OBSERBACION Y CONTAJE MICROSCOPICOANALISIS DE JUGO DE NARANJA Y NARANJADA

YORLAIS ARROYO CI: 92.641.956

Republica Bolivariana de VenezuelaLa Universidad del ZuliaFacultad Experimental de CienciasMaestra en: MicrobiologaTpico especial en microbiologa de alimentos

Maracaibo, julio, 20011INTRODUCCIONLos microorganismos estn presentes en el ambiente natural del hombre, incluso en l mismo y en todos los seres vivos (plantas y animales) de los que se alimenta. De hecho, cualquier producto alimenticio, transformado o no, que el hombre consume, puede estar contaminado por microorganismos, los cuales pueden ser causantes de intoxicaciones y toxiinfecciones graves. (Bourgeois y col., 1994)La enfermedad transmitida por los alimentos ha sido definida por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) como una enfermedad de carcter infeccioso o txico causada por el consumo de alimentos o de agua. (Adams y Moss, 1997).Las normas en materia de alimentos, generalmente establecen la calidad microbiolgica en trminos de microorganismos indicadores. stos son organismos (o grupos) que advierten oportunamente de un manejo inadecuado o contaminacin que incrementan el riesgo de presencia de microorganismos patgenos en alimentos. Adems de que su deteccin en el laboratorio es ms sencilla, rpida y/o econmica, los microorganismos indicadores permiten un enfoque de prevencin de riesgos, puesto que advierten manejo inadecuado y/o contaminacin (Koburger J, 1984).Los principales microorganismos indicadores en alimentos son: Indicadores de condiciones de manejo o de eficiencia de proceso: mesfilos aerobios, cuenta de hongos y levaduras, cuenta de coliformes totales Indicadores de contaminacin fecal: coliformes fecales, E. coli, Enterococos.La seleccin de indicadores en un alimento depende fundamentalmente de los riesgos implicados y de lo que se requiera saber para controlar o mejorar el alimento.Mesfilos aerobios: Esta determinacin indica el grado de contaminacin de una muestra y las condiciones que han favorecido o reducido la carga microbiana. Desde luego, no se aplica a alimentos fermentados, y puede dar escasa informacin sobre el manejo del alimento cuando ste es poco favorable para el desarrollo microbiano por su pH. Este grupo es un indicador importante en alimentos frescos, refrigerados y congelados, en lcteos y en alimentos listos para consumir) (Koburger J, 1984).

Cuenta de hongos y levaduras:Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, por lo que son frecuentes en la microbiota habitual de muchos alimentos; se dispersan fcilmente por el aire y el polvo. Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos donde las condiciones no favorecen el crecimiento bacteriano, por ejemplo: pH cido, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento. Como grupo indicador son tiles para evidenciar grado general de contaminacin en alimentos con estas caractersticas o cuando los mesfilos aerobios no son tiles, como en alimentos fermentados (Koburger J, 1984). Cuenta de coliformes totalesLas bacterias del grupo coliforme se definen como: bacilos cortos, Gramnegativos, anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa a 35 C, en menos de 48 h, con produccin de cido y gas. Actualmente se consideran un excelente indicador de la eficiencia de los procesos de sanitizacin y desinfeccin, as como de calidad sanitaria en agua, vegetales y diversos productos procesados.

OBJETIVOS

Relacionar las caractersticas de los alimentos con los indicadores que pueden contaminarlos.

Interpretar los resultados de la presencia de indicadores con la calidad microbiolgica de los alimentos.

Establecer si un alimento cumple con la normatividad vigente.

Aplicar mtodos de muestreo adecuados para la determinacin de los indicadores.

Realizar adecuadamente la tcnica de vertido en placa para diversos grupos microbianos de importancia en alimentos.

METODOLOGIACuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la tcnica comnmente utilizada es la cuenta en placa. Esta tcnica no pretende detectar a todos los microorganismos presentes, pero el medio de cultivo, las condiciones de temperatura y la presencia de oxgeno, permiten seleccionar grupos de bacterias cuya presencia es importante en diferentes alimentos; por ejemplo, las bacterias mesoflicas aerobias son un indicador general de la poblacin que pueden estar presente en una muestra y, por lo tanto, de la higiene con que ha sido manejado el producto (Camacho, A., et al 2009).La tcnica se fundamenta en contar las unidades formadoras de colonias o UFC presentes en un gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada colonia que desarrolla en el medio de cultivo de eleccin despus de un cierto tiempo de incubacin a la temperatura adecuada, proviene de un microorganismo o de un agregado de ellos, de la muestra bajo estudio; ese microorganismo o microorganismos son capaces de formar la colonia, es decir una UFC. Para que las colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las diluciones decimales necesarias de la muestra, antes de ponerla en el medio de cultivo (Camacho, A., et al 2009). (ver figura 1. Donde se describe la tcnica de vertido en placa).Los microorganismos indicadores y los medios de cultivo utilizados en la prctica calidad microbiolgica de jugo de naranja y naranjada fueron los siguientes: ANALISIS DE JUGO DE NARANJARECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS: El Agar Papa y dextrosa es un medio utilizado para el cultivo de hongos y levaduras a partir de muestras de alimentos, el cual puede ser suplementado con antibiticos o cidos para inhibir el crecimiento bacteriano. La base del medio es altamente nutritiva y permite la esporulacin y la produccin de pigmentos en algunos dermatofitos. Algunos procedimientos sealan bajar el pH del medio a 3.5 0.1 con cido tartrico al 10 %, para inhibir el crecimiento bacteriano. Las levaduras se observan como colonias de color crema o blanco. Los hongos crecen como colonias difusas y de varios colores. La cuenta del nmero de colonias se relaciona con el factor de dilucin de la muestra, para determinar el nmero de microorganismos por gramo o mililitro de muestra. CONTEO DE ACIDURICOS: se utilizo el agar thermoaciduranas para el aislamiento de Bacillus thermoacidurans de los procesos alimentariosComposicin en g / L: Proteasa peptona: 5,00 Extracto de levadura: 5.00 Dextrosa: 5,00 Fosfato dipotsico: 4,00 Sulfato de manganeso: 0,20 Agar: 20.00 El pH final (a 25 C): 5.0 0.ANALISIS DE NARANJADARECUENTO DE AEROBIOS MESOFILOS: este fue realizado en de agar (PC) el cual es un medio de cultivo utilizado para evaluar o controlar "total" o viable el crecimiento de bacterias de una muestra. El PC no es un medio selectivo.La composicin del PC puede variar pero normalmente contiene0,5% de peptona 0,25% de extracto de levadura 0,1% de glucosa 1,5% de agar pH neutro a 25 C .RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS: El Agar Papa y dextrosa es un medio utilizado para el cultivo de hongos y levaduras a partir de muestras de alimentos, el cual puede ser suplementado con antibiticos o cidos para inhibir el crecimiento bacteriano. La base del medio es altamente nutritiva y permite la esporulacin y la produccin de pigmentos en algunos dermatofitos. Algunos procedimientos sealan bajar el pH del medio a 3.5 0.1 con cido tartrico al 10 %, para inhibir el crecimiento bacteriano. Las levaduras se observan como colonias de color crema o blanco. Los hongos crecen como colonias difusas y de varios colores. La cuenta del nmero de colonias se relaciona con el factor de dilucin de la muestra, para determinar el nmero de microorganismos por gramo o mililitro de muestraMEDIO UTILIDADO COMO DILUENTE: Fue utilizada como diluente el agua Peptonada por ser un medio de enriquecimiento no selectivo, recomendado para ser utilizado en lugar de solucin fisiolgica para recuperar clulas daadas por procesos fisicoqumicos, a los que ha sido sometido el alimento. Figura 1. Tcnica de vertido en placa Realizar diluciones decimales empleando tubos con 90 ml 10 ml de muestra en 90 ml 10 ml en 90 del 10 ml en 90 del del diluente diluente diluente Muestra 10-1 10-2 10-3 Depositar 1.0 mL de cada dilucin en Cajas de Petri estriles por duplicado 1.0 ml 1.0 ml 1.0ml Adicionar de 12 ml de agar fundido y enfriado a 45C en Homogeneizar la muestra y el Agar mediante Incubar las cajas en posicin invertida Contar aquellas placas que tengan entre 25 a 250 colonias y reportar como ufc por ml de muestra ANALISIS DE JUGO DE NARANJAIdentificacin de la muestra:La muestra utilizada proviene de jugos de naranja concentrados de venta pblica en la ciudad de Maracaibo estado Zulia a la cual se le realizo en anlisis para la identificacin de aciduricos y mohos y levaduras procediendo segn la norma COVENIN 1126-89.Preparacin de diluciones decimales Se mide 10 ml de la muestra y se transfieren a un frasco de dilucin que contenga 90 ml de agua peptonada al 0,1% (diluyente), as se obtuvo la dilucin 1:10. Se prepararon diluciones decimales a partir de esta primera dilucin, dos veces ms, y se obtuvo las diluciones 10-2, 10-3 de la misma forma como se realizo la primera dilucin. Determinacin de mohos y levaduras: Se coloca 1 ml de cada una de las diluciones respectivas en placas de Petri por duplicado. Se aade a cada placa 12 ml del medio PDA previamente fundido a 45 grados, se mezcla conveniente mente y se deja solidificaren en una superficie plana. Se invierten las placas y se incuban a oscuridad a una temperatura de 20 25 grados durante 3 a 5 das. Finalizado el periodo de incubacin se seleccionan preferentemente las placas donde aparezcan entre 10 y 100 colonias, Con la ayuda de un cuenta colonias. Se cuentan todas las colonias de mohos y levaduras por separado y se multiplica por la concentracin correspondiente.Determinacin de aciduricos: Se coloca 1 ml de cada una de las diluciones respectivas en placas de Petri por duplicado. Se aade a cada placa 12 ml del medio thermoaciduranas previamente fundido a 45 grados, se mezcla conveniente mente y se deja solidificaren en una superficie plana. Se invierten las placas y se incuban a temperatura de 20 a 25 grados durante 3 a 5 das al abrigo de la luz. Finalizado el periodo de incubacin se seleccionan preferentemente las placas donde aparezcan entre 10 y 100 colonias, Con la ayuda de un cuenta colonias y se multiplica por la concentracin correspondiente.

