Isolasi dan Analisis Bakteri

Kegiatan dengan antimikroba dari Sponge Laut

Haliclona simulans Dikumpulkan dari Irish Waters

Sampel dari sponge laut Haliclona simulans

dikumpulkan dari perairan pantai Irlandia, dan bakteri yang

diisolasi dari sampel tersebut. Filogenetik analisis dari

isolat berbudaya menunjukkan bahwa empat filum bakteri yang berbeda

diwakili; Bacteriodetes, Actinobacteria, Proteobacteria,

dan Firmicutes.

Isolat bakteri spons yang

diuji untuk produksi zat antimikroba, dan

aktivitas biologis terhadap bakteri Gram-positif dan Gram-negatif

bakteri dan jamur yang ditunjukkan, dengan 50% dari

isolat menunjukkan aktivitas antimikroba terhadap setidaknya satu dari

strain uji. Pengujian lebih lanjut menunjukkan bahwa antimikroba

kegiatan yang diberikan kepada penting patogen Pseudomonas

aeruginosa, Clostridium difficile, Staphylococcus multi-resistan terhadap obat

aureus, dan patogen strain ragi. The Actinomycetes

secara numerik produsen paling berlimpah

kegiatan antimikroba, meskipun kegiatan tersebut juga mencatat

dari Basil dan Pseudovibrio isolat.

Survei untuk

Kehadiran potensi antibiotik poliketida sintase encoding

dan gen peptida sintetase nonribosomal juga mengungkapkan bahwa

gen untuk biosintesis metabolit sekunder

hadir dalam filum sebagian bakteri tetapi terutama

umum di kalangan Actinobacteria dan Proteobacteria.

Studi ini menunjukkan bahwa sebagian kecil culturable dari

bakteri dari spons H. simulans beragam dan muncul

untuk memiliki banyak potensi sebagai sumber untuk penemuan

medis yang relevan bahan aktif biologis baru. Abstract

Spons laut adalah inang berbagai mikroba. itu

peran mikroba ini beragam di bidang biologi spons bervariasi dari

pencernaan mikroba sebagai sumber makanan untuk mutualistik

simbiosis dengan spons. Untuk hubungan mutualistik, spons diyakini menyediakan tempat berlindung dari predator, sebuah

substrat untuk kolonisasi, akses ke sinar matahari untuk fotosintesis

mikroba, dan pasokan nutrisi. manfaat usulan

dengan spons asosiasi simbiosis mikroba termasuk

ketentuan untuk spons fotosintat dan eliminasi

metabolik beracun oleh-produk (Taylor et al. 2007).

Bioaktif metabolit mikroba penghasil juga diyakini

memiliki hubungan simbiosis mutualistik dengan spons,

dengan mikroba menghasilkan metabolit yang melindungi spons

dari penyakit mikroba dan predasi.

Lingkungan laut dan spons khususnya adalah

sumber yang kaya baru bioaktif metabolit - lebih dari 200 baru

metabolit diisolasi dari spons laut pada tahun 2005

( Blunt et al . 2007) . Dalam spesies Haliclona , lebih dari 190

metabolit , dengan aktivitas biologis luas , memiliki

diisolasi ( Yu et al . 2006) . Ini termasuk senyawa

dengan anti - fouling ( Devi et al 1998; . . Sera et al, 2002 ) , antimikroba

( Clark et al , 2001; . . Richelle - Maurer et al, 2001 ) ,

anti jamur ( Barrett et al 1996; . Clark et al, 2001 . ) , antimalaria

( Sakai et al . 1986) , dan kegiatan sitotoksik

( Erickson et al 1997; . Rashid et al, 2000 . ) . Kisaran

senyawa yang diisolasi dari Haliclona sp . termasuk steroid ,

terpenoid , polyacetylenes , alakaloids , peptida siklik , tak jenuh

asam lemak , dan poliketida ( Yu et al . 2006) . itu

isolasi luas metabolit mikroba khas, seperti

sebagai poliketida , dari spons menyebabkan hipotesis bahwa

metabolit tersebut sebenarnya produk dari metabolisme mikroba .

