PEWARNAAN, PENANAMAN & MEDIA PERBENIHAN BAKTERIAsih Rahayu,drh.,M.Kes.LAB. MIKROBIOLGIFK UWKS

IDENTIFIKASI BAKTERIIdentifikasi bakteri penyebab penyakit infeksi dilakukan di laboratorium Mikrobiologi dengan mengirimkan sampel penderita (mengenai sampel dibahas lebih lanjut pada Bab Pengambilan Spesimen & interpretasi Hasil Pemeriksaan Laboratorium Mikrobiologi)Sampel yang diterima oleh lab akan dikerjakan sesuai permintaan dokter pengirimnya

PEMERIKSAAN RUTIN LAB MIKROBIOLOGI UNTUK BAKTERISetiap sampel untuk pemeriksaan bakteri yang diterima oleh lab Mikrobiologi akan dilakukan pemeriksaan sbb:Pemeriksaan mikroskopis untuk mengetahui morfologi & sifat afinitas bakteri terhadap zat warnaKultur (perbenihan) untuk mengetahui sifat fisiologis & kimiawi bakteriHewan coba (bila perlu) ; saat ini sudah sangat jarang dilakukan

1.PEMERIKSAAN MIKROSKOPISUntuk memeriksa bakteri secara mikroskopis perlu dilakukan pewarnaan /pengecatanJenis pewarnaan yang dipergunakan disesuaikan dengan kebutuhan / permintaan masing masing spesimen yang dikirimkanUmumnya dilakukan pewarnaan rutin lab Mikrobiologi yaitu Pewarnaan Gram, kecuali terdapat indikasi lain misalnya untuk spesimen penderita yang diduga TBC atau lepra , tidak dilakukan pewarnaan Gram melainkan pewarnaan Tahan Asam Terdapat banyak jenis pewarnaan, pada kuliah ini hanya dipelajari beberapa yang dasar & sangat penting diketahui oleh seorang calon praktisi/dokter

Pewarnaan yang bersifat positifKarena mempergunakan zat warna yang dapat berikatan dengan sitoplasma bakteri, maka di bawah mikroskop bakteri akan tampak berwarna sesuai dengan warna zat yang dipakaiZat warna yang dipakai harus bersifat basa ( basic dyes) untuk dapat berikatan dengan sitoplasma bakteri yang cenderung bersifat asamContoh zat warna yang bersifat basa:Crystal violet berwarna unguSafranin berwarna merahMethylene Blue berwarna biruCarbol fuchsin berwarna merahMalachite Green berwarna hijau ; larut dalam airNeisser AB & Neisser C larut dalam air

Macam Pewarnaan yang bersifat positifSederhana / simple staining : mempergunakan 1 macam zat warna basa ; tujuannya hanya untuk mengetahui bentuk/morfologi & susunan bakteri secara cepatDifferential : dapat membedakan sifat sifat bakteri berdasarkan afinitas terhadap zat warna ; mempergunakan lebih dari 1 macam zat warna basa ; selain untuk mengetahui bentuk & susunan bakteri juga untuk mengetahui sifat bakteri berdasarkan afinitas terhadap zat warna misalnya sifat Gram,sifat Acid fastKhusus: mempergunakan lebih dari 1 macam zat warna basa; untuk mengetahui bagian bagian khusus yang dimiliki oleh bakteri misalnya Granula metachromatic, endospora / spora, capsule dll

PEWARNAAN YANG BERSIFAT NEGATIFKarena menggunakan zat warna yang tidak dapat berikatan dengan sitoplasma bakteri, maka di bawah mikroskop bakteri akan tampak bening / tidak terwarnai & hanya latar belakang / daerah di sekitar bakteri yang akan terwarnaiZat warna yang dipakai harus bersifat asam / acidic dyes sehingga tidak dapat berikatan dengan sitoplasma bakteri yang cenderung bersifat asamContoh zat warna yang bersifat asam : tinta bak, chinese ink, indian ink, nigrosin