ANALISIS DE JUGO DE NARANJADAIdentificacin de la muestraSegn la norma COVENIN 1701-93 para el anlisis microbiologico de naranjadas pasteurizadas esta se define como el producto preparado a partir de jugo de naranja o su concentrado no fermentado, extrados de naranjas maduras, sanas y limpias de la especie citrus sinensis, adicionando agua potable con o sin edulcorantes.El producto utilizado en esta prctica fue jugo de naranja al 60% de la empresa MERILAC, el cual es un jugo de naranja pasteurizado con registro del MPPS N A84.070. Envasado por la empresa PANAMERICANA LACTEOS CA. Caja seca estado Zulia.Preparacin de diluciones decimales Se mide 10 ml de la muestra y se transfieren a un frasco de dilucin que contenga 90 ml de agua peptonada al 0,1% (diluyente), as se obtuvo la dilucin 1:10. Se prepararon diluciones decimales a partir de esta primera dilucin, dos veces ms, y se obtuvo las diluciones 10-2, 10-3 de la misma forma como se realizo la primera dilucin.Determinacin de mohos y levaduras: Se coloca 1 ml de cada una de las diluciones respectivas en placas de Petri por duplicado. Se aade a cada placa 12 ml del medio PDA previamente fundido a 45 grados, se mezcla conveniente mente y se deja solidificaren en una superficie plana. Se invierten las placas y se incuban a oscuridad a una temperatura de 20 25 grados durante 3 a 5 das. Finalizado el periodo de incubacin se seleccionan preferentemente las placas donde aparezcan entre 10 y 100 colonias, Con la ayuda de un cuenta colonias. Se cuentan todas las colonias de mohos y levaduras por separado y se multiplica por la concentracin correspondiente.Determinacin de aerobios mesfilos Se coloca 1 ml de cada una de las diluciones respectivas en placas de Petri por duplicado. Se aade a cada placa 12 ml del medio PC previamente fundido a 45 grados, se mezcla conveniente mente y se deja solidificaren en una superficie plana. Se invierten las placas y se incuban a 32 durante 48 horas. Finalizado el periodo de incubacin se seleccionan preferentemente las placas donde aparezcan entre 30 y 300 colonias, Con la ayuda de un cuenta colonias. Se cuentan todas las colonias y se multiplica por la dilucin correspondiente y se expresa el resultado como estimado del recuento estndar.