Isolasi bakteri penghasil metabolit sekunder

dari spons dan gen metabolisme sekunder mikroba

cluster dari metagenome spons telah menyebabkan

penerimaan umum bahwa metabolit ini , dalam banyak kasus ,

produk dari simbion mikroba dan tidak berasal dari

diet mikroba spons ( Fortman dan Sherman 2005) .

Mikrobiota spons sangat beragam , dan perwakilan

dari tujuh filum bakteri telah diisolasi

dari spons ( Taylor et al . 2007) . Namun, dari cultureindependent

teknik , diketahui bahwa setidaknya 16

filum bakteri yang dikenal untuk hadir dalam spons ( Taylor

et al . 2007) . Untuk isolasi metaboliteproducing sekunder

bakteri dari spons , fokus dari banyak

peneliti telah di genera diketahui produsen

metabolit sekunder , khususnya, Actinobacteria

( Jiang et al 2007; . Kim et al 2005; . Zhang et al 2006. ) .

Pendekatan budaya -independen telah menunjukkan bahwa Actinobacteria

yang berlimpah dalam spons Rhopaloeides

odorabile dan Xestospongia spp . ( Webster et al, 2001 . ;

Montalvo et al . Pendekatan 2005) , dan budaya - dependent

telah juga menunjukkan bahwa Actinobacteria dapat diisolasi

dari spons tetapi bahwa kelimpahan dan keragaman

komunitas actinobacterial diolah bervariasi

antara spesies spons ( Zhang et al . 2008) . spons

Hymeniacidon perleve ( Zhang et al . 2006) , Stelletta tenuis ,

dan Halichondria rugosa ( Zhang et al . 2008) , semua dikumpulkan

dari Laut Kuning , ditemukan mengandung berlimpah

diolah Actinobacteria , sementara spons Reniochalina sp .

dan Craniella australiensis , dikumpulkan dari sama

lokasi , menghasilkan lebih sedikit Actinobacteria ( Zhang et al .

2008) . Demikian pula , sebuah studi bakteri diolah dari

Spons Mediterania ( Muscholl - Silberhorn et al . 2008)

ditemukan sejumlah besar diolah Actinobacteria

dari dua spesies spons dianalisis tetapi hanya sedikit dari

tersisa delapan spesies spons .

Analisis aktivitas antibiotik dan metabolit sekunder

produksi dari isolat spons telah menyebabkan

isolasi bakteri yang memproduksi dikenal bioaktif

metabolit seperti manzamine (Hill et al. 2005) dan

rifamycin (Kim et al. 2006). Survei antimikroba

aktivitas dari isolat spons juga menunjukkan bahwa, sementara

kegiatan antimikroba telah diamati dari Actinobacteria

(Kim et al 2005;. Muscholl-Silberhorn et al.

2008), kegiatan ini juga dapat hadir dalam α-dan γ-

Proteobacteria dan Basil (Thakur et al 2005;. Hentschel

et al. 2001; Pabel et al. 2003). The mikrobiologi

kekayaan lingkungan spons menunjukkan bahwa kultivasi

Penelitian-penelitian ini sangat relevan dan cenderung menghasilkan

penemuan mikroba baru dan novel metabolik

jalur. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan baik

keragaman komponen bakteri dikultur dari

Haliclona simulans dan yang dari isolat bakteri

diproduksi zat antimikroba berpotensi berguna. Introduction

Koleksi Spons

Sampel H. simulans (kelas Demospongiae, ketertiban

Haplosclerida, keluarga Chalinidae) dikumpulkan dengan tangan

selama menyelam di Gurraig Suara Kilkieran Bay,

Mar Biotechnol (2009) 11:384-396 385

Galway, di pantai barat Irlandia, pada kedalaman 15 m

(N 53 ° 18,944 ', W 09 ° 40,140'). Sampel spons Utuh yang

disimpan dalam air laut pada suhu 4 ° C dan dibawa ke laboratorium.

