase merupakan enzim pengurai heteromanan menjadi

manosa, glukosa, dan galaktosa. Enzim Mananase adalah enzim yang berfungsi

untuk mengkatalisis proses hidrolisis manan yang merupakan senyawa

polisakarida. Degradasi manan oleh bakteri, fungi, cendawan dan tanaman

memerlukan variasi enzim seperti β-Mananase (EC 3.2.1.78) yang dapat

menghidrolisis β-1,4-D manopiranosil pada kerangka utama polimer manan

seperti pada galaktomanan dan glukomanan untuk menghasilkan rantai pendek

manooligosakarida. Selanjutnya senyawa tersebut dihidrolisis oleh kerja enzim β-

manosidase (EC 3.2.1.25) dan α-galaktosidase (EC 3.2.1.22) menghasilkan

7

manosa dan galaktosa (Duffaud et al. 1997). Proses hidrolisis dari senyawa

heteromanan galaktomanan memerlukan komplek enzim mananase yaitu enzim

galaktosidase untuk memotong rantai ikatan galaktosa dengan manosa dan enzim

mananase untuk memotong rantai ikatan manosa dengan manosa. Pada senyawa

glukomanan diperlukan komples enzim mananase glukosidase dengan mananase

untuk menghasilkan gula sederhana. Enzim glukosidase berfungsi untuk

memotong ikatan rantai glukosa dengan manosa sehingga hasil akhir hidrolisis

berupa glukosa dan manosa (Gambar 2).

Gambar 2. Pemotongan heteromanan oleh komplek enzim mananase

(Kurakake et al. 2001).

8

Enzim Mananase merupakan kelompok enzim glikosida hidrolase yang

dapat mendegradasi manan dan heteromanan. Enzim glikosida hidrolase

(E.C 3.2.1) merupakan kelompok enzim yang telah diketahui dapat menghidrolisis

ikatan glikosidik pada oligo-dan polisakarida. Untuk menghidrolisis substrat

karbohidrat yang mempunyai struktur kompleks maka dibutuhkan kombinasi

berbagai macam enzim untuk dapat mendegradasi menjadi senyawa

manooligosakarida. Enzim yang termasuk dalam kelompok glikosida hidrolase

mempunyai sumber yang berbeda-beda yaitu bakteri, kapang maupun jamur

sehingga enzim tersebut dapat diklasifikasikan menjadi kelas yang berbeda

menurut urutan sekuen asam amino dan struktur tiga dimensi molekul enzimnya

(Dhawan et al. 2007).

Perbandingan hasil sekuen dari enzim β-mananase menunjukan bahwa ada

dua famili yaitu famili 5 dan 26. Famili 5 merupakan perbandingan dari hasil

sekuen bakteri Caldocellum saccharolyticum, Caldibacillus, Vibrio, Aspergillus

aculeatus, Trichoderma reesei dan Agaricus bisporus dan mananase dari

kelompok eukariotik seperti Lycopersicon esculentum dan Mytilus edulis. Famili

26 terdiri atas hasil sekuen mananase dari Bacilli sp., Cellvibrio japonicus,

Pseudomonas fluorescens dan Rhodothermus marinus. Adapun enzim mananase

dari bakteri dan eukariotik terdapat dalam daftar famili 5 dengan suatu

pengecualian untuk beberapa fungi anaerobik, sedangkan untuk famili 26

sebagian besar terdiri atas bakteri origin. Namun dalam beberapa hal tertentu,

enzim mananase yang dihasilkan dari mikroorganisme yang bergenus sama dapat

diklasifikasikan pada kedua famili 5 dan 26 (Dhawan et al. 2007).

Mikroba Manolitik

Perairan laut merupakan ekosistem terbesar di bumi karena lebih dari 90%

biosfer terdiri atas sejumlah mikroorganisme laut bertanggung jawab atas 50%

produksi bahan-bahan utama untuk memenuhi kebutuhan ekosistem laut sebagai

kebutuhan makanan serta energi untuk mlakukan metabolisme bagi habitat yang

lain. Dalam lingkungan perairan laut, bakteri mempunyai peranan penting sebagai

pengatur siklus biogeokimia agar selalu bersifat konstan seperti proses asimilasi,

pengendapan, transformasi, perpindahan, dan remineralisasi unsur karbon yang

9

berada pada laut. Tingkat aktivitas mikroba laut dalam mendegradasi unsur

karbon dapat diteliti berdasarkan keberadaan nutrisi yang tersedia di habitatnya.

Karakteristik bakteri laut memerlukan air laut atau kadar garam, sehingga bakteri

laut digolongkan ke dalam kelompok bakteri halofilik, diantaranya bakteri

halofilik moderat yang membutuhkan 1% hingga 20% NaCl untuk

pertumbuhannya dan bakteri halofilik ekstrem yaitu memerlukan 15%

hingga 31% NaCl untuk pertumbuhannya (Ruyitno 2004).

Nutrisi karbon yang terdapat pada laut tidak seragam karena luasnya area

perairan menyebabkan nutrisi yang terkandung mempunyai tingkat konsentrasi

yang berbeda-beda. Tingkat kedalaman juga mempengaruhi jenis nutrisi yang

terkandung pada bagian laut tertentu, misalnya pada laut dalam hanya dihasilkan

nutrisi karbon yang berasal dari hasil degradasi mikroba yang berada pada

endapan tanah dan tidak mempunyai aktivitas terhadap sinar matahari. Sedangkan

untuk perairan laut dangkal mempunyai nutrisi yang lebih kaya karena mikroba

mendapatkan energi dari sinar matahari untuk melakukan aktivitas metabolisme

dan adanya interaksi dari fitoplankton yang dapat mendegradasi senyawa organik.

Oleh sebab itu mikroba pada permukaan air laut mempunyai kemampuan yang

lebih beragam dalam mendegradasi sumber karbon (Lauroa et al. 2009).

Dasar dari ketertarikan untuk melakukan eksplorasi mikroba laut untuk

memperkaya jenis enzim mananase karena selama ini eksplorasi lebih banyak

dilakukan untuk mikroba darat. Penelitian yang dilakukan sebelumnya telah

menghasilkan enzim mananase termofilik laut dari bakteri Rhodothermus

marinus, mikroba ini diisolasi dari perairan laut yang mempunyai suhu tinggi

sehingga mempunyai aktivitas enzim mananase yang cukup unik dalam

mendegradasi sumber manan seperti galaktomannan pada substrat locust bean

gum, mikroba manolitik laut ini telah diketahui menghasilkan enzim mananase

glikosidasi famili 26 yang bersifat termofilik yaitu tahan hingga suhu 85° C

setelah melalui proses karakterisasi enzim dan analisis sekuen DNA

(Politz et al. 2000).

Enzim pendegradasi polisakarida seperti selulase (β-1,4-glukanase) dan β-

1,4-xilanase memiliki struktur modul yang terdiri atas modul katalitik dan modul

pengikat karbohidrat (CBM). Berdasarkan pada kesamaan homologi hasil sekuen

10

asam amino, enzim glikosida hidrolase (GH) dan CBM diklasifikasikan menjadi

famili 112 dan 52. Sistem klasifikasi membagi enzim β-mananase menjadi dua

famili yaitu GH 5 dan 26. Enzim β-mananase telah diisolasi dari berbagai jenis

tanaman, fungi dan bakteri sehingga banyak pula literatur tentang gen yang

menyandi enzim mananase yang telah dikloning maupun disekuen berasal dari

mikroba darat, namun telah diketemukan mikroba laut Vibrio sp. Strain MA-138

penghasil enzim mananase yang telah dimurnikan dan diketahui memiliki enzim

mananase terbaru yaitu famili 27 berdasarkan modul pengikat karbohidratnya

yang menyandi enzim Man5C yaitu mempunyai wilayah terminal karbohidrat

pada spesifik domain, jenis enzim ini mempunyai kemampuan untuk mengikat β-

manan dan aktivitas katalitik yang tinggi dalam mendepolimerisasi substrat

polisakarida (Tanaka et al. 2009).

Manfaat Enzim Mananase

Pemanfaatan enzim mananase pada dunia industri sangat beragam karena

enzim ini mempunyai daya hidrolisis yang tinggi dan cukup stabil pada suhu

tinggi karena bersifat termostabil. keunggulan yang dimiliki oleh enzim mananase

membuatnya cukup populer, namun selain keunggulan enzim tersebut adapula

kekurangannya yaitu produksi enzim mananase cenderung membutuhkan biaya

produksi yang tinggi. Hal ini pula yang menyebabkan para peneliti berusaha untuk

mencari solusi untuk menekan biaya produksi dengan memanfaatkan mikroba

potensial yang dapat menghasilkan enzim mananase dengan tingkat produksi yang

tinggi dan kemurnian yang baik.