RESULTADOSJUGO DE NARANJA: los resultados se expresan como UFC/ml de muestra

1x 10-1 promedio de las 2Placas x la respectiva dilucin1x10-2 promedio de las 2 placas x la respectiva dilucin1x10-3 promedio de las dos placas x la respectiva dilucion

AciduricosMuy numeroso3.1x1031x101

Levaduras Muy numeroso2.6x1031x101

Mohos1x1011x1011x101

NARANJADA:

1x 10-1 promedio de las 2Placas x la respectiva dilucin1x10-2 promedio de las 2 placas x la respectiva dilucin1x10-3 promedio de las dos placas x la respectiva dilucin

Aerobios mesfilos1.14x1031x1011x101

levaduras2.15x1021x1011x101

mohos1x1011x1011x101

DISCUSINLa presencia de los microorganismos en los alimentos en ocasiones puede ser inevitable, por ello es importante conocer a partir de qu lmites o en que condiciones se torna inaceptable o impropio para el consumo. En Venezuela estos limites estn regulados por la comisin venezolana de normas industriales ministerio de fomento (COVENIN).En esta prctica de laboratorio fueron evaluadas la calidad microbiolgica del jugo de naranja y un subproducto de este denominado naranjada con las respectivas indicaciones que sus normas revelaban. Para el anlisis del jugo de naranja fue utilizada la normativa COVENIN 3123.1994 y 16699:1994 en la cual se exigen el requisito de anlisis en conteo de aciduricos, mohos y levaduras y para el anlisis de naranjada se realizo el conteo de aerobios mesfilos, mohos y levaduras como lo confronta la norma 1701-93.Para el anlisis de jugo de naranja se encontr un valor de aciduricos en la dilucin 1:10 incontable para ser reportado. En la dilucin 1:100 el valor fue de 3.1x103 el cual al ser confrontado con lo que dice la norma 1x103 - 1x104 entra o cabe en el rango establecido para su consumo e inocuidad como alimento. En la dilucin 1:1000 no se encontr crecimiento por lo cual se reporta como indica la normativa con un valor menor que uno multiplicado por la menor dilucin utilizada, en este caso se reporta como 1x101. Cabe mencionar que se utilizo la tcnica de vertido en placa ya que es la ms utilizada para estos anlisis. La finalidad de dicha tcnica no es poner en evidencia todos los microorganismos aciduricos que deterioran los alimentos, sino que nicamente proporciona una estimacin de la cifra realmente presente y refleja la posible vida de del jugo.Con referencia a los mohos no fue encontrado resultados de su presencia por lo que se reporta como valor 1x101 como lo sugiere la norma.Con referencia a las levaduras los valores obtenidos en la primera dilucin 1:10 fueron incontables para su reporte por su crecimiento abundante y no fcil de contabilizar. En la dilucin 1:100 el valor fue de 2.6x103 dicho valor sobrepasa al valor mximo de aceptacin sugerido por la norma COVENIN 1337- 90 el cual es de 1x103. La dilucin 1:100 no se obtuvo crecimiento de estos microorganismos por lo cual se reporta como menor a 1 multiplicado por la menor dilucin (1x101).De cierta forma ha de esperarse estos valores altos de lavaduras en estos jugos ctricos debido a las condiciones de PH acido en la que se encuentran, la cual es una de las caractersticas fundamental para el desarrollo de estos, otra caractersticas de esta bebida que podra favorecer su proliferacin es la baja temperatura de almacenamiento en la que estos se conservan, sin lugar a dudas es importante realizar estos controles de mohos y levaduras en estas bebidas por que son indicadores del grado general de contaminacin y tambin de aparicin de hongos toxignicos.Con referencia al anlisis de la naranjada esta es definida segn la norma COVENIN 1701-93 como el producto preparado a partir del jugo de naranja o su concentrado, no fermentado, extrado de naranjas maduras, sanas y limpias de la especie citrus sinensis adicionando agua potable ,con o sin edulcorantes sometido a tratamiento trmico adecuado que asegure su