ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN KONFIRMASI MIKROBA

I.     Tujuan Percobaan

Dapat memahami prinsip isolasi, identifikasi, dan konfirmasi mikroba, serta dapat

melakukannya dengan baik.

II.     Teori Dasar

Isolasi mikroba merupakan upaya pembiakkan suatu jenis mikroba tertentu yang diperoleh

dari suatu sampel di dalam suatu media yang spesifik, sehingga selanjutnya dapat dilakukan

identifikasi dan konfirmasi. Setiap mikroba memiliki kebutuhan akan zat pertumbuhan yang

spesifik sehingga hal ini dapat dijadikan acuan dalam pemilihan media untuk isolasi, identifikasi

dan konfirmasi.

Media spesifik yaitu media yang digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis

metabolisme suatu mikroba. Contohnya adalah Koser’s Citrate medium, yang digunakan untuk

menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon.

Identifikasi mikroba yaitu Untuk mengetahui sifat-sifat morfologi bakteri, maka bakteri

dapat diperiksa dalam keadaan hidup atau mati. Pemeriksaan morfologi bakteri ini perlu, untuk

mengenal nama bakteri. Disamping itu juga perlu pengenalan sifat-sifat fisiologisnya bahkan

sifat-sifat fisiologis ini kebanyakan merupakan faktor terentu dalam mengenal nama spesies

suatu bakteri. Sedangkan konfirmasi  mikroba yaitu untuk mengetahui jenis bakteri dan

koloninya. Konfirmasi jenis bakteri dapat menggunakan berbagai pewarnaan, reaksi ensimatis

atau reaksi biokimia, terutama jika identifikasi menggunakan media masih meragukan/belum

memuaskan.

Pada umumnya media yang digunakan untuk membiakkan mikroba mengandung air,

sumber energi (protein dan karbohidrat), zat hara (sumber karbon,  nitrogen, sulfur, fosfat,

oksigen dan hidrogen), serta faktor penunjang pertumbuhan (seperti asam amino, vitamin).

Suatu media yang memenuhi kebutuhan mikroba untuk bertahan hidup dan melakukan

aktivitasnya secara normal diperlukan untuk melakukan isolasi jenis mikroba tertentu. Setiap

media spesifik memiliki kandungan senyawa tertentu yang dapat mendukung pertumbuhan

mikroba tertentu tetapi menghambat pertumbuhan jenis mikroba lainnya. Sebagai contoh Media

MCA ( Mac Conkey Agar) mengandung zat warna yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri

Gram Positif, sedangkan bakteri Gram Negatif tetap tumbuh.

Media yang digunakan yaitu MCA (Mac Conkey Agar), Vogel Johnson Agar(VJA),

Cetrimide Agar (CA), Simmon sitrat dan Triple Sugar Iron Agar (TSIA).

 Media MacConkey Agar mempunyai keistimewaan memilah bakteri enterik gram negatif

yang memfermentasi laktosa, karena media ini mengandung laktosa, crystal violet dan neutral

red bile salt. Kemampuan E. coli memfermentasi laktosa menyebabkan penurunan pH, sehingga

mempermudah absorpsi neutral red untuk mengubah koloni menjadi merah bata dan bile/

empedu diendapkan. Koloni lain (S. aureus; P. aeruginosa dan Salmonella), bila tumbuh tidak

akan berwarna karena tidak mampu memfermentasi laktosa. Mikroba lain yang dapat tumbuh

pada media ini antara lain Enterobacter; Proteus; Salmonella; Shigella, Aerobacter;

Enterococcus.

Vogel Johnson Agar Medium mengandung mannitol, tellurite dan lithium chloride yang

berperan untuk mengisolasi bakteri yang bersifat koagulase positip, karena semua yang bersifat

koagulase positip akan tumbuh pada media ini. S. aureus mempunyai koloni hitam sebagai

akibat pengendapan hasil reduksi tellurite. Media di sekitar koloni akan berubah menjadi kuning

akibat fermentasi mannitol. Adanya lithium chloride: sangat bermanfaat untuk menghambat

pertumbuhan bakteri lain termasuk E. coli. Namun demikian media ini kurang mampu memilah