MACAM PEWARNAAN YANG BERSIFAT NEGATIFBurrie / negative stain : mempergunakan 1 macam zat warna asam ; untuk mengetahui morfologi & susunan bakteri serta umumnya dipakai untuk mewarnai bakteri bakteri yang sulit diwarnai ( sulit menyerap zat warna basa ) atau dapat juga dipakai untuk mewarnai bakteri bercapsule

Membuat preparat / sediaan bakteri untuk pewarnaanSecara detail langkah langkahnya lihat Buku Petunjuk Praktikum I MikrobiologiYang perlu diingat adalah :Pakai object glass bersih & bebas lemak (baru)Siapkan ose yang lingkarannya menyatuSiapkan nyala api bunsenBila bakteri diambil dari biakan cair tidak perlu PZ sterilBila bakteri diambil dari biakan padat perlu PZ sterilSelalu bekerja secara ASEPTISPreparat harus difixasi setelah benar benar kering

PEWARNAAN SEDERHANA= SIMPLE STAININGMempergunakan 1 macam zat warna basa ; zat warna yang dianjurkan : safranin & methylene blueDi bawah mikroskop bakteri akan tampak berwarna merah bila menggunakan safranin ; bila menggunakan methylene blue, bakteri akan tampak berwarna biruSecara detail langkah-langkahnya lihat Buku Petunjuk Praktikum I MikrobiologiInformasi yang didapat dari pewarnaan ini hanyalah morfologi & susunan bakteriMorfologi : coccus ; batang = bacill panjang, pendek, sangat pendek, kurus , gemuk, kecil, besar, mempunyai spora (spora tampak sebagai daerah tak berwarna karena spora tidak dapat ditembus zat warna) dllNotes: bentuk batang yang sangat pendek sehingga mirip coccus disebut sebagai cocoid atau coccobacillSusunan : bergerombol, membentuk rantai, seperti huruf cina, berdua, berempat berdelapan, sendiri sendiri dll

PEWARNAAN GRAMMerupakan pewarnaan differential untuk membedakan antara bakteri Gram positif dengan bakteri Gram negatif berdasarkan afinitas dinding sel bakteri terhadap zat warna GramGram merupakan nama penemu pewarnaan ini tulis huruf awal dengan huruf capital Secara detail langkah langkahnya lihat di Buku Petunjuk Praktikum I Mikrobiologi

Mempergunakan 2 macam zat warna basa yaitu : Crystal violet ( berwarna ungu ) sebagai zat warna utama = main stain & safranin (berwarna merah) sebagai zat warna pembanding = counter stainMempergunakan zat kimia pelarut organik : Alkohol absolut = alkohol 95 96 % sebagai decolorizing agent = pelunturMempergunakan zat kimia : lugol (KI3 3%) sebagai mordant = pemantek = zat yang membantu pengikatan zat warna Crystal violet dengan sitoplasma bakteri (Iodine-dye complex)

Bakteri yang mempunyai struktur dinding sel peptidoglikan yang tebal mempertahankan zat warna crystal violet pada saat pelunturan warna tetap ungu Gram POSITIFBakteri yang mempunyai struktur dinding sel peptidoglikan yang tipis tidak dapat mempertahankan zat warna crystal violet pada saat pelunturan akan mengikat zat warna pembanding ( safranin) warna merah Gram NEGATIF

PEWARNAAN ACID FAST= Pewarnaan Tahan Asam = Pewarnaan Ziehl-NeelsenAda beberapa metode , diantaranya Ziehl-Neelsen , Tan Thiam Hok dari nama orang penemunyaLangkah langkah secara detail lihat Buku Petunjuk Praktikum I Mikrobiologi metode Ziehl NeelsenMerupakan pewarnaan diffrential untuk membedakan antara bakteri yang tahan asam (Acid Fast) dengan bakteri yang tidak Tahan Asam ( Non Acid Fast)Contoh bakteri Acid Fast adalah : Mycobacterium leprae & Mycobacterium tuberculosis