Budaya Bakteri Sponge - Associated

Sekitar 1 cm3 sampel jaringan spons dibilas

ekstensif dengan air laut buatan steril , dan dicuci

jaringan spons dipotong menjadi potongan-potongan kecil < 1 mm3 dengan steril

pisau bedah. Jaringan spons selanjutnya diproses dengan menggiling

dengan 3 ml air laut buatan steril dalam Potter - Elvehjem

jaringan penggiling . Ekstrak spons serial diencerkan

air laut buatan untuk 10-6 , dan 100 ml aliquot yang berlapis

keluar ke media isolasi . Media isolasi yang digunakan adalah starchyeast

ekstrak - pepton air laut ( SYP - SW ) agar [ 1 % ( b / v )

pati , 0,4 % ( b / v ) ekstrak ragi, 0,2 % ( b / v ) pepton , 3,33 %

( b / v ) buatan laut Samudera Merek garam - Instan , 1,5 % ( b / v )

agar ] , Agar Kelautan [ 0,1 % ( b / v ) ekstrak ragi, 0,5 % ( b / v )

tryptone , 3,33 % ( b / v ) buatan laut Samudera garam - Instan

Brand, 1,5 % ( b / v ) agar) , Modified Agar Laut ( 0,005 %

( b / v ) ekstrak ragi, 0,05 % ( b / v ) tryptone , 0,01 % ( b / v ) β -

gliserol fosfat disodium garam, pentahydrate , 3,33 % ( b / v )

buatan laut Samudera Merek garam - Instan , 1,5 % ( b / v ) agar ] ,

Actinomycete Isolasi Seawater Agar [ 2,2 % ( b / v ) Difco

Actinomycete Isolasi Agar, 0,5 % ( v / v ) gliserol , 3,33 %

( b / v ) buatan laut garam - Instan Samudera Merek ] , dan

NaST21Cx ( Magarvey et al . 2004) . amfoterisin B

( 30 mg / mL ) ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan jamur , dan

piring dibuat dengan dan tanpa asam nalidiksat

( 25 mg / mL ) . Pelat diinkubasi pada suhu 28 ° C sampai 8 minggu .

Koloni diambil dari piring isolasi dan restreaked

ke SYP-SW agar, kultur murni diperoleh dengan

ulang adanya goresan dari koloni tunggal, minimal dua kali dari pelat

yang secara visual dinilai tidak dari budaya tunggal. untuk

pelestarian jangka panjang, budaya yang tumbuh pada suhu 28 ° C di

SYP-SW kaldu, gliserol ini ditambahkan dengan 15%, dan sampel

dibekukan pada -80 ° C. Spora dari bakteri bersporulasi

juga diawetkan dengan resuspension di 20% (v / v) gliserol

dan penyimpanan -20 ° C.

Persiapan Ekstrak Kebudayaan dan Disc Antibiotik

Budaya Bibit dibuat dengan inokulasi koloni

isolat bakteri spons ke dalam 5 ml SYP - SW kaldu dan

inkubasi pada suhu 28 ° C dengan gemetar selama 3 hari . satu mililiter

budaya ini biji digunakan untuk menyuntik 50 ml SYPSW

kaldu dalam labu kerucut 250 ml . Ini diinkubasi

pada suhu 28 ° C dengan gemetar selama 10 hari . Untuk persiapan

ekstrak , sel-sel bakteri dihapus oleh sentrifugasi pada

3.000 × g selama 15 menit atau dengan penyaringan jika langkah sentrifugasi

tidak mengakibatkan pembentukan pelet padat . sebuah alikuot

( 5 ml) menjelaskan kaldu kultur dihapus karena langsung

analisis . Untuk sisa kaldu , 2 g XAD - 16

resin ditambahkan , dan suspensi ini terguncang selama 2 jam untuk

memungkinkan pengikatan senyawa hidrofobik dengan resin . itu

manik-manik resin dikumpulkan dan dicuci dengan air .

