Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri

7/26/2019 Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri

1/36

PEMERIKSAAN BAKTERI

DENGAN PEWARNAAN

9/9/2015 1


2/36

ISOLASI BAKTERI

PEMBIAKAN (KULTUR) BAKTERI

Tujuan : Untuk memudahkan pemeriksaan,

Kultur dapat disimpan dalam lemari es untuk waktu

yang lama.1. Kultur CAMPURAN, Kultur MURNI

untuk mendapatkan satu spesies dalam satu

kultur, maka perlu dibuat kultur murni (pureculture). Kultur murni dapat diperoleh dari kultur

campuran (mixed culture) dengan cara sebagai

berikut.


3/36

Kultur yang pertama diperoleh adalah kultur campuran.

Contoh : sampel dari udara, tanah, kotoran; sampel

disebarkan pada medium steril, akan tumbuh beraneka koloni

yang masing-masing punya sifat yang khas. Jika salah satukoloni tersebut, ditanam pada medium baru yang steril,

maka bahan itu akan tumbuh menjadi koloni yang murni,

asalkan pekerjaan pemindahan itu dilakukan dengan cermat

menurut teknik aseptik, yaitu menggunakan alat-alat yangsteril dan aturan-aturan laboratorium tertentu. Kultur yang

diperoleh disebut piaraan pertama (primary culture), dan

sifatnya murni. Kultur ini dapat disimpan, tetapi tiap waktu

tertentu harus diadakan peremajaan dengan

memindahkannya ke medium baru. Piaraan-piaraan yang

diperoleh dari piaraan pertama disebutpiaraan turunan (sub-

culture).


4/36

Ada kultur species bakteri yang sewaktu-waktu, yaitu

tiap 2 atau 3 bulan sekali, perlu diremajakan, meskipun

piaraan itu selalu disimpan di dalam lemari es. Untukmeremajakan kultur caranya sama dengan yang di atas

yaitu dengan memindahkan koloni dari stok yang lama

kepada medium yang baru.

Cara lain untuk menyimpan kultur murni dengan

liofilisasi. Dalam bentuk ini bakteri dapat disimpan

sampai bertahun-tahun, asal selalu ada dalam 4o

C.


5/36

MEDIUM ATAU SUBSTRAT

Medium yang paling baik bagi pemiaraan bakteri ialah

medium yang mengandung zat-zat organik.

. MEDIUM CAIRMedium cair yang dipakai ialah kaldu yang disiapkan sebagai berikut. Kepada 1

liter air murni ditambahkan 3 g kaldu daging lembu dan 5 g pepton. Peptonialah protein yang terdapat pada daging, pada air susu, pada kedelai, danpada putih telur. Pepton mengandung banyak N2, sedang kaldu berisigaram-garam mineral dan lain-lainnya lagi. Medium itu kemudian ditentukanpHnya 6,8 sampai 7, jadi sedikit asam atau netral; keadaan yang demikianini sesuai bagi kebanyakan bakteri. Kaldu seperti tersebut di atas masih

perlu disaring untuk kemudian dimasukkan ke dalam tabung-tabung reaksiatau botol-botol. Penyaringan dapat dilakukan dengan kertas saring. Setelahtabung atau botol berisi medium kaldu tersebut disumbat dengan kapas,

dapatlah mereka dimasukkan ke dalam alat pensteril (autoklaf).


6/36

MEDIUM PADAT

Susunannya hampir sama dengan medium cair, tetapi ini

ditambah agar atau gelatin (protein dari kolagen) sehinggamenjadi padat.

MEDIUM YANG DIPERKAYAKebanyakan bakteri dapat tumbuh pada dasar makanan seperti

disebut di atas. Tetapi bakteri patogen seperti Brucella abortus,Mycobacterium tuberculosis, Diplococus pneumoniae, danNeisseria gonnorhoeaememerlukan zat makanan tambahanberupa serum atau darah yang tak mengandung fibrinogen.Serum atau darah itu dicampurkan ke dalam medium yangsudah disterilkan.Jika pencampuran ini dilakukan sebelum sterilisasi, maka serumatau darah tersebut akan mengental akibat pemanasan.Juga medium yang memerlukan tambahan putih telur dibuatdengan cara ini. Untuk menumbuhkan Lactobacillusdanbeberapa spesies lainnya pada medium ditambahkan susu atau air

tomat


7/36

CARA MEMBUAT KULTUR MURNI

Di alam bebas tidak ada bakteri yang hidup tersendiri terlepas darispesies lainnya.