S. aureus karena semua koagulase positip dapat tumbuh termasuk S. epidermidis dan Proteus.

Cetrimide Agar Medium biasanya digunakan untuk isolasi Pseudomonas. Kandungan

cetrimide yang merupakan quarternary ammonium merupakan senyawa yang dapat menghambat

pertumbuhan bakteri lain, karena menyebabkan kebocoran unsur-unsur di dalam sel, namun

tidak terjadi pada Pseudomonas. Pada media cetrimide konvensional beberapa bakteri dapat

tumbuh seperti Klebsiella, Proteus dan Providencia. Untuk menghambat pertumbuhan mereka

dapat ditambahkan cetrimide. Pada media ini, P. aeruginosa dapat dibantu dengan menggunakan

media Pseudomonas Selective Medium yang mengandung Nalidixi acid untuk menghambat

pertumbunan bakteri lain.

Simmon sitrat atau nama lainnya Simmons Citrate Medium mengandung amonium

dihidrogen fosfat, natrium klorida, natrium sitrat. Magnesium sulfat, agar, bromtimol biru,

aquades dan memiliki pH 6,9.

Triple Sugar Iron Agar medium, biasanya digunakan untuk konfirmasi pengujian E. coli

dan dapat digunakan untuk identifikasi bakteri gram negatif yang memfermentasi

dekstrosa/laktosa/sukrosa dan produksi H2S. Dari fungsi tersebut media ini dapat diusulkan

untuk konfirmasi Salmonella dan memilahkan dari Pseudomonas yang tumbuh pada media lain

BSA dan BGA. Terjadinya fermentasi dekstrosa oleh Salmonella akan menurunkan pH menjadi

asam. Kondisi ini akan menyebabkan perubahan phenol red (media merah) menjadi kuning.

Sedangkan Pseudomonas karena tidak mampu memfermentasi dekstrosa, maka media akan tetap

berwarna merah. Dengan demikian media ini dapat dengan mudah memilah Salmonella dari

Pseudomonas.

III.     Alat dan Bahan

      Alat

o  Tabung reaksi steril

o  Rak tabung reaksi

o  Pinset

o  Ose bundar dan lurus

o  Pipet ukur 5 dan 10 ml

o  Bunsen

o  Papan pembentutuk agar miring

o  Inkubatok agar miring

o  Inkubator 37ºC

      Bahan

o  Suspensi bakteri ; S. Aures ; P. Aeruginosa ; E. Coli

o  Potasium telurite

o  Media Mac Conkey Agar (MCA), Vogel Jonson agar (VJA), Cetrimide Agar (CA), Simmon

sitrat, dan Triple Sugar Iron Agar (TSIA).

IV.     Prosedur Percobaan

Media MCA, VJA, dan CA dibuat dalam bentuk Plat Agar, sedangkan media Simmon

sitrat dan TSIA dalam bentuk agar miring. Kemudian masing-masing warna media Dicatat dan

didokumentasikan sebelum di inokulasi dengan bakteri. Setelah itu Masing-masing suspensi

bakteri di inokulasikan pada media MCA, VJA, CA, Simmon Sitrat, dan TSIA. Seluruh kultur

bakteri di inkubasi pada inkubator 37ºC selama 1 minggu dan  pengamatan dilakukan setiap hari

yang mencakup :

-       Warna media : Dibandingkan dengan warna media sebelum diinokulasi dengan bakteri, secara

keseluruhan, disekitar / disekeliling koloni bakteri. Pada agar miring TSIA : digambarkan bila

ada perbedaan warna sesuai dengan posisi media (di dasar, tenga dan permukaan tabung)

-       Ukuran dan Warna koloni bakteri

-       Adanya endapan hitam atau retakkan pada media

Hasil Pengamatan Dibuat Tabel  

 

   VI. Pembahasan

Bakteri Staphylococcus aureus pada media MCA yang diamati pada hari Kamis

(11/11/2010), tumbuh sedikit dipermukaan media pada daerah I dan media yang semula

berwarna merah tua berubah menjadi merah muda. Warna koloni bakteri ini merah muda.

Sedangkan pengamatan yang dilakukan pada hari Jumat (12/11/2010), bakteri tumbuh lebih

banyak pada daerah I dan daerah yang lainnya tidak tumbuh, sedangkan warna media berubah

menjadi kuning kecoklatan. Warna koloninya merah muda. Bakteri S. Aureus merupakan bakteri

gram positif yang akan terhambat pertumbuhannya pada media MCA karena pada media MCA

mengandung garam empedu dan kristal ungu yang akan menghambat pertumbuhan

mikroorganisme gram positif, maka pada media ini bakteri S. Aureus hanya tumbuh sedikit.