Senyawa teradsorpsi dielusi dari resin berurutan

dengan 50 % metanol ( 5 ml ) , 100 % metanol ( 5 ml ) ,

dan 100 % etilasetat ( 5 ml ) . Ekstrak sel disiapkan

dengan re - suspensi pelet sel bakteri dalam 10 ml 50 %

metanol dan gemetar selama 1 jam dengan puing-puing sel dihapus oleh

sentrifugasi seperti di atas . Semua ekstrak disimpan di ruang

Suhu dalam gelap . Prosedur ini ditingkatkan untuk

memproses 800 ml kaldu budaya . Dalam kasus ini , 2 × 400 ml

budaya ( dalam 1 l labu Erlenmeyer ) masing-masing diinokulasi

dengan 10 ml kultur benih dan diinkubasi pada suhu 28 ° C dengan

gemetar selama 12 hari . Sel bakteri dihapus oleh

filtrasi , dan 30 g resin XAD - 16 telah ditambahkan ke

budaya kaldu . Suspensi ini terguncang selama 2 jam untuk memungkinkan

mengikat resin . Resin dikumpulkan dalam kolom

dan dicuci dengan 100 ml air . Ekstrak dielusi

berurutan dengan 50 ml metanol 50% , 50 ml 100 %

metanol , dan 50 ml etil asetat .

Isolasi DNA genom dari Isolat

Dua prosedur yang digunakan untuk isolasi DNA genom

dari isolat bakteri , sel-sel bakteri dari kultur 3 - ml

tumbuh selama 24-72 jam dalam SYP - SW diolah dengan menggunakan

Qiagen DNeasy darah dan jaringan kit , sedangkan untuk tersangka

Actinobacteria , versi skala kecil yang cetyltrimethylammonium

Prosedur bromida untuk isolasi genom

DNA dari Streptomycetes digunakan ( Kieser et al . 2000) .

Amplifikasi 16S ribosomal RNA Partial , poliketida

Sintase , dan Nonribosomal Peptida Synthase Gene

produk

DNAwas Genomic digunakan sebagai template untuk berantai polimerase

reaction (PCR ) amplifikasi . Untuk 16S ribosom RNA

( rRNA ) amplifikasi gen , primer 27f ( 5' - AGAGTTTGATCMTGGCTCAG -

3 ' ) dan 1492r ( 5' - TACGGYTACCTTGTTACGACTT -

3 ' ) digunakan ( Lane 1991) . PCR

dilakukan dengan ketentuan sebagai berikut : awal

denaturasi pada 94 ° C selama 3 menit, diikuti dengan 30 siklus

94 ° C selama 1 menit , 50 ° C selama 1 menit , dan 72 ° C selama 2 menit , dengan

ekstensi akhir 72 ° C selama 7 menit . Untuk synthase poliketida

( PKS ) amplifikasi PCR , primer MDPQQRf ( 5' -

RTRGAYCCNCAGCAICG - 3 ' ) dan HGTGTr ( 5' -

VGTNCCNGTGCCRTG - 3 ' ) ( Kim et al . 2005) yang digunakan .

Untuk nonribosomal peptida sintase ( NRPS ) PCR amplifikasi ,

primer DKF ( 5'GTGCCGGTNCCRTGNGYYTC - 3 ' ) dan MTR ( 5' - GCNGGYGGYGCNTAYGTNCC - 3 ' ) yang

digunakan ( Neilan et al . 1999) . Dua kondisi digunakan untuk

baik PKS dan NRPS PCR . Untuk amplifikasi PKS dan

Fragmen gen NRPS dari tinggi kandungan DNA GC ( misalnya ,

dari Actinomycetes ) , 10 % dimetil sulfoksida disertakan

dalam campuran reaksi , dan kondisi berikut

digunakan : denaturasi awal pada 95 ° C selama 5 menit , diikuti

dengan sepuluh siklus 95 ° C selama 30 detik , 60 ° C selama 30 detik , dan 72 ° C untuk

1,5 menit , dengan suhu pendinginan dikurangi dengan

2 ° C per siklus , diikuti oleh 30 siklus 95 ° C selama 30 detik ,

40 ° C selama 30 detik , dan 72 ° C selama 1,5 menit , dengan perpanjangan terakhir

72 ° C selama 7 menit . Untuk semua amplifikasi lain, berikut

kondisi yang digunakan : denaturasi awal pada 95 ° C selama

5 menit , diikuti oleh sepuluh siklus 95 ° C selama 30 detik , 65 ° C selama

30 s , dan 72 ° C selama 1,5 menit , dengan suhu anil

dikurangi dengan 2 ° C per siklus , diikuti oleh 30 siklus 95 ° C

selama 30 detik , 45 ° C selama 30 detik , dan 72 ° C selama 1,5 menit , dengan akhir

extension 72 ° C selama 7 menit .