Penggunaan enzim mananase sebagai zat penambah pakan menunjukkan

beberapa pengaruh yang menguntungkan. Keuntungan tersebut terlihat dalam

kombinasi dengan bahan pakan lain seperti guar gum, kopra, alfalfa, bungkil

sawit dan kedelai yang mengandung manan dengan jumlah yang signifikan.

Untuk ternak monogastrik seperti unggas dan babi, manan merupakan komponen

pakan yang tidak dapat dicernakan karena beraksi sebagai faktor antinutrisi.

Pengaruh negatif manan telah dilaporkan mengurangi pertumbuhan ternak,

efisiensi penggunaan dan nilai nutrisi dalam pakan. Sebaliknya mananase ketika

ditambahkan dalam diet corn-soybean meal untuk ayam petelur dapat

11

meningkatkan produksi telur dan berat telur. Enzim mananase juga digunakan

sebagai pakan ternak yang dikombinasi dengan karbohidrat dalam diet ternak.

Hasilnya menunjukkan perbaikan terhadap tingkat pertumbuhan dan daya cerna

nutrisi (Dahwan et al. 2007).

Dalam industri makanan enzim mananase digunakan untuk produksi kopi

instan karena enzim ini dapat mengurangi viskositas ekstrak kopi sehingga

memudahkan proses hidrolisis manan kopi. Hal ini menyebabkan pengurangan

biaya energi dalam proses pengeringan dalam produksi kopi instan, karena air

yang terikat pada manan akan terlepas karena adanya degradasi enzim mananase.

Selain itu mananase digunakan untuk menghasilkan monooligomer spesifik yang

penting sebagai bahan pangan fungsional, seperti monooligomer yang berfungsi

sebagai prebiotik (Sachslehner et al. 2000).

Enzim mananase juga digunakan dalam detergen, berfungsi dalam

menfasilitasi penghilangan sisa kotoran dan kosmetika dari zat warna dan tanah.

Mananase pada detergen dapat berfungsi pula sebagai penstabil, pengembang dan

penghalus. Untuk beberapa jenis detergen, aplikasi mananase juga dapat

dikombinasikan dengan enzim-enzim lainnya seperti amilase, selulase, lipase,

pektinase, protease dan endoglukanase (Kensch et al. 2008).

Enzim mananase berfungsi sebagai zat pemutih pada bubur kertas.

Efektifitas enzimatis yang terjadi pada proses pemutihan selalu berdasarkan pada

jenis kayu yang digunakan dan metode pembuburan kertas, karena enzim

mananase hanya dapat bekerja apabila kadar ligninnya rendah (Zhang et al. 2000).

Enzim mananase pada industri minyak dan gas dapat diaplikasikan sebagai

stimulator untuk proses pematahan hidrolik, hal ini disebabkan sifat termostabil

dari enzim yang cukup baik. Sistem kerja enzim ini ialah mengurangi tingkat

viskositas larutan pada saat berlangsungnya proses pematahan hidrolik minyak

dan gas pada suhu tinggi (Dhawan et al. 2007).

Aplikasi yang lainnya digunakan dalam bidang pengolahan pangan dan

pakan yaitu untuk produksi manno-oligosakarida sebagai prebiotik penting pada

bungkil kelapa sawit baik untuk pangan maupun pakan. Produk prebiotik dapat

diperoleh dengan melakukan proses hidrolisis mananase terhadap bungkil kelapa

sawit atau galaktomanan yang kaya akan kandungan manno-oligosakarida dan D-

12

mannosa. Manno-oligosakarida dapat memacu pertumbuhan probiotik (seperti

Bifidobacteria dan Lactobacillus sp), dan menghambat pertumbuhan

enterobacteria Salmonella, serta menetralkan sifat-sifat antinutrisi dari lectin

(Yopi et al. 2007).

Bioinformatika

Bioinformatika merupakan ilmu yang dapat menghubungkan informasi

yang meliputi biologi molekular, struktur biokimia, enzimologi, biologi sel,

fisiologi dan patologi dengan menggunakan sistem komputerisasi berdasarkan

data yang telah dikumpulkan. Definisi bioinformatika adalah ilmu yang dapat

mengorganisir dan menganalisis data kompleks dengan ilmu biologi molekular

dan biokimia modern berdasarkan pada informasi yang tersimpan di dalam sekuen

nukleotida-DNA, sebagai dasar tersusunnya molekul kehidupan yaitu protein.

National Center for Biotechnology Information (NCBI) merupakan organisasi

yang diperkenalkan pada tahun 1988 di Serikat yang bertujuan untuk memproses

data secara komputerisasi dalam bidang biomedical dan biokimia. Pada saat itu

NCBI berada di dalam National Library of Medicine (NLM), yaitu badan yang

menangani data base biomedikal. NCBI sendiri secara spesifik bergerak dalam

bidang pengembangan alat analisis untuk membantu dalam mengerti proses

genetik dan molekular maupun sifat-sifat patogenik. Organisasi NCBI mempunyai

tujuan pokok, yaitu meliputi 1) menciptakan mekanisme otomatis yang dapat

menganalisis dan menyimpan data yang berhubungan dengan biologi molekular,

genetik dan biokimia. 2) memfasilitasi penggunaan data base dan perangkat lunak

yang tersedia kepada komunitas sains, seperti peneliti, pekerja dalam bidang

kesehatan maupun mahasiswa. 3) mengkoordinasi komunitas sains global di

seluruh dunia untuk mengumpulkan data genetik dan 4) melakukan penelitian

baru yang berhubungan dengan analisis struktur dan hubungan fungsional antara

molekul biologis secara komputerisasi (Rashidi et al. 2000).

16S rRNA Ribosom

RNA ribosom (rRNA) merupakan komponen inti zat pembentuk protein

pada suatu makhluk hidup. Molekul rRNA bersifat ubikuitus dengan fungsi yang

13

identik pada seluruh organisme. Ribosom merupakan kompleks ribonukleoprotein

yang terdiri atas dua subunit yaitu subunit kecil (small subunit) dan subunit besar

(large subunit). Terdapat tiga jenis RNA dalam ribosom prokariotik berdasarkan

nilai koefisien sedimentasi, yaitu 5S, 16S, dan 23S rRNA. Gen 16S rRNA

merupakan bagian dari subunit kecil ribosom dan berperan penting dalam

pengenalan ujung 5’–mRNA serta memposisikan pada letak yang tepat dalam

ribosom (Clarridge, 2004).

RNA ribosom pada semua sel memiliki daerah yang urutan basanya sangat

lestari dan beberapa daerah yang urutan basanya variatif. Perbandingan urutan

basa yang lestari berguna untuk mengkonstruksi pohon filogenetik karena

mengalami perubahan dengan relatif lambat dan mencerminkan kronologi evolusi

bumi. Sebaliknya, urutan basa yang bersifat variatif dapat digunakan untuk

melacak keragaman dan menempatkan galur-galur dalam satu spesies (Pangastuti,

2006).

Dari tiga jenis rRNA yang dimiliki prokariot, gen penyandi 16S rRNA

paling sering digunakan sebagai penanda molekular karena memiliki ukuran basa

yang paling ideal dari segi analisis statistika dibandingkan gen penyandi 5S rRNA

dan 23S rRNA. Molekul 5S rRNA memiliki ukuran basa yang terlalu pendek

sehingga tidak ideal untuk analisis statistika, sementara molekul 23S rRNA

memiliki struktur sekunder dan tersier yang cukup panjang sehingga menyulitkan

analisis. Tingkat kelestarian yang tinggi dan kemudahannya untuk mengukur

variasi dari 16S rRNA menjadikan gen penyandi 16S rRNA secara luas digunakan

pada penentuan taksonomi, filogeni (hubungan evolusioner), dan memperkirakan

laju penyebaran bakteri (Weisburg et al. 2001). Penelitian mengenai kekerabatan

evolusioner di antara mikroorganisme berdasarkan perbandingan urutan basa 16S

rRNA dipelopori oleh Carl Woese (Krane dan Raymer, 2003). Berdasarkan urutan

basa 16S rRNA, Woese mengajukan tiga domain dalam sistem klasifikasi yaitu

Archaea, Bacteria dan Eucarya. Dua bakteri dapat dikelompokkan dalam satu

genus bila memiliki kemiripan maksimum (maximum identity) ≥ 93%. Sementara

dua bakteri dianggap sebagai satu spesies bila memiliki kemiripan

maksimum ≥ 97% (Hagstrom et al. 2002),

14

Identifikasi 16S rRNA dengan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR)

Identifikasi molekuler digunakan untuk mempelajari kesamaan

deoxyribonucleic acid (DNA) atau homologi genetik diantara organisme.