Perubahan warna pada media MCA terjadi karena fermentasi laktosa dan penurunan pH.

Pada pengamatan hari kamis (11/11/2010) bakteri Staphylococcus aureus pada  media VJA

tumbuh banyak di semua daerah dan di semua permukaan. Warna media berubah yang semula

orange menjadi kuning muda dan warna koloni dari bakteri ini putih susu. Sedangkan

pengamatan pada hari jum’at (12/11/2010) bakteri tumbuh lebih banyak di permukaan. Warna

media tetap berwarna kuning muda dan warna koloninya putih susu. Pada media ini bakteri S.

Aureus dapat tumbuh dengan baik karena kandungan yang terdapat pada media VJA adalah

mannitol, tellurite dan lithium chloride yang berperan untuk mengisolasi bakteri yang bersifat

koagulase positip, karena semua yang bersifat koagulase positip akan tumbuh pada media ini.

Sedangkan perubahan warna yang terjadi pada media disebabkan oleh asam yang dihasilkan

pada metabolisme bakteri atau akibat fragmentasi manitol. Adanya lithium chloride: sangat

bermanfaat untuk menghambat pertumbuhan bakteri lain termasuk E. coli. Namun demikian

media ini kurang mampu memilah S. aureus karena semua koagulase positip dapat tumbuh

termasuk S. epidermidis dan Proteus.

Pada pengamatan hari kamis (11/11/2010) bakteri Staphylococcus aureus belum ada yang

tumbuh pada media CA tetapi warna medianya tetap berwarna kuning bening. Sedangkan

pengamatan pada hari jum’at (12/11/2010) bakteri tidak tumbuh dan media tetap berwarn kuning

bening. Pada media ini bakteri tidak tumbuh karena mengandung cetrimide yang merupakan

quarternary ammonium yaitu senyawa yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri kecuali

bakteri Pseudomonas, karena menyebabkan kebocoran unsur-unsur di dalam sel.

Pada pengamatan hari kamis (11/11/2010) bakteri Staphylococcus aureus belum ada

bakteri yang tumbuh pada media Simmon Sitrat. Warna media tetep berwarna hijau tua.

Sedangkan pengamatan pada hari jum’at (12/11/2010) bakteri belum tumbuh tetapi warna media

bagian atasnya berubah menjadi biru tua dan bagian bawahnya tetap berwarna hijau tua.

Perubahan warna pada media tersebut menunjukan adanya bakteri yang tumbuh karena bakteri S.

Aureus dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbon tunggal dan ion ammonium sebagai

sumber nitrogen tunggal. Perubahan warna terjadi karena penggunaan sitrat akan meningkatkan

pH media. Peningkatan pH media tersebut menyebabkan perubahan warna pada indikator

bromthymol biru yang mengubah media menjadi warna biru. Bakteri ini termasuk dalam bakteri

aerob fakultatif.

Pada pengamatan hari kamis (11/11/2010) bakteri Staphylococcus aureus bakeri tumbuh

pada media TSIA di permukaannya. Warna media yang semula berwarna merah berubah

menjadi kuning muda. Warna koloninya putih susu. Sedangkan pengamatan pada hari jum’at

(12/11/2010) bakteri tumbuh lebih banyak di permukaan media. Warna media berubah menjadi

kuning emas. Warna koloninya putih susu. Perubahan ini disebabkan karena bakteri dapat

memfermentasi glukosa / laktosa / sukrosa.

Bakteri Escherichia coli pada media MCA yang diamati pada hari Kamis (11/11/2010),

tumbuh banyak di permukaan media. Warna media yang semula merah tua berubah menjadi

kuning muda. Warna koloni bakteri ini putih susu. Sedangkan pengamatan yang dilakukan hari

jum’at (12/11/1010) bakteri tumbuh lebih baik dan lebih banyak. Warna media tetap kuning

muda (keemasan). Warna koloninya putih susu. Pada media ini bakteri dapat tumbuh dengan

baik karena dapat menguraikan laktosa. Kemampuan E. coli memfermentasi laktosa

menyebabkan penurunan pH, sehingga mempermudah absorpsi neutral red untuk mengubah

koloni menjadi merah muda.