Dalam semua kasus , campuran reaksi ( 50 ml ) mengandung

trifosfat deoxyribonucleotide ( 0,2 mM masing-masing) , 1 ×

penyangga reaksi ( 20 mM Tris pH 8,4 , KCl 50 mM ) , MgCl2

( 1,7 mM ) , primer ( 0,1 M masing-masing) , dan Taq DNA polymerase

( 1,25 unit , semua reagen PCR dibeli dari Bioline ) .

Produk PCR dianalisis dengan elektroforesis agarosa gel .

Sequencing dan Analisis filogenetik dari 16S rRNA Partial

gen

Produk PCR dimurnikan dengan ekstraksi gel Qiaquick

kit ( Qiagen ) dan diurutkan secara langsung menggunakan 27f primer

( sequencing dilakukan oleh GATC Biotech , Konstanz ,

Jerman ) . 16S rRNA urutan gen dianalisis

menggunakan BLAST ( Altschul et al . 1997) untuk mengidentifikasi terdekat

tetangga bakteri . 16S rRNA urutan gen yang

selaras dan pohon filogenetik tetangga - bergabung dibangun

menggunakan MEGA 4 ( Tamura et al . 2007) . bootstrap

tes dilakukan 1.000 kali menggunakan MEGA 4 .

Kloning , Sequencing , dan Analisis filogenetik Parsial

PKS Gen

Produk PCR dimurnikan menggunakan Qiaquick Gel Ekstraksi

Kit ( Qiagen ) dan subcloned menggunakan PCR Qiagen

Kloning Kit . Plasmid yang berisi produk PCR

dimurnikan menggunakan Qiaprep spin miniprep Kit dan

sequencing menggunakan primer T7 promotor oleh GATC Biotech .

Urutan DNA dianalisis dengan menggunakan BLAST dan

Analisis BlastX maupun BlastN ( Altschul et al . 1997) .

Pemeliharaan Indikator Strain

Strain Indikator aktivitas antimikroba adalah Escherichia

coli NCIMB12210 , Bacillus subtilis 1A40 ; Candida glabrata

CBS138 , Listeria monocytogenes strain F2365 dan

EGDE , methicillin-resistant S. aureus strain ST544 ,

ST528 , ST295 , ST299 dan , vankomisin - sensitif S.

aureus ( VISA ) strain 35.403 , 35.197 , 32.681 , 32.679 ,

32.647 , dan 32.682 , heterogen vankomisin -insensitive

S. aureus ( hVISA ) 22900 , Streptococcus pneumoniae TIGR ;

Bacillus cereus FLP1 , vankomisin - tahan enterococci

( VRE ) strain EC289 , EC292 , EC295 , EC533 , EC571 ,

dan EC618 , C. difficile strain ATCC43593 , DPC6357 ,

DPC6360 , DPC6361 , DPC6356 , DPC6353 , DPC6355 ,

DPC6507 , DPC6537 , DPC6538 , DPC6539 , dan DPC6535 .

Strain indikator dikultur sebagai berikut : E. coli dan B.

strain subtilis ditumbuhkan dalam Luria -Bertani ( LB ) pada 37 ° C.

C. glabrata ditumbuhkan pada agar ragi pepton D - glukosa

( YPD ) . C. difficile isolat dipelihara rewel

Agar anaerob ( Lab M ) mengandung 7,5% defibrinated

kuda darah dan Diperkuat Clostridium Menengah ( Merck )

pada 37 ° C. L. monocytogenes strain ditanam di otak

hati infus ( BHI ) broth pada 37 ° C. MRSA , VISA , dan

strain hVISA diinkubasi pada suhu 37 ° C dalam Mueller Hinton

Kaldu aerobik . Strain VRE ditumbuhkan dalam BHI pada 37 ° C.