Kesamaan DNA dapat dipelajari dengan sekuensing terhadap basa DNA atau

RNA dan hibridisasi DNA (Malik 2006). Penggunaan untai gen ribosomal RNA

untuk klasifikasi mikroorganisme saat ini merupakan salah satu analisis yang

cukup akurat untuk menentukan kekerabatan diantara mikroorganisme

(Suryadi 2002). Situs DNA molekul 16S rRNA dikenal mempunyai informasi

genetik yang cukup lengkap untuk melihat kekerabatan bakteri (Leblond et al.

1996).

Identifikasi 16S rRNA dapat dilakukan dengan metode Polymerase Chain

Reaction (PCR). PCR merupakan suatu metode untuk membuat salinan segmen

spesifik dari suatu DNA. Metode ini jauh lebih cepat daripada pengklon gen

dengan DNA plasmid atau DNA faga dan seluruhnya dilakukan in vitro

(Campbell 2002).

Gen pengkode 16S rRNA terdapat bagian penyimpan yang berguna untuk

mendisain primer universal PCR yang mampu memperbanyak beberapa fragmen

16S rRNA dari semua bakteri pathogen dan nonpatogen. Fragmen ini termasuk

bagian hipervariable yang tidak mudah termutasi dan mengandung tanda urutan

spesifik spesies yang berguna untuk mengidentifikasi bakteri hingga ke level

spesies (Israhmadini 2008).

Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi,

annealing dan ekstensi oleh enzim DNA polymerase. Setiap siklus dikondisikan

pada temperature berbeda yang telah diprogram oleh mesin yang disebut thermal

cycler. Dasar siklus PCR ada 30-35, siklus ini meliputi: denaturasi (95°C) untaian

ganda DNA dipisahkan, annealing (55-60°C) primer dibiarkan berikatan dengan

ujung-ujung urutan target yang spesifik, dan ekstensi (72°C). Taq polimerase

menambahkan nukleotida pada ujung 3’ primer dengan menggunakan untai DNA

yang lebih panjang sebagai cetakannya (Kuchel et al. 1998). Sedangkan untuk

waktu tergantung pada panjang pendeknya ukuran DNA yang diinginkan sebagai

produk amplifikasi. Campuran reaksi PCR terdiri atas komponen-komponen yaitu

15

template DNA, buffer, dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), primer dan unit taq

polimerase.

Ribosomal Database Project (RDP)

Metode Ribosomal Database Project (RDP) adalah program yang

menggunakan pengukuran gen berdasarkan program algoritma. Kesesuaian

susunan yang diperoleh dapat dibandingkan dengan gen yang sudah ada

sebelumnya. RDP, menyediakan metode untuk pencarian database nukleotida dan

protein secara cepat dan akurat. RDP juga dapat digunakan untuk mengetahui

hubungan fungsional dan evolusioner dari spesies yang berhubungan. Secara

umum perangkat lunak RDP dpat diaplikasikan secara online melalui

http://www.rdp.com yaitu meliputi memasukan data sekuen hasil bioedit, memilih

program dan data base yang diinginkan, memilih format output dan melakukan

pencarian database dan menyimpan hasilnya. Sedangkan untuk melakukan

perbandingan pohon kekerabatan dapat menggunakn program MEGA5

(Cole et al. 2009).

16

17

METODOLOGI

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan dari bulan Agustus 2011 sampai Maret 2012

di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi pada Pusat Penelitian Bioteknologi

Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong-Bogor.

Bahan dan Alat

Alat yang digunakan adalah tabung analisis, cawan petri, oze, bunsen,

kapas, gelas piala, mikrotips, erlenmeyer, neraca analitik, sentrifuge, mikropipet,

tabung Eppendorf, thermometer, penangas air, pH meter Jenway 3505, magnetic

stirer, hot stirer IKA RH basic 2, shaker incubator TAITEC Bioshaker BR-23FP,

laminar air flow Bioclean Bench Sanyo, autoclave Tommy SX-500, spreader,

inkubator bakteri SANYO, PCR ASTEC, elektroforesis Nyx Technik MIR-153,

UV gel doc Scope WD, Freezer SANYO Ultra low. Bahan yang digunakan

adalah sample air laut dengan media untuk proses pengkayaan dan identifikasi

kualitatif menggunakan aquades, Artificial Sea Water, agar powder, substrat

(Locust bean gum), pepton, ekstrak khamir, (NH4)2.SO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O,

CO (NH2)2, CaCl2, FeSO4.7H2O, MnSO4.7H2O, ZnSO4.7H2O, CoCl2, HCl,

NaOH, NaCl, pewarna congo red. Bahan yang digunakan dalam proses analisis

enzim mananase secara kuantitatif adalah Reagen berupa reagen dinitrosalisilat

(DNS) yang terdiri atas DNS, NaOH padat, fenol, Na2SO3, dan Kalium Natrium

Tartrat (KNa-tartrat). Bahan yang digunakan dalam proses identifikasi

gen 16S rRNA dan kloning adalah strain bakteri potensial penyandi mananase,

InstaGene TM

Matrix Biorad, agarosa, TAE (Tris Asetat EDTA), Etidium

bromida, go taq®green master mix, primer 9F, primer 1510R.

Cara Kerja

Isolasi Mikroba Laut

Mikroba laut yang digunakan dalam penelitian berasal dari Pulau Pari

Teluk Jakarta, disampling dengan menggunakan metode sea water direct

18

sampling (sampel berupa air laut). Bakteri penghasil mananase diisolasi dengan

teknik pengayaan mengikuti Mandels dan Stemberg (1976) dengan memodifikasi

sumber karbon. Komposisi media pengayaan, skrining, purifikasi dan identifikasi

secara lengkap seperti berikut: Substrat Locust bean gum 0,5%; Pepton 0,075%;

Ekstrak khamir 0,05%; Mineral (NH4)2.SO4 0,14%; KH2PO4 0,2%; MgSO4.7H2O

0,03%; CO (NH2)2 0,03%; CaCl2 0,03%; FeSO4.7H2O 0,0005%; MnSO4.7H2O

0,00016%; ZnSO4.7H2O 0,00014%; CoCl2 0,0002% dan pH media 6.0. Mikroba

mannolitik diisolasi dari kultur pengkayaan dengan locust bean gum sebagai

sumber substrat (sumber karbon berupa manan). Kultur pengkayaan yang telah

diinokulasikan air laut hasil sampling diinkubasi dalam shaker incubator selama

satu minggu, kecepatan putar 150 rpm pada suhu ruang. Proses isolasi dilakukan

dengan cara menginokulasikan hasil kultur pengayaan sebanyak 20 µL dengan

faktor pengenceran 10-4

dan 10-5

pada media padat dengan cara disebar dengan

menggunakan spreader kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang.

Proses pemurnian isolat dilakukan dengan cara pick –up koloni tunggal yang telah

tumbuh pada media isolasi dan ditumbuhkan pada media padat untuk proses

identifikasi (Mandels dan Sternberg, 1976).

Uji Bakteri Manolitik Potensial

Identifikasi bakteri potensial penghasil enzim mananase dengan cara uji

kualitatif dengan pewarnaan menggunakan metode congo red. Bakteri laut yang

telah murni diinokulasikan pada media padat (komposisi media pengayaan

dengan konsentrasi agar 1,5%) yang mengandung substrat manan (Locust Bean

Gum 0,5%), kemudian diinkubasi selama 48 jam. Setelah itu ditambahkan larutan

pewarna congo red dengan konsentrasi 0,2% dan diinkubasi selama

15-30 menit pada suhu ruang, kemudian dilakukan pencucian sebanyak 3 kali

dengan menggunakan larutan NaCl dengan konsentrasi 2%. Bakteri mannolitik

potensial yang dapat menghasilkan enzim mananase dapat diketahui secara visual

yaitu dengan nampaknya zona bening disekitar zona tumbuh koloni (Yopi et al.

2007).

19

Uji Aktivitas Enzim Mananase

Aktivitas enzim mananase diuji dengan memipet sebanyak 0,5 mL substrat

locust bean gum 0,5% direaksikan dengan 0,5 mL enzim mananase lalu

diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang. Reaksi dihentikan dengan

penambahan 1,5 mL reagen dinitrosalisilat (DNS). Perlakuan kontrol dengan cara

substrat direaksikan dengan DNS lalu ditambahkan enzim. Sampel dan kontrol

dididihkan selama 15 menit lalu didinginkan. Setelah dingin suspensi divorteks

dan diukur absorbansinya pada λ= 540 nm (Miller 1959). Pembuatan kurva

standar dilakukan dengan mereaksikan berbagai konsentrasi manosa dari 0-10

mg/ml sebanyak 1 mL dengan 1,5 mL DNS lalu dididihkan selama 15 menit dan

didinginkan. Setelah dingin suspensi divorteks dan diukur absorbansinya

pada λ= 540 nm. Satu unit aktivitas enzim mananase (U) didefinisikan sebagai

sejumlah enzim yang dapat mengkatalisis konversi dari 1 μmol substrat manan

menjadi manosa dalam 1 menit (Bintang 2010).