Untuk memurnikan suatu spesies dikenal beberapa cara, yaitu:DENGAN PENGENCERANCara ini pertama kali dilakukan oleh Lister tahun 1865. Membuat biakanmurni Streptococcus lactisyang diisolasik dari susu yang sudah asam.Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-

macam spesies diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari enceranini kemudian diambil 1 ml untuk diencerkan lagi. Kalau perlu, darienceran yang kedua ini diambil 1 ml untuk diencerkan lebih lanjut. Jikadari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 ml untuk disebarkan padasuatu medium padat, kemungkinan besar k akan didapatkan beberapa

koloni tumbuh dalam medium tersebut, tetapi mungkin juga diperolehsatu koloni. Selanjutnya spesies ini dapat dijadikan biakan murni. Kalaubelum yakin koloni tunggal yang diperoleh itu murni, kita dapatmengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagaisampel.


8/36

B. DENGAN PENUANGAN

Robert Koch (1843 1905) yaitu dengan mengambil sedikit

sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan, kemudiandisebarkan di dalam suatu medium dari kaldu dan gelatinencer. Sehingga diperoleh biakan adukan. Setelah mediummengental, beberapa jam kemudian nampaklah koloni-koloni

yang masing-masing dapat dianggap murni. Denganmengulang pekerjaan seperti tersebut di atas ini, makaakhirnya akan diperoleh biakan murni yang lebih terjamin.Dalam melakukan metode ini ada dua orang pembantu Kochyang sangat berjasa, yaitu Petriyang menciptakan cawandengan tutup yang sekarang terkenal sebagai cawan Petri(Petri dish). Pembantu yang kedua ialah Heseyangmenemukan agar-agar untuk menggantikan gelatin. Agarternyata lebih baik daripada gelatin untuk bahan pengental

suatu medium. Agar tidak lekas mencair, titik cairnya 95o C.


9/36

C. DENGAN PENGGESEKANMetode ini sekarang banyak digunakan, karena tidak begitumemakan waktu, dengan cara ini bakteri anaerob tidak

dapat tumbuh.Jika ujung kawat inokulasi dibengkokkan, kemudian ujung itusetelah disentuhkan suatu koloni lalu digesekkan padapermukaan medium padat, maka beberapa waktu (kurang

lebih setelah 12 jam) akan tampak koloni yang letaknyatersebar di permukaan medium. Jika diadakan pemindahansampel dari suatu koloni yang letaknya terpencil, maka akandiperoleh suatu kultur murni.


10/36

IDENTIFIKASI BAKTERI

1.Pemeriksaan Mikroskopik,Bentuk bakteri, gram

2. PergerakanBergerak E. coli,

Tetesan bergantung

3. Uji biokimia

4. PCR (Polymerase Chain

Reaction)


11/36

Pewarnaan

Suatu teknik untuk mempelajari morfologi

bakteri dengan cara pemberian zat warna

kepada sel bakteri.

Bagian-bagian sel dapat diamati, karena

dapat menyerap zat warna yang berbeda

oleh masing-masing bagian sel.

9/9/2015 11


12/36

Kenapa perlu diwarna ?

Bakteri ukurannya sangat kecil 05-1 u x 10 u

Dibawah mikroskop tidak jelass bagian-

bagian nya.

Untuk melihat dengan jelas perlu diberi zat

warna.