conservacin. La naranjada a evaluar fue la de la empresa MERILAC la cual ofrece un producto al 60% de jugo de naranja pasteurizado, con registro en el MPPS N A 84.070.Los anlisis microbiolgicos utilizados fueron el de aerobios mesfilos, mohos y levaduras en los cuales se obtuvieron los siguientes resultados.Para el recuento de aerobios mesfilos fue utilizada la Norma Venezolana COVENIN 902-87. (Mtodo para la cuenta de Bacterias Aerobias en Placa de Petri) El recuento se realizo en las placas que tenan un valor entre 30-300 colonias. En la dilucin 1:10 se encontr un valor de 1.14x103 el cual sobrepasa el valor mximo de aceptacin que es de 1x103. En las diluciones 1:100 y 1.100 no se encontr microorganismos correspondientes lo cual se reporta como sugiere la norma menor a uno multiplicado por la menor dilucin (1x101).Esta determinacin se realiza para conocer el grado de contaminacin de la muestra y las condiciones que han favorecido o reducido la carga microbiana lo que nos coloca a pensar si hubo falla alguna en el proceso de pasteurizacin o en el manejo del producto por sus operadores debido a que las condiciones de PH en las que se encuentra la bebida son desfavorables para el desarrollo de bacterias.Para el recuento de mohos y levaduras fue utilizada la norma COVENIN 1337- 90. (Mtodos para el recuento de mohos y levaduras) la cual indica que el recuento debe realizarse en las placas que contengan valores de colonias entre 10 y 100.Con referencia a los mohos en particular no se encontr desarrollo de estos en las diferentes diluciones reportndose como sugiere la norma menor que uno multiplicado por la menor dilucin (1x101). Con referencia a las levaduras se encontr crecimiento en la dilucin 1:10 con valores ufc de 2.15x102 el cual sobrepasa al valor mximo establecido por la norma que es de 1x101.En las otras diluciones1:100 y 1:100 hubo crecimiento pero estas no se encontraron en el rango correspondiente que va desde 10 hasta 100. Como se menciono en el anlisis de jugo de naranja las condiciones propias de estos jugos son un caldo de cultivo apropiado para el desarrollo de estos microorganismos pero su utilidad como indicador viene dada a que si estos pueden desarrollarse tambin lo pueden hacer hongos productores de toxinas que ponen en riesgo a los consumidores. Es importante resaltar que el producto conocido como naranjada de la empresa MERILAC no eta proporcionando un producto en reglas con las normativas venezolanas para el control de alimentos, tambin es claro que afirmar esto no es a si de simple con solo este estudio se han de realizar muchos mas para llegar a esta conclusin pero si debe ser una alerta para los medios de control y vigilancia a tomar unas medidas rigurosas para el control de estos alimentos.

REFERENCIAS1. Adams M., Moss M. (1997). Microbiologa de los alimenos. Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa. Pp 176-382. ISBN 84-200-0830-3.

2. Bourgeois C., Mescle J., Zucca J. (1994). Microbiologa alimentaria, aspectos microbiolgicos de la seguridad y calidad alimentaria. Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa. Pp 1, 217, 218. ISBN 84-200-0771-4.

3. Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.

4. Koburger J. & Martha E. (1984) Yeasts and Molds. In: Compendium of methods for the microbiological examination of foods. 2nd ed. Marvin S. (Ed.) APHA. USA. 197-199.

5. NORMA COVENIN 1126-89.Alimentos. Identificacin y preparacin de muestras para el anlisis microbiolgico (PRIMERA REVISION)

6. NORMA COVENIN 1701-93 Para el anlisis microbiolgico de naranjadas

7. NORMA COVENIN 3123.1994.Recuento de microorganismos aciduricos.

8. NORMA COVENIN 1337- 90 .Mtodos para el recuento de mohos y levaduras.

9. NORMA COVENIN 902-87. Mtodo para la cuenta de Bacterias Aerobias en Placa de Petri

10. NORMA COVENIN 16699:1994.jugo de naranja