Identifikasi Mikroba berdasarkan Analisis Gen 16S-rRNA

Isolasi Genom Total

Identifikasi bakteri manolitik diawali dengan mengisolasi DNA genom

total menggunakan metode dari kit InstaGene TM

Matrix BioRad. Koloni isolat

murni sebanyak satu ose dengan 250 µL mili Q steril dan disentrifuge

selama 1 menit dengan kecepatan 10,000 rpm. Supernatan dibuang sedangkan

pelet ditambahkan kit InstaGene TM

Matrix BioRad sebanyak 50 µL, kemudian

larutan diinkubasi pada suhu 56ºC selama 15-30 menit dan divortex dengan

kecepatan 100 rpm selama 10 detik dan selanjutnya dipanaskan pada suhu 100ºC

selama 8 menit. Tahap akhir ekstraksi DNA yaitu memisahkan DNA (Supernatan)

dari komponen lainnya (pelet) dengan sentrifuge pada kecepatan 10,000 rpm

selama 2 menit. Template DNA siap diamplifikasi dengan PCR, jika template

tidak langsung dipergunakan maka harus disimpan pada suhu ­20°C.

20

Analisis PCR

DNA Template diamplifikasi dengan mengambil 2 µL (60 ng/1µL)

template yang dicampur dengan 25 µL “Gotaq”. Gotaq adalah campuran dNTP,

primer dan buffer PCR. Selanjutnya ditambahkan masing-masing 1 µL primer

forward 9F 50 µLM (5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-) dan 1 µL primer reverse

1510R 50 µLM (5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-) dan ditambahkan milli-Q

steril hingga mencapai volume 50 µL. Amplifikasi dilakukan dalam thermocycler

dengan tahap pre denaturasi awal selama 2 menit pada suhu 95ºC, tahap

denaturasi selama 30 menit pada suhu 95ºC tahap annealing selama 1 menit pada

suhu 55ºC dan tahap extension selama 2 menit pada suhu 72°C. Banyaknya siklus

amplifikasi yang digunakan yaitu 30 siklus.

Elektroforesis Hasil PCR

Proses amplifikasi dengan PCR telah selesai maka dilakukan analisis

elektroforesis untuk mendeteksi DNA dan keberhasilan hasil proses amplifikasi.

Produk PCR sebanyak 3 µL ditambahkan ke dalam sumur gel agarosa, sedangkan

untuk marker sebanyak 0,5 µL ditambahkan 0,5 µL Loading dye Fermentas

dan 2 µL milli-Q dan dicampur kemudian dimasukan dalam sumur yang

berbeda.Proses elektroforesis dilakukan selama 60 menit dengan voltase 50 V

dalam larutan Buffer TAE.

DNA hasil amplifikasi yang telah dielektroforesis divisualisaikan dengan

perendaman agarosa yang mengandung DNA target ke dalam larutan etidium

bromida selama 15 menit, setelah itu dibilas dengan aquades selama 10 menit.

Dengan menggunakan UV transluminator, pita DNA akan terlihat dan dapat

diketahui ukurannya berdasarkan penanda ukuran molekul yang dinyatakan

dengan base pair (bp).

Konstruksi Pohon Filogenetika

Bakteri manolitik yang telah berhasil diamplifikasi gen 16S rRNA-nya

dapat dilihat kekerabatannya dengan prokariota lain yang ada di basis data

berdasarkan sekuens gen 16S-rRNA-nya. Sekuen dilakukan di Laboratorium 1st

BASE Singapura dan data sekuen parsial yang diperoleh akan melalui proses

21

pengeditan dengan menggunakan program Bioedit. Setelah diperoleh data hasil

contiq urutan nukleotida berdasarkan amplifikasi dengan primer universal, maka

homologinya akan dibandingkan dengan prokariota lain yang ada pada basis data

di Gene Bank. Analisis klaster dilakukan menggunakan data base dari situs web

RDP (Ribosomal Database Project) dengan situs (http://www.rdp.com).

sedangkan pembuatan pohon filogenetik menggunakan program MEGA 5.

22

23

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil Isolasi dan Pemurnian Bakteri Manolitik Laut

Penelitian ini diawali dengan proses sampling di perairan laut pulau Pari

kepulauan seribu kota Jakarta untuk mendapatkan bakteri manolitik potensial

penghasil enzim mananase. Pulau Pari merupakan salah satu kelurahan di

kecamatan Kepulauan eribu elatan kabupaten Kepulauan eribu provinsi DKI

Jakarta. Pulau Pari terletak di gugusan Kepulauan eribu dengan letak geografis

05 51 22 Lintang elatan dan 106 36 02 ujur Timur. Pulau Pari juga

merupakan tempat wisata, budidaya rumput laut serta tempat penelitian kekayaan

laut yang difasilitasi oleh Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) yang

bertujuan untuk melakukan berbagai penelitian demi kepentingan kelestarian alam

di pulau ini (Gambar 3).

(a) (b)

(c) (d)

Gambar 3. Lokasi Sampling di Pulau Pari Kepulauan Seribu DKI Jakarta

Laut dalam (a), area budidaya rumput laut (b), laut dangkal (c),

dan pesisir pantai (d).

25

Hasil pengamatan terhadap isolat Pengukuran aktivitas mananase ini dapat

dilakukan dengan menghitung indeks manolitik (IM). IM dihitung dengan

mengukur diameter koloni dan diameter zona jernih yang terbentuk (Downie et al.

1994).

Bakteri manolitik laut diinokulasikan pada media agar yang mengandung

substrat manan (locust bean gum) kemudian diinkubasi selama 72 jam pada suhu

ruang. Selama fase inkubasi maka bakteri manolitik akan mensekresikan enzim

mananase untuk mendegradasi substrat manan menjadi manooligosakarida atau

manosa. Mananase yang telah mendegradasi manan akan membentuk zona

spesifik seperti pada gambar 5 dibawah ini. Zona akan terlihat lebih jelas ketika

diberikan pewarna congo red hal tersebut dikarenakan congo red dapat terikat

pada substrat manan yang mengandung β-1.4-D manopiranosil sehingga media

akan menjadi merah sedangkan zona jernih terjadi karena tidak terbentuk ikatan

congo red dan manan (Downie et al. 1994).

(a) (b) (c)

Gambar 5. Hasil analisis kualitatif bakteri manolitik metode pewarnaan congo

red Pari 3 (a), Pari 4 (b), dan Pari 5 (c).

Perbedaan diameter zona jernih dan IM belum dapat menunjukan aktivitas

enzim secara spesifik (Gambar 5). Oleh karena itu perlu dilakukan produksi

IM =

26

mananase untuk mengukur aktivitas enzim secara kuantitatif agar data yang

diperoleh lebih akurat.

Hasil pengamatan aktivitas enzim mananase secara kualitatif berdasarkan

indeks manolitik dapat dilihat pada tabel dibawah ini. Uji ini menujukkan 3 buah

isolat potensial yang mempunyai nilai IM yang tinggi yaitu isolat Pari 3

mempunyai IM sebesar 4,33 dengan morfologi koloni putih keruh. Isolat Pari 4

mempunyai IM sebesar 2,40 dengan morfologi tepi koloni bening dan bagian

tengah koloni berwarna putih. Sedangkan isolat pari 5 mempunyai IM sebesar

2,60 dengan keterangan morfologi berwarna putih kecokelatan.