9/9/2015 12


13/36

PEWARNAAN BAKTERI

- Dikembangkan oleh Erlich dan Robert Koch

- Yang berperan pada pewarnaan dinding sel dan

membran sitoplasma (Protein yang mengandung

gugus amino dan karboksil)

PEWARNAAN BAKTERI HIDUP (LIVING STATE)

- Menggunakan zat warna yang tidak toksis- Jarang dilakukan karena bakteri hidup sukar

menyerap warna

- Untuk melihat pergerakan bakteri


14/36

PEWARNAAN BAKTERI MATI (FIXED STATE)

- Intensifier (agar pewarnaan berjalan cepat),bahan kimia (fenol, deterjen), fisis (panas)

- Mordant, suatu bahan yang dapat memperkuat

ikatan zat warna dengan bakteri

Teori pewarnaan bakteri :

1. Teori fisis (Fisher), pewarnaan suatu proses

absorbsi zat warna oleh bakteri, tergantung pada

kekuatan absorbsi dari permukaan bakteri


15/36

2. Teori Kimiawi (Paul Ehrlich)

Pewarnaan merupakan reaksi kimiawi antara zat

warna dengan bakteri yang akan menghasilkan

komponen baru yang berbeda dengankomponen pembentuknya.

Penyiapan sampel- Dibuat sediaan berupa apusan pada gelas

objek (slide)

- Fiksasi, tujuannya :- melekatkan spesimen pada gelas objek

- membunuh bakteri tanpa merusak morfologinya

- memudahkan bakteri diwarnai

- men im an slide an belum sem at diwarnai


16/36

Umumnya ada 2 macam zat warna

Zat warna bersifat asam

Komponen warnanya adalah anion

Dalam bentuk garam natrium

Zat warna bersifat basa

Komponen warna kation.

Dalam bentuk klorida

9/9/2015 16


17/36

Macam-Macam Zat Warna Bakteri

No Nama Zat Pewarnaan Warna Bakteri

1 Sapranin Merah

2 Gentian violet Ungu

3 Methylen blue Biru

4 Malachit green Hijau

5 Karbol fuchsin Merah

9/9/2015 17


18/36

Struktur Sel

Sel terdiri dari :

Dinding sel , terdiri dari :

- lapisan peptidoglikan- asam teikoat

Membran plasma, terdiri dari :

- membran protein- lapisan fosfolipid

9/9/2015 18


19/36

Macam-Macam Pewarnaan

1. Pewarnaan Sederhana

- Menggunakan 1 macam zat warna.

- Warna bakteri hanya 1- Tidak dapat membedakan sifatnya.

- Untuk melihat ukuran dan bentuknya.

9/9/2015 19


20/36

2. Pewarnaan Differensial

- Menggunakan lebih dari 1 zat warna- Membedakan sifat bakteri.

- Melihat bagian-bagian bakteri.

- Dapat digunakan untuk identifikasi

bakteri tahap awal.

9/9/2015 20


21/36

Macam-Macam Pewarnaan Differensial

1. Pewarnaan Gram

2. Pewarnaan BTA

3. Pewarnaan Spora

4. Pewarnaan Granul

9/9/2015 21


22/36

Fiksasi

Proses melengketkan sediaan pada kaca

obyek.

Bakteri mati, tetpai tidak lisis.

Secara Kimia : metanol

Secara Fisika : pemanasan diatas nyala api.

9/9/2015 22


23/36

Pewarnaan Gram

Ditemukan Christian Gram (1884).

Pewarnaan dasar dan rutin dalam

identifikasi bakteri lebih lanjut.

Kuman dibagi dua :

- Gram positif berwarna ungu

- Gram negatif berwarna merah.

9/9/2015 23


24/36

Tahap pewarnaan Gram

Perlakuan Waktu

Warna Bakteri

Gram + Gram -

Pembuatan preparat

Fiksasi

Gentian violet 30 detik ungu unguCuci dengan air

Larutan

iodium

30 detik - -

Cuci dengan air dan keringkanDekolorisasi dengan alkohol 20 detik

Cuci dengan air dan keringkan

Sapranin 30 detik ungu merah9/9/2015 24


25/36

PEWARNAAN GRAM

- Hans Christian Gram (1884)

- Gram positif (ungu), negatif (merah)

- Gram positif, peptidoglikan dinding selnya tebal

sehingga dapat mempertahankan warna kristal

violet walaupun sudah dilunturkan

- Gram negatif, peptidoglikannya tipis, sehingga

warna kristal violet akan luntur waktu diberialkohol dan menjadi merah setelah diberi

safranin


26/36

Pewarnaan BTA

Untuk mengidentifikasi kuman M. tbc dan M.

leprae

Kuman M.tbc dan M. leprae mempunyai

dinding sel yang banyak mengandung lipid.