S. pneumoniae TIGR dikultur dalam BHI dan tumbuh

anaerob pada suhu 37 ° C. B. cereus dikultur di BHI dan

tumbuh pada suhu 30 ° C. MRSA dan VRE strain diberikan oleh

Masyarakat Inggris of Antimicrobial Chemotherapy . VISA

dan strain hVISA yang bersumber dari Bristol Centre for

Penelitian antimikroba dan Evaluasi . C. difficile strain

berasal dari koleksi di Teagasc , Moorepark dan

kode DPC XXXX . Semua jenis lainnya berasal dari

University College Cork koleksi kultur .

Tes Antagonisme ditangguhkan

Aktivitas antimikroba dinilai oleh awalnya ditangguhkan

tes antagonisme diikuti oleh tes difusi cakram dalam

kasus-kasus tertentu . Untuk tes antagonisme ditangguhkan , 5 ml

volume budaya yang akan diuji yang terlihat pada SYPSW

pelat agar pada suhu 28 ° C sampai koloni ~ 0,5-1 cm

diameter ( ini bervariasi dari 2 sampai 6 hari tergantung pada

saring menjadi diuji ) . Untuk E. coli dan B. subtilis , ini adalah

overlayed dengan 10 ml agar lembut LB ( 1,5 % b / v ) seeded

dengan 50 ml budaya semalam dari target yang relevan

saring . Untuk C. glabrata , tersebut overlayed dengan 10 ml

Agar lembut YPD ( 1,5 % b / v ) dengan unggulan 50 ml dari

budaya semalam. Untuk B. cereus , L. monocytogenes , S.

pneumoniae , MRSA , dan VISA strain , tersebut overlayed

dengan 20 ml BHI atau agar Mueller-Hinton lunak ( 1,5 %

b / v ) unggulan dengan 50 ml dari budaya semalam dari

regangan sasaran yang relevan . Untuk Pseudomonas aeruginosa , 100 ml

budaya semalam bakteri spons yang terlihat pada

Pelat agar SYP - SW dan diinkubasi pada suhu 30 ° C selama 3 hari .

Kemudian piring dilapis dengan 5 ml agar lembut BK

0,5 % ( b / v ) yang mengandung P. aeruginosa diencerkan ke final

Mar Biotechnol ( 2009) 11:384-396 387

OD600 dari 0,1 . Pelat diinkubasi semalam bawah

kondisi optimal dan diperiksa untuk mengidentifikasi kasus

di mana zona inhibisi yang jelas .

Tes difusi disk dilakukan dengan cakram disiapkan

seperti dijelaskan di atas . Strain uji dewasa

semalam di media yang tepat sebelum diencerkan

1:100 dalam kaldu cair untuk mencapai konsentrasi akhir

dari ~ 107 CFU ml - 1 . Kultur tersebar di permukaan

agar-agar pilihan menggunakan manik-manik kaca steril , dan piring

dibiarkan kering oleh udara dalam aliran laminar kabinet selama 20 menit .

Potensi antimikroba yang mengandung cakram yang aseptik

ditempatkan ke permukaan plate agar diinokulasi . itu

Pelat diinkubasi selama 18 sampai 36 jam , dan zona pertumbuhan

penghambatan dicatat. Disc diresapi dengan metanol

dan etil asetat juga digunakan untuk tujuan pengendalian .

Deteksi Inhibitor Permukaan - Lampiran

Isolat spons diinokulasi menjadi 10 ml SYP - SW kaldu

dan diinkubasi pada suhu 30 ° C selama 11 hari dengan gemetar . The kaldu

diklarifikasi dengan sentrifugasi ( 10 menit pada 4.500 × g)

siap diklarifikasi kaldu . Budaya semalam P. aeruginosa

Strain PAO1 diencerkan ke OD600 dari 0,25 di LB

kaldu , dan 100 ml dari budaya diencerkan digunakan untuk menyuntik

sumur piring 96 sumur ( Sarstedt , USA ) . kaldu Klarifikasi

( 100 ml ) dibuat dari bakteri spons yang berbeda yang

juga ditambahkan ke piring 96 - baik . Sel diizinkan untuk mematuhi

ke sumur statis pada 37 ° C selama 1 jam . Selanjutnya , sumur

bernoda dengan penambahan 100 ml 0,5 % ( b / v ) kristal

violet selama 15 menit pada suhu kamar . Plat

dibilas dengan air untuk menghilangkan sel terikat dan dibiarkan

kering , setelah itu 250 ml etanol 96 % ditambahkan ke masing-masing

baik untuk membubarkan kristal violet . Kepadatan optik pada

570 nm diukur untuk mendeteksi jumlah relatif

sel terpasang .