Tabel bakteri manolitik laut pendegradasi manan hasil isolasi dari pulau Pari

Kepulauan Seribu

No Isolat Uji Kualitatif CongoRed 0,2%

Ø isolat (mm)

Ø zona (mm)

Index

Manolitik Keterangan

1 Pari 1 6 15 1,5 Putih keruh

2 Pari 2 7 15 1,14 Putih keruh kekuningan

3 Pari 3 6 32 4,33* Putih keruh

4 Pari 4 5 17 2,40* tepi bening. bagian tengah berwarna putih

5 Pari 5 5 18 2,60* Putih kecoklatan

6 Pari 6 8 9 0,13 tepi bening. bagian tengah berwarna putih.

7 Pari 7 10 10 0,00 Bentuk melebar dari tengah. gradasi warna putih

8 Pari 8 8 10 0,25 Putih kekuningan

9 Pari 9 6 8 0,33 Putih kekuningan

10 Pari 10 7 10 0,43 Putih kekuningan

11 Pari 11 9 9 0,00 Putih kekuningan

12 Pari 12 10 18 0,80 Putih kekuningan

13 Pari 13 5 9 0,80 Putih kekuningan

14 Pari 14 5 6 0,20 Putih kekuningan

15 Pari 15 5 7 0,40 Putih kekuningan

16 Pari 16 9 17 0,89 Putih kekuningan

17 Pari 17 7 7 0,00 Putih kekuningan

18 Pari 18 6 15 1,50 Putih kecoklatan

19 Pari 19 9 11 0,22 Putih kekuningan

20 Pari 20 6 8 0,33 Putih kekuningan

Keterangan: * (Isolat Terpilih)

27

Aktivitas Enzim Mananase

Aktivitas enzim mananase dilakukan pada ketiga bakteri potensial yaitu

isolat Pari 3, Pari 4 dan Pari 5 yang mempunyai nilai IM yang cukup tinggi hasil

dari uji kualitatif dengan pewarnaan congo red. Penentuan aktivitas enzim

mananase menggunakan metode dinitrosalicylic acid dengan locust bean gum

sebagai substratnya. Pengukuran aktivitas enzim mananase berdasarkan satuan

unit yaitu satu unit aktivitas enzim mananase didefinisikan sebagai banyaknya

enzim yang dapat memproduksi 1 µmol manosa dalam 1 menit

(Lehninger et al. 2004). Perhitungan aktivitas enzim mananase adalah sebagai

berikut:

Keterangan: C = konsentrasi enzim

p = faktor pengenceran

t = waktu

BM = berat molekul

Hasil pengukuran aktivitas enzim mananase untuk isolat Pari 3

menunjukkan kurva pertumbuhan jumlah sel mempunyai pola yang sama dengan

aktivitas enzim mananasenya (Gambar 6). Data aktivitas enzim dilengkapi dengan

data kurva pertumbuhan yaitu mengunakan metode pengukuran panjang

gelombang 660 nm untuk mendapatkan hubungan antara kisaran jumlah sel

bakteri yang tumbuh dengan tingkat aktivitas enzimnya selama masa fermentasi.

Aktivitas enzim dengan pertumbuhan sel bakteri manolitik Pari 3 dapat dilihat

pada gambar 6 dan diperoleh keterangan bahwa tingkat aktivitas enzim paling

tinggi terlihat pada hari ke 2 yaitu 2,474 U/mL hal tersebut dapat terlihat pada

grafik dibawah. Aktivitas enzim yang optimum sesuai dengan jumlah sel bakteri

yang mencapai jumlah optimum atau mencapai puncak tertinggi pada hari kedua

dan penurunan aktivitas enzimnya juga sesuai dengan jumlah sel yang semakin

menurun.

Aktivitas enzim mananase (U/mL) =

28

Pola degradasi enzim mananase yang dihasilkan oleh isolat Pari 3

merupakan pola degradasi tipe eksoenzim karena substrat dimanfaatkan

berbanding lurus dengan jumlah sel, sehingga dapat diasumsikan bahwa enzim

yang terbentuk memotong gugus manosa dari ujung terluar ikatan polisakarida

dengan menghasilkan monosakarida berupa manosa. Hal tersebut dapat

dikarenakan substrat telah sempurna terhidrolisis (Aryanthi 2008).

Gambar 6. Aktivitas enzim mananase dan jumlah sel bakteri Pari 3

( ) OD 660 nm dan ( ) Aktivitas enzim mananase.

Pada grafik perbandingan aktivitas enzim dan kurva pertumbuhan bakteri

manolitik laut Pari 4 nampak pada gambar 7 dan menerangkan pada hari ke 2 dan

ke 3 memiliki nilai aktivitas yaitu 1,193 U/mL dan 1,174 U/mL. Aktivitas enzim

dengan kurva pertumbuhan Pari 4 dan Pari 5 dapat disimpulkan bahwa kedua

bakteri tersebut mempunyai fase optimum jumlah sel yang cukup stabil dan dari

banyaknya gula reduksi yang terbentuk bersifat tidak konstan maka dapat

disimpulkan bahwa enzim yang dihasilkan merupakan enzim mananase tipe

endoenzim yang dapat memotong secara random dari sisi tengah ikatan rantai

linier polisakarida, sehingga pada analisis gula reduksi manosa yang terbentuk

tidak dipengaruhi jumlah sel yang terbentuk namun lebih kepada kinerja enzim

yang menghasilkan monosakarida.

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.000

0.900

1.800

2.700

0 24 48 72 96

A 6

60

nm

U/m

L

Waktu (Jam)

29

Gambar 7. Aktivitas enzim mananase dan jumlah sel bakteri Pari 4

( ) OD 660 nm dan ( ) Aktivitas enzim mananase.

Pada gambar 8 dapat terlihat aktivitas enzim bakteri manolitik Pari 5

meningkat pada hari ke 3 yaitu sebesar 1,087 U/mL namun pada grafik jumlah sel

hari ketiga menunjukan penurunan, hal ini dapat simpulkan bahwa substrat yang

tersedia telah maksimal dihidrolisis oleh enzim secara random pada hari pertama

hingga kedua menjadi golongan manobiosa atau manotriosa yang kemudian akan

didegradasi secara sempurna menjadi monosakarida pada hari ketiga dan setelah

seluruh substrat telah terdegradasi dengan sempurna menjadi monosakarida maka

aktivitas enzim menurun pada hari ke empat.

Gambar 8. Aktivitas enzim mananase dan jumlah sel bakteri Pari 5

( ) OD 660 nm dan ( ) Aktivitas enzim mananase.

0.000

0.060

0.120

0.180

0.000

0.300

0.600

0.900

1.200

1.500

0 24 48 72 96

A 6

60

nm

U/m

L

Waktu (Jam)

0.000

0.060

0.120

0.180

0.000

0.400

0.800

1.200

0 24 48 72 96

A 6

60

nm

U/m

L

Waktu (Jam)

30

DNA Genom

Isolasi DNA genom bakteri manolitik laut dilakukan sesuai dengan prosedur

yang tertera pada Kit INSTAGENE BioRad. Hasil pengamatan dapat dilihat pita

DNA genom pada elektroforesis gel agarose dengan agarose 1 % untuk

mengetahui ukuran pasang basa yang pada genom maka digunakan standar yaitu

marker 1 kb dari Gene Ruler ™ (Ladder) Fermentas. Hasil elektroforesis DNA

genom menunjukkan keberhasilan dalam mengisolasi genom dari ketiga bakteri

manolitik terpilih dengan ditandai oleh adanya pita-pita DNA yang nampak pada

agarosa yang sesuai dengan Marker yang dijadikan acuan, yaitu di atas 6000 bp.

Gambar 9. Elektroforegram DNA genom bakteri manolitik laut

Marker (1), Pari 3 (2), Pari 4 (3), dan Pari 5 (4).

Hasil elektroforesis menunjukkan pita yang terlihat mempunyai pola

yang smear. Hal tersebut dikarenakan volume contoh yang dimasukan ke dalam

sumur agarosa terlalu sedikit ataupun terlalu lamanya waktu perendaman dengan

etidium bromida dan pada saat pencucian (Gambar 9).

1 2 3 4

31

Amplikon Gen 16S rRNA

DNA Genom yang telah berhasil diisolasi selanjutnya di PCR dengan

menggunakan universal primer forward 9F (5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-)

dan primer reverse 1510R (5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-). Amplifikasi

dilakukan dalam thermocycler dengan kondisi pre-denaturasi awal selama 2 menit

pada suhu 95ºC, tahap denaturasi selama 30 menit pada suhu 95ºC tahap

annealing selama 1 menit pada suhu 55ºC dan tahap extension selama 2 menit

pada suhu 72°C. Hasil amplifikasi gen 16S rRNA selanjutnya dapat dilihat dengan

elektroforesis agarosa 1%. Proses elektroforesis dilakukan dengan menggunakan

acuan marker 1 kb dari Gene Ruler ™ (Ladder) Fermentas.

Pita-pita penanda pada maker 1 kb memiliki 14 pita dengan ukuran

terbesar yaitu 10.000 pasang basa sedangkan yang terkecil yaitu 250 pasang basa.

Sedangkan pita bakteri manolitik laut Pari 3, Pari 4 dan Pari 5 yang telah melalui

proses PCR berhasil diisolasi (Gambar 10) dengan menghasilkan pita pada

elektroforegram sesuai dengan ukuran pasang basa untuk mengidentifikasi gen

16S rRNA yaitu dengan kisaran 1.500 pasang basa. Sehingga dapat disimpulkan

bahwa primer serta kondisi PCR yang digunaka dapat mengamplifikasi amplikon

dengan baik sesuai dengan target gen 16S rRNA (Lauroa et al. 2009).