Sukar ditembusi zat warna biasa.

Perlu pemanasan.

Bakteri M tbc dan M leprae berwarna merah.

9/9/2015 26


27/36

Tahap Pewarnaan BTA

Buat preparat.

Fiksasi

Zat Warna Karbol Fuchsin sambil dipanaskan (tidak

mendidih) 3 menit.

Cuci dengan air

Pelunturan dengan asam alkohol hingga bersih.

Methylen blue 1 menit.

9/9/2015 27


28/36

Zat Warna Pewarnaan BTA

Karbol fuchsin = merah.

Methylen blue = biru.

Asam alkohol sebagai peluntur. Kuman BTA positif : batang berwarna merah.

Kuman BTA negatif : batang berwarna biru.

Sensitifitas : 5000 BTA / ml sputum.

9/9/2015 28


29/36

Metoda Pewarnaan BTA

1. Ziehl Nellson

2. Kinyoun Gabbet

3. Tan Tiam Hook.

9/9/2015 29


30/36

PROSEDUR ZIEHL NEELSEN

- Sediaan dikeringkan, lalu difiksasi

- Di (+) karbol fukhsin, dipanaskan 5 menit

- Sisa zat warna dibuang, bilas dengan air

- Di (+) alkohol asam selama 5

10 detik

- Sisa zat peluntur dibuang dan dibilas dengan air

- Di (+) metilen blue selama 30 menit

- Sisa zat warna dibuang dan dibilas dengan air- Dikeringkan dengan kertas penghisap, dan

dilihat dibawah mikroskop


31/36

PEWARNAAN KHUSUS

- Untuk melihat struktur tertentu bakteri misalnya

kapsul, flagel, spora.

Pewarnaan spora

- Spora alat untuk mempertahankan diri bagi

bakteri

- Spora sulit diwarnai, jika telah berikatan denganzat warna sulit dilepaskan.

- Pewarnaan Schaeffer Fulton


32/36

Prosedur :

- Dibuat sediaan, dikeringkan dan difiksasi- Di (+) zat warna hijau malakhit dan dipanaskan 5

menit

- Sisa zat warna dibuang dan dibilas dengan air

- Di (+) safranin 30 detik


- Dikeringkan dan dilihat dibawah mikroskop

- Spora berwarna hijau dan bentuk vegetatifberwarna merah, latar belakang berwarna merah


33/36

PEWARNAAN KAPSUL

- Cara Anthony, Hiss dan Muir atau pewarnaan

negatif menggunakan tinta cina

Prosedur Hiss :

- Dibuat sediaan dan difiksasi

- Di (+) kristal violet dan panaskan 1 menit

- Dicuci dengan larutan CuSO4 20%- Dikeringkan, dilihat dibawah mikroskop


34/36

Prosedur :

- Dibuat sediaan, dikeringkan dan difiksasi- Di (+) zat warna hijau malakhit dan dipanaskan 5

menit


- Di (+) safranin 30 detik


- Dikeringkan dan dilihat dibawah mikroskop

- Spora berwarna hijau dan bentuk vegetatifberwarna merah, latar belakang berwarna merah


35/36

PEWARNAAN KAPSUL

- Cara Anthony, Hiss dan Muir atau pewarnaan

negatif menggunakan tinta cina

Prosedur Hiss :

- Dibuat sediaan dan difiksasi

- Di (+) kristal violet dan panaskan 1 menit

- Dicuci dengan larutan CuSO4 20%- Dikeringkan, dilihat dibawah mikroskop


36/36

9/9/2015 36

Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri

Documents

Transcript of Isolasi Dan Pewarnaan Bakteri