Pada hari Kamis (11/11/2010), bakteri Escherichia coli tumbuh banyak pada media VJA

di semua daerah. Warna media merah muda yang semula warna orange dan warna koloninya

putih susu. Sedangkan pengamatan yang dilakukan pada hari Jumat(12/11/2010), bakteri tumbuh

dengan baik dipermukaan media dan di daerah I media pecah (menonjol ke atas) dan warna

media tetap seperti hari kamis berwarna merah muda. Warna koloninya putih susu. Perubahan

warna pada media disebabkan karena bakteri tidak dapat memfermentasi manitol yang

terkandung di dalam media sehingga media berubah menjadi merah muda.

Pada hari kamis (11/11/2010) bakteri Escherichia coli tumbuh pada media CA

dipermukaannya. Warna media berubah menjadi putih bening yang semula berwarna kuning

bening. Warna koloninya putih susu. Sedangkan pengamatan yang dilakukan pada hari jumat

(12/11/2010) bakteri lebih banyak dipermukaan dan didalam media. Warna media tetap seperti

hari Kamis berwarna putih bening. Warna koloninya putih susu. Pertumbuhan tersebut karena

bakteri ini merupakan bakteri gram negatif yang dapat tumbuh pada media CA seperti halnya

pseudomonas.

Pada hari kamis (11/11/2010) bakteri Escherichia coli belum ada yang tumbuh pada

media Simmon Sitrat. Warna media tetap berwarna hijau tua. Sedangkan pengamatan yang

dilakukan pada hari Jum’at (12/11/2010) warna media berubah menjadi biru tua. Perubahan

warna tersebut menunjukkan adanya bakteri yang tumbuh karena mampu menggunakan sitrat

sebagai sumber karbon tunggal dan mereka dapat memetabolisme garam amonium dalam

medium dan penggunaan sitrat meningkstksn pH media. Peningkatan pH tersebut menyebabkan

perubahan warna pada indikator bromthymol biru yang mengubah warna media menjadi biru.

Pada hari kamis (11/11/2010) bakteri Escherichia coli tumbuh pada media TSIA

dipermukaannya. Warna media berubah menjadi kuning muda dan di bagian bawahnya berwarna

hitam yang semula berwarna merah. Sedangkan pengamatan yang dilakukan pada hari Jum’at

(12/11/2010) bakteri tumbuh dipermukaan dan bagian bawah media yang berwarna hitam.

Terdapat gelembung oksigen diatas permukaan hitam. Warna media bagian atas kuning dan

bagian bawahnya hitam. Bakteri ini dapat tumbuh dengan baik pada TSIA karena media ini

biasanya digunakan untuk konfirmasi pengujian E. coli dan dapat digunakan untuk identifikasi

bakteri gram negatif yang memfermentasi dekstrosa/laktosa/sukrosa dan produksi H2S.

Terjadinya fermentasi dekstrosa oleh bakteri gram negatif  akan menurunkan pH menjadi asam.

Kondisi ini akan menyebabkan perubahan phenol red (media merah) menjadi kuning. Sedangkan

warna hitam karena terbentuknya H2S positif dari farmentasi H2 dan CO2.

Bakteri Pseudomonas aeruginosa pada media MCA yang diamati pada hari Kamis

(11/11/2010), belum tumbuh pada media ini. Warna media berubah menjadi merah muda yang

semula berwarna merah tua. Sedangkan pengamatan dilakukan pada hari Jum’at (12/11/2010)

bakteri belum tumbuh dan warna media tetap berwarna merah muda. perubahan warna tersebut

menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri karena bakteri ini termasuk gram negatif yang dapat

menguraikan laktosa . penguraian laktosa menyebabkan penurunan pH sehingga mempermudah

absorbsi neutral red untuk mengubah koloni menjadi merah muda.

Pada hari Kamis (11/11/2010) bakteri P. aeruginosa tumbuh pada media VJA berupa

titik-titik permukaan media. Warna media berubah menjadi merah muda yang semula berwarna

orange. Warna koloninya putih susu. Sedangkan pengamatan pada hari Jum’at (12/11/2010)

bakteri tumbuh lebih banyak. Warna media merah muda tetapi disekelilingnya berwarna kuning.