Gambar 10. Elektroforegram amplikon hasil identifikasi 16S rRNA

Marker (1), Pari 3 (2), Pari 4 (3), Pari 5 (4).

6000 bp

3000 bp

1500 bp

1000 bp

1 2 3 4

32

Pohon Filogenetik Bakteri Manolitik Pari 3

Amplikon yang telah berhasil diisolasi selanjutnya akan ditentukan urutan

nukleotidanya dengan cara sekuensing. Sekuensing gen hasil PCR 16S rRNA

dilakukan di Laboratorium 1st Base Singapura. Identifikasi gen 16S rRNA dari

bakteri manolitik laut Pari 3 berdasarkan hasil sekuensing berupa data

kromatogram dan urutan nukleotida, dari data kromatogram maka dapat terlihat

puncak-puncak yang tidak sempurna (Lampiran 5), oleh sebab itu perlunya

dilakukan pengeditan dengan program bioedit. Selanjutnya data urutan hasil

pengeditan pada ujung forward dan reverse akan melalui proses contiq sehingga

dapat diperoleh urutan gen 16S rRNA yang lengkap (Lampiran 2). Hasil urutan

contiq akan diolah oleh program RDP yang akan dibandingan dengan data yang

sudah pada data Gene Bank, selanjutnya dapat disimpulkan bahwa isolat Pari 3

tergolong atas domain Bacteria, filum Firmicutes, kelas Bacilli, ordo Bacillaceae

dan genus Bacillus.

Untuk melihat kekerabatan Pari 3 berdasarkan perbandingan dengan bakteri

yang telah diketahui susunan basannya pada Bank data Ribosomal Database

Project sehingga untuk mempermudah mengetahui identitas bakteri tersebut dapat

terlihat pada pohon filogenetik (Gambar 11). Sedangkan untuk keterangan lebih

spesifik yang diperoleh dari bank data dengan menggunakan perangkat RDP maka

disimpulkan bahwa Pari 3 memiliki kekerabatan dekat dengan Bacillus safensis

(FO-036b;AF234854) dengan nilai keidentikan sebesar 0,919 dengan urutan basa

yang sama sebanyak 1354 pasang basa dan Bacillus pumilus (ATCC

7061;AY876289) dengan nilai keidentikan sebesar 0,920 dengan urutan basa yang

sama sebanyak 1352 pasang basa. Menurut Hagstrom 2002. Jika kemiripan ≥ 93%

maka dianggap satu spesies yang sama namun menurut Schloss dan Handelsman

2004. bila kemiripan maksimum ≥ 97% maka dianggap satu spesies yang sama.

Hasil identifikasi bakteri Pari 3 mempunyai hasil kekerabatan 91,1% dengan

Bacillus safensis dan 92% dengan Bacillus pumillus.

Dari keduanya menyatakan presentase kekerabatan yang kurang dari 93%

dan 97%. oleh karena itu dapat diduga bahwa bakteri Pari 3 merupakan strain baru

dan dapat diteliti lebih lanjut.

33

34

dengan Bacillus anthracis dan 92,2% dengan Bacillus cereus. Menurut Hagstrom

2000, jika kemiripan ≥ 93% maka dianggap satu spesies yang sama, maka dapat

diduga bahwa bakteri Pari 4 merupakan Bacillus anthracis.

.

Gambar 12. Pohon filogenetik bakteri manolitik laut Pari 4 dan Pari 5.

Dari data yang terlihat diatas maka penentuan species dari Pari 5 memiliki

kekerabatan dekat dengan Baccilus anthracis (ATCC 14578; AB190217) sebesar

0,971 dengan urutan basa yang sama sebanyak 1236 pasang basa dan Bacillus

Bacillus_mycoides_(T)_ATCC6462.

Bacillus_weihenstephanensis_(T)_DSM11821.

Bacillus_thuringiensis_(T)_IAM_12077.

Bacillus_cereus_(T)_ATCC_14579.

Bacillus_cereus_(T)_ATCC_14579.(2)

Bacillus_anthracis_(T)_ATCC_14578.

Pari_4

PARI_5

Bacillus_luciferensis_(T)_LMG_18422.

Bacillus_panaciterrae_(T)_Gsoil_1517.

Falsibacillus_pallidus_(T)_CW_7.

Bacillus_aeolius_(T)_type_strain:_4-1.

Bacillus_vireti_(T)_LMG_21834.

Bacillus_fastidiosus_(T)_DSM_91.

Bacillus_litoralis_(T)_SW-211.

Bacillus_humi_(T)_type_strain:_LMG_22167.

Bacillus_galactosidilyticus_(T)_type_strain:_LMG_17892.

Aeribacillus_pallidus_(T)_DSM_3670*.

Paraliobacillus_ryukyuensis_(T).

Paraliobacillus_quinghaiensis_(T)_YIM_C158.

Anaerobacillus_arseniciselenatis_(T)_E1H.

Bacillus_halodurans_(T)_DSM_497T.

Bacillus_gibsonii_(T)_DSM_8722.

Bacillus_pseudofirmus_(T)_DSM_8715.

Bacillus_thermocloacae_(T)_DSM_5250.

Marinococcus_halophilus_(T)_DSM_20408.

Marinococcus_luteus_(T)_YIM_91094

Aquifex_pyrophilus_(T)_Kol5a.

100

100

96

46

62

89

88

65

51

46

41

31

78

5

15

17

53

100

63

47

45

46

44

100

0.005

35

cereus (ATCC 14579;AE016877) sebesar 0,952 dengan urutan basa yang sama

sebanyak 1428 pasang basa. Hasil identifikasi bakteri Pari 5 mempunyai hasil

kekerabatan 97,1% dengan Bacillus anthracis dan 95,2% dengan Bacillus cereus.

Menurut Hagstrom 2002, jika kemiripan ≥ 93% maka dianggap satu spesies yang

sama, maka dapat diduga bahwa bakteri Pari 5 merupakan Bacillus anthracis.

Kekerabatan Pari 4 dan 5 diketahui berdasarkan perbandingan dengan

bakteri yang telah diketahui urutan basannya pada Gene Bank dengan

menggunakan program Ribosomal Database Project dan program MEGA 5 yang

digunakan untuk melakukan konstruksi pohon filogenetik untuk mengetahui

kekerabatan dan rentang evolusi bakteri tersebut. Konstruksi pohon filogenetika

dari kedua isolat Pari 4 dan Pari 5 dibuat satu pohon karena satu sama lain

mempunyai kemiripan yang hampir identik setelah dibandingkan dengan Gene

Bank, dan hasil pohon filogenetika yang terbentuk dapat dilihat pada Gambar 12.

36

37

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Penelitian ini telah berhasil mengisolasi 20 bakteri manolitik laut lokal

Indonesia dari pulau Pari Kepulauan Seribu kota Jakarta yang dapat mendegradasi

senyawa manan. Hasil karakterisasi enzim mananase secara kualitatif dengan

metode congo red menunjukkan bahwa 3 bakteri diantaranya mempunyai aktivitas

enzim tertinggi yaitu dengan kode isolat Pari 3, Pari 4, dan Pari 5. Hasil analisis

aktivitas enzim mananase pada kedua isolat Pari 3 pada hari kedua mempunyai

tingkat aktivitas tertinggi yaitu 2,474 U/mL dengan tipe degradasi substrat manan

yang bersifat eksoenzim karena enzim memotong dari ikatan luar rantai linier

manan. Pari 4 dan Pari 5 menunjukan aktivitas enzim mananase tertinggi berturut-

turut 1,193 U/mL dan 1,087 U/mL dengan tipe degradasi substrat manan yang

bersifat endoenzim atau enzim yang menghidrolisis rantai linier polimer secara

random hingga menghasilkan gula reduksi monosakarida galaktosa dan manosa

maupun disakarida seperti manobiosa. Analisis lebih lanjut dilakukan secara

molekuler berdasarkan gen 16S rRNA untuk dapat mengidentifikasi genus dan

spesies ketiga isolat potensial tersebut. Hasil dari sekuensing gen 16S rRNA telah

menunjukkan urutan basa nukleotida yang harus melalui proses pengeditan

dengan program bioedit sehingga didapatkan urutan contiq basa nukleotida. Hasil

dari contiq akan dibandingkan oleh data pada Gene Bank (NCBI) dengan

menggunakan program RDP. Hasil perngolahan data menunjukkan bahwa bakteri

Pari 3 mempunyai kekerabatan 91,1% dengan Bacillus safensis dan 92% dengan

Bacillus pumillus karena keduanya menunjukkan presentase kekerabatan yang

kurang dari 97%, maka dapat diduga bahwa bakteri Pari 3 merupakan strain baru

dan dapat diteliti lebih lanjut. Hasil identifikasi bakteri Pari 4 mempunyai

kekerabatan 94,1% dengan Bacillus anthracis dan 92,2% dengan Bacillus cereus.