Mempergunakan 2 macam zat wana basa yaitu: Carbol Fuchsin ( wana merah ) sebagai main stain dengan Methylene Blue ( warna biru) sebagai counter stainMempergunakan zat kimia pelarut organik yang kuat yaitu Alkohol asam (larutan Alkohol + HCl) sebagai decolorizing agentMempergunakan tehnik pemanasan preparat untuk merenggangkan pori dinding sel / lapisan mycolic acid bakteri yang bersifat tahan asam , sehingga diharapkan zat warma Carbol Fuchsin dapat masuk & berikatan dengan sitoplasma bakteriBakteri yang mempunyai struktur dinding sel mycolic acid akan mempertahakan zat warna Carbol Fuchsin pada saat pelunturan Bakteri Acid Fast / bakteri tahan Asam berwarna merahBakteri yang tidak mempunyai struktur dinding sel mycolic acid tidak dapat mempertahankan zat warna Carbol Fuchsin akan mengikat zat warna pembanding Methylene Blue bakteri tidak Tahan Asam / Non Acid Fast berwarna biru

PEWARNAAN SPORA= Pewarnaan Schaeffer-Foulton nama penemu pewarnaan iniMerupakan pewarnaan khusus untuk melihat spora (endospora) bakteriBakteri yang dapat membentuk spora (bentuk pertahanan diri/tidak aktif) misalnya Bacillus sp & Clostridium spLetak & diameter spora adalah karakteristikLetak : central, sub terminal, terminalDiameter : lebih kecil atau lebih besar dari diameter bagian vegetatif bakteriBentuk spora : bulat atau oval

Mempergunakan 2 macam zat warna basa yaitu : Malachite Green (warna hijau) sebagai main stain & safranin (warna merah) sebagai counter stainMempergunakan tehnik pemanasan untuk merenggangkan dinding spora yang tebal & impermiable sehingga diharapkan zat warna Malachite Green dapat menembus dinding spora warna spora hijauKarena Malachite Green larut dalam air maka bagian vegetative bakteri akan melepas warna malachite green & mengikat warna safranin bagian vegetative berwarna merah

PEWARNAAN NEISSERMerupakan pewarnaan khusus : untuk melihat granula metachromatic bakteriContoh bakteri patogen yang mempunyai granula metachromatic adalah Corynebacterium diphteriaeMenggunakan 2 macam zat warna basa Neisser AB & Neisser C (keduanya larut dalam air) oleh karena itu selama pewarnaan tidak boleh ada proses pencucianSecara detail dapat dilihat pada Buku Praktikum I MikrobiologiGranula metachromatik tampak berwarna biru gelap & sitoplasma bakteri akan tampak kuning kecoklatan

PEWARNAAN NEGATIF= negative stain = Burrie nama penemunyaMenggunakan zat warna asam,umumnya tinta bak dengan kualitas yang baikMetode Pembuatan preparat bakteri untuk pewarnaan negatif berbeda dengan metode pembuatan preparat bakteri untuk pewarnaan positif (simple, Gram, Acid Fast, Spora,Neisser) yaitu dengan tehnik ulasBakteri tampak tidak berwarna (transparant) dengan latar belakang hitam /gelap

Catatan:Pewarnaan yang menggunakan metode pemanasan preparat : Acid Fast & SporaPewarnaan yang menggunakan metode pelunturan: Gram (alkohol 95-96%) & Acid Fast (alkohol asam)Pada pewarnaan dengan metode pemanasan : selama pemanasan preparat tidak boleh kering & tidak boleh mendidihSemua jenis pewarnaan terdapat tahap pencucian dengan air (pergunakan air kran) , kecuali pada pewarnaan Neisser

Staphylococcus sp Gram positif, coccus, umumnya bergerombol seperti buah anggurStreptococcus sp Gram positif, coccus , umumnya berjajar membentuk rantaiEscherechia coli Gram negatif, batang / bacill, umumnya sendiri sendiriBacillus subtilis Gram positif , mempunyai spora ( tampak transparant pada pewarnaan Gram), batang besar, umumnya berjajar membentuk rantaiMycbacterium tuberculosis Acid Fast / Tahan Asam, umumnya bergerombol atau sendiri - sendiriMycobacterium leprae Acid Fast / Tahan Asam, umumnya bergerombol membentuk formasi potongan melintang cerutu (globi / globus) atau sendiri sendiriPreparat yang ditemukan bakteri bentuk batang Tahan Asam disimpulkan sebagai BTA positif