Warna koloninya putih susu. Perubahan warna menjadi merah muda disebabkan karena manitol

tidak difermentasi sedangkan perubahan warna media menjadi kuning disebabkan karena

perubahan warna merah fenol akibat menanggapi indikator dalam pembentukkan asam.

Pada hari Kamis (11/11/2010) bakteri P. aeruginosa belum ada yang tumbuh pada media

CA. Warna media berubah menjadi putih bening yang semula berwarna kuning bening.

Sedangkan pada pengamatan hari Jum’at (12/11/2010) bakteri belum tumbuh dan warna media

tetap berwarna putih bening. Pada media ini, P. aeruginosa tidak tumbuh karena tidak dibantu

dengan menggunakan media Pseudomonas Selective Medium yang mengandung Nalidixi acid

untuk menghambat pertumbunan bakteri lain.

 Pada hari Kamis (11/11/2010) bakteri P. aeruginosa belum ada yang tumbuh pada media

simmon sitrat dan media berwarna hijau tua. Sedangkan pada pengamatan hari Jum’at

(12/11/2010) bakteri belum ada yang tumbuh tetapi warna media bagian atas berwarna biru tua

dan bagian bawahnya berwarna hijau tua. Perubahan warna tersebut menunjukkan adanya bakteri

yang tumbuh karena mampu menggunakan sitrat sebagai sumber karbon tunggal dan mereka

dapat memetabolisme garam amonium dalam medium dan penggunaan sitrat meningkstksn pH

media. Peningkatan pH tersebut menyebabkan perubahan warna pada indikator bromthymol biru

yang mengubah warna media menjadi biru. Pembentukkan warna biru terdapat pada bagian atas

media karena bakteri ini memerlukan oksigen karena bakteri ini termasuk bakteri aerob obligate.

Pada hari Kamis (11/11/2010) bakteri P. aeruginosa belum ada yang tumbuh dan media

tetap berwarna merah. Sedangkan pada hari Jum’at (12/11/2010) belum ada bakteri yang tumbuh

dan media berwarna merah. Bakteri ini tumbuh karena Pseudomonas tidak mampu

memfermentasi dekstrosa, maka media akan tetap berwarna merah.

VII.     Kesimpulan

  Isolasi mikroba merupakan upaya pembiakkan suatu jenis mikroba tertentu yang diperoleh dari

suatu sampel di dalam suatu media yang spesifik, sehingga selanjutnya dapat dilakukan

identifikasi dan konfirmasi.

  Identifikasi mikroba yaitu Untuk mengetahui sifat-sifat morfologi bakteri, maka bakteri dapat

diperiksa dalam keadaan hidup atau mati. Pemeriksaan morfologi bakteri ini perlu, untuk

mengenal nama bakteri.

  Sedangkan konfirmasi  mikroba yaitu untuk mengetahui jenis bakteri dan koloninya. Konfirmasi

jenis bakteri dapat menggunakan berbagai pewarnaan, reaksi ensimatis atau reaksi biokimia,

terutama jika identifikasi menggunakan media masih meragukan/belum memuaskan.

  Tabel pertumbuhan bakteri pada media spesifik

BAKTERIMEDIA

MCA VJA CA SS TSIA

S. Aureus +* + + + +

E. Coli + + + + +

P. Aureginosa + - - + +

Keterangan :

-          (+) = bakteri tumbuh dengan baik

-          (-) = bakteri tidak tumbuh

-          (*) = pertumbuhan terhambat

VIII.  Daftar Pustaka

Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.

Pelczar, Michael J. Dasar - Dasar Mikrobiologi I. 2006. UI-Press: Jakarta.

Volk , W. A & Wheeler. M. F. 1993. Mikrobiologi Dasar Jilid 1 Edisi ke 5. Erlangga.

http://www.kalbe.co.id/files/cdk/files/10PeranMediauntukIdentifikasiMikroba124.pdf/

                     PeranMediauntukIdentifikasiMikroba124.html diakses pada tanggal          

                      07/12/2010

http://myaluzz.wordpress.com/2010/02/09/laporan-mikrobiologi/ diakses pada tanggal

                     07/12/2010

http://perpustakaan.pom.go.id/KoleksiLainnya/Buletin%20Info%20POM/0208.pdf diakses pada

tanggal 07/12/2010