Sedangkan identifikasi bakteri Pari 5 mempunyai hasil kekerabatan 97,1% dengan

Bacillus anthracis dan 95,2% dengan Bacillus cereus, Menurut Hagstrom 2002,

jika kemiripan ≥ 93% maka dianggap satu spesies yang sama, maka dapat diduga

bahwa bakteri Pari 4 dan Pari 5 merupakan Bacillus anthracis.

38

Saran

Penelitian ini sebagai langkah awal pemanfaatan biodiversitas mikroba

laut lokal sebagai sumber penghasil enzim mananase. Untuk penelitian lanjutan

akan sangat baik jika dapat diidentifikasi gen penyandi enzim mananasenya agar

dapat dikembangkan secara rekayasa genetika dalam memproduksi enzim

mananase untuk skala industri atau komersial.

39

DAFTAR PUSTAKA

Aryanthi. D. 2008. Uji kualitatif dan kuantitatif enzim mananase isolat bakteri laut

dari perairan laut cilacap dan pantai marina. Laporan praktek kerja

lapangan. Program Keahlian Analisis Kimia Direktorat Program Diploma –

Institut Pertanian Bogor.

Campbell. Neil A.. Jane B. Reece. Lawrence. Mitchell. 2002. Biologi Edisi

Kelima Jilid I. Erlangga. Jakarta: 438 hlm.

Clarridge III JE. 2004. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for

identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases.

Clinical Microb Rev 17(4):840-862.

Cole JR. Wang Q. 2009. The Ribosomal Database Project: Improved alignments

and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Res: D141-D145.

Dhawan S. Kaur J. 2007. Microbial mananases: an overview of production and

applications. Critical Reviews in Biotechnology. 27:197–216. 2007.

Downie B. Hilhorst HWM. Bewley JD. 1994. A New assay for quantifying endo-

β-D-Mannanase Activying Using Congo Red Dye. Pyhtochemistry 36: 829-

835.

Duffaud GD et al. 1997. Purification and characterication of extremely

thermostable mananase. mannosidase. and a-galactosidase from the

hyperthermophilic eubacterium Thermotoga neapolitana 5068. Applied and

Environ Microbiol 63:169-177.

Hagstrom CR. Wipat A. 2002. Genome management and analysis: Prokaryotes.

di dalam : Ratledge C. Kristiansen B. editor. Basic Biotechnology. Ed-

2nd United Kingdom: Cambridge University Press. Hlm 17-44.

Henrissat et al. 1993. New families in the classification of glycosyl hydrolases

based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 293: 781–788.

Hilge M et al. 1998. High-resolution native and complex structures of

thermostable mananase from Thermomonaspora fusca substrate specificity

in glycosyl hydrolase family 5. J. Structure 6:1433-1444.

Israhmadini U. 2008. Identifikasi dan karakterisasi bakteri laut penghasil selulose

dengan metode 16S rRNA. [skripsi]. Jurusan Biologi FMIPA-Universitas

Negeri Jakarta.

Kagawa et al. 2003. Crystal structure of bacillus substilis α-amylase in complex

with acarbose. J Bacteriology. hlm 6981-6983.

40

Kensch O. 2008. Mananase engineering for fibre degradation. Speciality

Chemicals Magazine. hlm 18-19.

Kuchel. Philip W. Gregory B. Ralston. 1998. Biochemistry second edition. The

McGraw-Hill Companies. United States of America: 595 hlm.

Kurakake M. Komaki T. 2001. Production of β-mananase and β-mannosidase

from aspergillus awamori K4 and their properties. J Microbiology vol 42:

377-380.

Lauroa FM et al. 2009. The genomic basis of trophic strategy in marine bacteria.

PNAS. Vol 106 ; 37: 15527-15533.

Leblond. Bourget N. Philipe HI. Decaris B. 1996. 16S rRNA and 16S to 23S

Internal transcribed spacer sequence analysis reveal inter and intra spesific

Bifidobacterium phylogeni. Int. J. Syst Bacteriol. 46: 102-111.

Lehninger. Albert L. 2004. Principles of Biochemistry. The John Hopkins

University School of medicine. New York.

Malik A. 2006. Identifikasi bakteri asam laktat (BAL) penghasil eksopolisakarida

(EPS) menggunakan gen penyandi 16S rRNA. Departemen Farmasi-

Universitas Indonesia.

Mandels M. Sternberg D. 1976. Recent advances in cellulase technology. Ferment

Technol 54:267-286.

Moreira LRS. Filho EXF. 2008. An overview of manan structure and manan-

degrading enzyme systems. Appl Microbiol Biotechnol 70:165-178.

Pangastuti A. 2006. Definisi Spesies Prokaryota Berdasarkan Urutan Basa Gen

Penyandi 16S rRNA dan gen Penyandi Protein. Biodiversitas 7(3): 292-296.

Politz OM et al. 2000. A highly thermostable endo-(1.4)-b-mannanase from the

marine bacterium Rhodothermus marinus. Appl Microbiol Biotechnol 53:

715-721.

Purawadaria T. Haryati T. Darma J. 1994. Isolasi dan seleksi kapang mesofilik

penghasil mananase. Majalah Jurnal Peternakan. hlm 26‐29.

Ruyitno. 2004. Bakteri laut dan peranannya dalam mendukung aktivitas manusia.

Jakarta; Pusat Penelitian Oseanografi lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia.

Sachslehner A, Gabriele F, Nikolaus F, George G. Dietmar H. 2000. Hydrolysis

of isolated coffee mannan and coffee extract by mannanase of Sclerotium

roflsii. J. Biotechnology 80:127-134.

Songsiriritthigul C et al. 2010. Efficient recombinant expression and secretion of

a thermostable GH26 mannan endo-1.4-β-mannosidase from Bacillus

licheniformis in Escherichia coli. Microbial Cell Factories 9:20.

41

Stoll D, Stalbrand, Warren A. 1999. Manna degrading enzyme from Cellulomonas

fimi. 10 hlm ( http://www.aem,asm.org), 01 September 2012, pk 08.30

WIB.

Sumardi. 2004. Isolasi. karakterisasi. dan produksi -mananase ekstraseluler dari

Geobacillus strearothermophilus l-07 [disertasi]. Bogor: Program

Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor.

Suryadi. 2004. Isolasi. Karakterisasi dan produksi β-Mananase ekstraseluler dari

Geobacillus strearothermaphilus 1-7. [disertasi]. Program Pascasarjana-

Institut Pertanian Bogor.

Tamaru et al. 1995. Purification an characterization of an extracellular β-1.4-

mananase from a marine bacterium. vibro sp. Strain MA-138. J

Microbiology. hlm 4454-4458.

Tanaka M et al. 2009. Cloning and characterization of a β-1.4 mannanase 5C

possessing family 27 carbohydrate-binding module from marine bacterium.

Vibrio Sp. Strain MA-138. Biosci. Biotech. Biochem. 7 (1): 109-116.

Weisburg WG. Barns SM. Pelletier DA. Lane DJ. 1991. 16S ribosomal DNA

amplification for phylogenetic study. J. Bact. 173 (2): 697-703.

Yopi et al. 2007. Study on hemicellulytic bacteria: production of oligosaccharides

from palm kernel cake using fermentation. Proceedings “Advances in

Biological Science: Contribution Towards a etter Human Prosperity”.

Page 111-113.

Zahura UA et al. 2011. cDNA cloning and bacterial expression of an endo-β-1.4-

mannanase. AkMan. from Aplysia kurodai. Comparative Biochemistry and

Physiology. Part B 159: 227–235.

Zhang et al. 2000. Purification and characterization of mananase from Bacillus

licheniformis from industrial use. J Biotechnology 22: 1375-1378.

42

43

Lampiran 1. Diagram Alir Penelitian

Contoh Air Laut Hasil Sampling + Media pengkayaan

Inkubasi selama 1 minggu pada shaker

inkubator pada suhu ruang, 150 rpm.