Isolasi Bakteri

Total unit pembentuk koloni untuk setiap media isolasi

dibandingkan 4 hari setelah inokulasi awal. koloni

yang paling berlimpah di SYP-SW media (~ 2.4 × 106 g-1

spons) dengan titer terendah di Seawater Isolasi actinomycete

Agar (AIA-SW) (~ 6 × 105 g-1 spons). Secara umum,

penambahan asam nalidiksat kepada media menghasilkan 50%

pengurangan unit pembentuk koloni (CFU, CFUs tidak bisa

secara akurat dihitung NaST21Cx). maksimum

Jumlah bakteri dari 2,4 × 106 g-1 jaringan spons tidak konsisten

dengan perkiraan bakteri> 108 g-1 untuk high-microbialabundance

spons atau bacteriosponges, dengan asumsi bahwa

komponen mikroba culturable adalah <1% seperti yang banyak diperkirakan

bagi banyak relung lingkungan (Amann et al. 1995).

filogeni

Bakteri dijemput , dan 52 isolat yang dipilih untuk

analisis lebih lanjut pada basis keragaman warna koloni ,

ukuran, dan morfologi , dengan penekanan khusus pada

isolasi bersporulasi atau bakteri yang berpotensi berserabut

untuk isolasi Actinobacteria . Bakteri yang dipilih

( Tabel 1 ) tidak karena sampel yang representatif dari

mikrobiota culturable spons . analisis filogenetik

(Gambar 1 ) menunjukkan bakteri terisolasi untuk menjadi anggota empat

bakteri filum ( γ - dan α - Proteobacteria , Firmicutes , Actinobacteria ,

dan Bacteroidetes ) dan 12 genera bakteri . paling

umum di antara isolat tersebut pengelompokan dengan

Streptomycetes ( 19 ) , Pseudoalteromonads ( 12 ) , Halomonads

( 5 ) , Pseudovibrio ( 4 ) , dan Basil Tahan ( 3 ) . Prevalensi

Streptomycetes actinobacterial antara isolat bertanggung

karena pemilihan bakteri bersporulasi dan tidak

menyiratkan bahwa mereka adalah kelompok culturable dominan bakteri .

Para Pseudoalteromonads γ - proteobacterial , bagaimanapun, akan

cenderung tidak diperkaya dengan proses seleksi dan

mungkin kelompok yang paling dominan tunggal culturable

bakteri dari spons . Pseudoalteromonads juga

ditemukan kelompok ditanami paling umum di akhir

Studi bakteri spons terkait dari Norwegia

pantai ( Dieckmann et al . 2005) .

Analisis filogenetik, berdasarkan 16S rRNA gen keberpihakan,

menunjukkan bahwa sebagian besar isolat bakteri dibagi

Identitas% 99 dengan spesies yang dikenal, namun, satu kelompok

Bakteri Streptomycete terkait, SM15, dan Bacillusrelated lain

bakteri, BC3, berbagi identitas hanya 97% dengan mereka

tetangga terdekat oleh pencarian BLAST.

Salt Preferensi

Semua strain dianalisis diisolasi pada media yang mengandung

100% air laut buatan. Air laut preferensi semua strain

dianalisis, dan ditemukan bahwa 30 dari 52 strain memiliki

persyaratan mutlak untuk air laut. Persyaratan ini termasuk

semua keluar α-Proteobacteria dan 17 dari 21 γ-Proteobacteria.

Di antara Actinobacteria, hanya empat dari 20 memiliki

kebutuhan garam mutlak, meskipun tambahan delapan strain

dipamerkan preferensi yang kuat untuk garam, dengan memperhitungkan

efek pada pertumbuhan dan sporulasi (Tabel 1).

bioaktivitas

Semua strain terisolasi awalnya diuji untuk antimikroba

aktivitas menggunakan lempeng agar tes overlay. hasil