Isolasi Koloni Tunggal

(Inokulasi kultur pengayaan sebanyak 20 µL pada media padat)

Pemurnian Isolat Potensial

(Metode direct pick-up colony)

Uji Manolitik

(Metode Pewarnaan Congo Red)

Analisis Gen 16S rRNA

(Metode PCR)

Isolasi genom (Kit Instagene BioRad)

Uji aktivitas Enzim mananase

(Metode spektrofotometer/DNS)

Elektroforesis

PENELITIAN

TAHAP II

PENELITIAN

TAHAP I

Amplifikasi Gen 16S rRNA

Analisis Data 16S rRNA (Bioedit, RDP dan MEGA 5)

Sekuensing

44

Lampiran 2 Hasil Contiq Bakteri Manolitik Laut Pari 3

GGCCAGGGGGGGGGGCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGAAGGGAGCTT

GCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCT

GTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTT

GAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATG

GACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACG

ATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGG

CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAA

GTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGC

TCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCGAGAGTAACTGCTCGCACCTTGACGG

TACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATAC

GTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCG

GTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTG

GAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGC

GGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCT

GGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAG

ATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTT

TCGCCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGGAGT

ACGGTCGCAAAGACTGAAAACTCAAAAGGAAATTGACGGGGGGCCCCCCAC

AAACCGGTGGAACCATGTGGTTTAAATTCCAAACCAACCCCAAAAAAACCT

TTACCAAGGTCTTTGACATCCTTCTGAACAACCCCTAAGAAGATAGGGGCT

TTTCCCCTTCCGGGGAACAGAATTGAACAGGGTGGGTGCCTTGGT

45

Lampiran 3 Hasil Contiq Bakteri Manolitik Laut Pari 4

1 TTAGGCGGCT GGCTCCAAAA AGGTTACCCC ACCGACTTCG GGTGTTACAA

ACTCTCGTGG TGTGACGGGC GGTGTGTACA AGGCCCGGGA ACGTATTCAC

101 CGCGGCATGC TGATCCGCGA TTACTAGCGA TTCCAGCTTC ATGTAGGCGA

GTTGCAGCCT ACAATCCGAA CTGAGAACGG TTTTATGAGA TTAGCTCCAC

201 CTCGCGGTCT TGCAGCTCTT TGTACCGTCC ATTGTAGCAC GTGTGTAGCC

CAGGTCATAA GGGGCATGAT GATTTGACGT CATCCCCACC TTCCTCCGGT

301 TTGTCACCGG CAGTCACCTT AGAGTGCCCA ACTAAATGAT GGCAACTAAG

ATCAAGGGTT GGGCTCGTTG CGGGACTTAA CCCAACATCT CACGACACGA

401 GCTGACGACA ACCATGCACC ACCTGTCACT CTGCTCCCGA AGGAGAAGCC

CTATCTCTAG GGTTGTCAGA GGATGTCAAG ACCTGGTAAG GTTCTTCGCG

501 TTGCTTCGAA TTAAACCACA TGCTCCACCG CTTGTGCGGG CCCCCGTCAA

TTCCTTTGAG TTTCAGCCTT GCGGCCGTAC TCCCCAGGCG GAGTGCTTAA

601 TGCGTTAACT TCAGCACTAA AGGGCGGAAA CCCCTCTAAC ACTTTAGCAC

TTCATCGTTT TACGGCGTGG GACTACCCAG GGTATCTAAT CCCCGTTTGC

701 TCCCCCACGC TTTCGCGCCT CAGTGTCAGT TACAGACCAG AAAGTCGCCT

TCGGCCACTG GTGTTCCTCC ATATCTCTAC GCATTTCACC GCTACACATG

801 GAATTCCACT TTCCTCTTCT GCACTCAAGT CTCCCAGTTT CCAATGACCC

TCCACGGTTG AGCCGTGGGC TTTCACATCA GACTTAAGAA ACCACCTGCG

901 CGCGCTTTAC GCCCAATAAT TCCGGATAAC GCTTGCCACC TACGTATTAC

CGCGGCTGCT GGCACGTAGT TAGCCGTGGC TTTCTGGTTA GGTACCGTCA

1001 AGGTGCCAGC TTATTCAACT AGCACTTGTT CTTCCCTAAC AACAGAGTTT

TACGACCCGA AAGCCTTCAT CACTCACGCG GCGTTGCTCC GTCAGACTTT

1101 CGTCCATTGC GGAAGATTCC CTACTGCTGC CTCCCGTAGG AGTCTGGGCC

GTGTCTCAGT CCCAGTGTGG CCGATCACCC TCTCAGGTCG GCTACGCATC

1201 GTTGCCTTGG TGAGCCGTTA CCTCACCAAC TAGCTAATGC GACGCGGGTC

CATCCATAAG TGACAGCCGA AGCCGCCTTT CAATTTCGAA CCATGCGGTT

1301 CAAAATGTTA TCCGGTATTA GCCCCGGTTT CCCGGAGTTA TCCCAGTCTT

ATGGGCAGGT TACCCACGTG TTACTCACCC GTCCGCCGCT AACTTCATAA

1401 GAGCAAGCTC TTAATCCATT CGCTCGACTT GCAT

46

Lampiran 4 Hasil Contiq Bakteri Manolitik Laut Pari 5

1 GAAGGGGGGG TGCTATACAT GCAAGTCGAG CGAATGGATT AAGAGCTTGC

TCTTATGAAG TTAGCGGCGG ACGGGTGAGT AACACGTGGG TAACCTGCCC

101 ATAAGACTGG GATAACTCCG GGAAACCGGG GCTAATACCG GATAACATTT

TGAACCGCAT GGTTCGAAAT TGAAAGGCGG CTTCGGCTGT CACTTATGGA

201 TGGACCCGCG TCGCATTAGC TAGTTGGTGA GGTAACGGCT CACCAAGGCA

ACGATGCGTA GCCGACCTGA GAGGGTGATC GGCCACACTG GGACTGAGAC

301 ACGGCCCAGA CTCCTACGGG AGGCAGCAGT AGGGAATCTT CCGCAATGGA

CGAAAGTCTG ACGGAGCAAC GCCGCGTGAG TGATGAAGGC TTTCGGGTCG

401 TAAAACTCTG TTGTTAGGGA AGAACAAGTG CTAGTTGAAT AAGCTGGCAC

CTTGACGGTA CCTAACCAGA AAGCCACGGC TAACTACGTG CCAGCAGCCG

501 CGGTAATACG TAGGTGGCAA GCGTTATCCG GAATTATTGG GCGTAAAGCG

CGCGCAGGTG GTTTCTTAAG TCTGATGTGA AAGCCCACGG CTCAACCGTG

601 GAGGGTCATT GGAAACTGGG AGACTTGAGT GCAGAAGAGG AAAGTGGAAT

TCCATGTGTA GCGGTGAAAT GCGTAGAGAT ATGGAGGAAC ACCAGTGGCG

701 AAGGCGGACT TTTTTGGTCT GTAAACTGAC AATTGAGGCG GGGAAAGCGT

GGGGAGCAAA CAGGATTAGA TACCCTGGTA GTCCACGCCG TAAACGATGA

801 GTGCTAAGTG TTAGAGGGTT TCCGCCCTTT AGTGCTGAAG TTACGCATTA

AGCACTCCGC CTGGGGAGTA CGGCCGCAAG GCTGAAACTC AAAGGAATTG

901 ACGGGGGCCC GCACAAGCGG TGGAGCATGT GGTTTAATTC GAAGCAACGC

GAAGAACCTT ACCAGGTCTT GACATCCTCT GACAACCCTA GAGATAGGGC

1001 TTCTCCTTCG GGAGCAGAGT GACAGGTGGT GCATGGTTGT CGTCAGCTCG

TGTCGTGAGA TGTTGGGTTA AGTCCCGCAA CGAGCGCAAC CCTTGATCTT

1101 AGTTGCCATC ATTTAGTTGG GCACTCTAAG GTGACTGCCG GTGACAAACC

GGAGGAAGGT GGGGATGACG TCAAATCATC ATGCCCCTTA TGACCTGGGC

1201 TACACACGTG CTACAATGGA CGGTACAAAG AGCTGCAAGA CCGCGAGGTG

GAGCTAATCT CATAAAACCG TTCTCAGTTC GGATTGTAGG CTGCAACTCG

1301 CCTACATGAA GCTGGAATCG CTAGTAATCG CGGATCAGCA TGCCGCGGTG

AATACGTTCC CGGGCCTTGT ACACACCGCC CGTCACACCA CGAGAGTTTG

1401 TAACACCCGA AGTCGGTGGG GTAACCTTTT TGGAGCCAGC CGCCTAAGGT

GACCGGGGG

47

Lampiran 5 Kromatogram Bakteri Manolitik Laut Pari 3

Screen clipping taken: 9/21/2012, 2:39 AM

48

Lampiran 6 Kromatogram Bakteri Manolitik Laut Pari 4

49

Lampiran 7 Kromatogram Bakteri Manolitik Laut Pari 5

51

Lampiran 9 Hasil Identifikasi Bakteri Manolitik Laut Pari 4

52

Lampiran 10 Hasil Identifikasi Bakteri Manolitik Laut Pari 5