DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik.

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Pemberian aliran listrik dapat menyebabkan terjadi perpindahan aliran elektron dan zat objek, kemudian akan bergerak dari elektroda negatif ke arah sisi elektroda positif. Kecepatan pergerakan ini berbeda-beda, tergantung dari muatan dan berat molekul DNA. Kisi-kisi gel berfungsi sebagai pemisah. Objek yang berberat molekul lebih besar akan lebih lambat berpindah.

Metoda Elektroforesis gel agarosa didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal.

Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Gel agarosa dapat melakukan pemisahan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga nanti di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya.

Elektroforesis adalah metode pemisahan atau analisis fisika berdasarkan migrasi partikel bemuatan yang terlarut atau terdispersi dalam larutan elektrolit dengan bantuan medan listrik, terdapat fase diam yaitu kertas dan fase gerak yaitu partikel bermuatan yang terlarut di antaranya adalah ion kompleks 90Ydan 90Sr. Akibat diberi beda potensial, fase gerak akan berpindah sepanjang medium yang kontinyu ke arah elektroda yang sesuai. Pemisahanterjadi akibat ketidak homogenan atau gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan.

Teknik elektroforesis digunakan untuk memisahkan dan mempurifikasi makromolekul. Makromolekul yang dijadikan objek elektroforesis adalah protein dan asam nukleat yang memiliki perbedaan ukuran, kadar ion, dan molekul-molekul penyusunnya. Molekul-molekul tersebut diletakkan dalam di dalam medan listrik sehingga akan bermigrasi karena adanya perbedaan muatan. Molekul protein dan asam nukleat yang bermuatan negatif akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif dari gel elektroforesis.

Elektroforesis gel agarosa adalah metode pemisahan molekul DNA dan RNA menurut muatan, ukuran, dan bentuk. Teknik ini sederhana, cepat terbentuk, dan mampu memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya secara akurat, dibanding dengan densitas gradient sentrifugasi. Saat arus listrik diaplikasikan pada gel, molekul bermuatan negatif akan berpindah

menuju elektroda positif dan molekul bermuatan positif akan menuju elektroda bermuatan negatif. Faktor-faktor yang menyebabkan kegagalan elektroforesis gel agarosa antara lain karena sel belum lisis sempurna, DNA belum keluar dari sel, serta DNA mengalami degradasi (tekanan mekanik).

Metoda elektroforesis gel agarosa didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA (sekuensing). Molekul organik yang dapat dielektroforesis antara lain DNA, RNA, dan protein. Molekul-molekul yang bermuatan positif akan bergerak menuju elektroda negatif, sedangkan molekul bermuatan negatif akan bergerak ke elektroda positif melalui gel elektroforesis. Lokasi fragmen DNA yang terbentuk seperti pita-pita pada elektroforesis dapat diamati secara spesifik dengan menggunakan pewarna. Pewarna yang digunakan adalah etidium bromida yang dapat menyisip di antara basa-basa pada DNA. Gel yang diberi etidium bromida dan disinari dengan UV akan memperlihatkan lokasi DNA sebagai untai berwarna merah-jingga. Etidium bromida merupakan senyawa karsinogenik sehingga dalam melaksanakan percobaan yang menggunakan etidium bromida harus menggunakan sarung tangan.

Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi untuk mengetahui ukuran DNA hasil apmlifikasi. Marker DNA yang terdapat dalam gel elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi molekul DNA yang bermigrasi untuk menentukan perkiraan ukuran basa-basanya (Martin, 1996).

DNA gel elektroforesis adalah teknik biologis eksperimental penting dan sekuensing DNA dapat didefinisikan olehnya. Gel elektroforesis terdiri dari pemecahan molekul menjadi fragmen banyak oleh aksi enzim tertentu. Fragmen ini tersebar di media poliakrilamida atau gel agarosa dimana medan listrik diterapkan. Masing-masing fragmen memiliki muatan listrik yang berbeda dan berat molekul, menyebabkan mereka harus bermigrasi pada tingkat yang berbeda melalui gel (Der Lee, 2011).

Fungsi alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum elektroforesis gel agarosa ini yaitu :

· Buffer elektroforesis yang terdiri dari TAE memiliki daya ion dalam larutan sebagai penghantar listrik.

· Loading dye berfungsi sebagai pemberat agar tidak keluar dari sumuran.

· Etidium bromida sebagai pewarna DNA yang akan menyisip di sela-sela basa nukleotida.

· UV transiluminator untuk visualisasi pewarnaan DNA didalam gel agarosa.

· Aquades sebagai pelarut

· Baki gel agarosa sebagai cetakan gel agarosa

· TAE : Trisbase sebagai buffer sesuai dengan pH

· Asam Asetat Glasial sebagai elektrolit gram

· EDTA (Etylen Diamine Tetra Asetic Acid) sebagai pe-non aktif DNA

· Sisir elektroforesis untuk membuat sumuran pada gel agarosa

· Tangki elektroforesis untuk running DNA

· Mikropipet untuk mengambil dan menghomogenkan sampel DNA dan loading dye

· Kertas Parafilm untuk tempat menghomogenkan sampel DNA dan loading dye

· Sarung tangan untuk melindungi terkena DNA-se yang dapat merusak DNA

Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, kemudian di-sequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan berikut:

1. Membandingkan gen homolog dari sspesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom.

2. DNA fingerprinting.

3. Mendeteksi kelainan genetik.

4. Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu.

5. Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau percobaan perlakuan gen.

6. Mempelajari evolusi tingkat molecular.

7. Mengetahui variasi genetik yang ada di alam.

8. Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA, RNA, dan protein tertentu.

9. Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu.

10. Mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan DNA plasmid.

11.Menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi lewat PCR.

Menurut Susanto (2012), laju migrasi DNA ditentukan oleh konformasi molekulnya, dari yang paling cepat yaitu Covalently Closed Circular (CCC), Open Circular, dan linier. Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya.

Agarosa memiliki beberapa kelebihan seperti mudah didapat, harganya relatif murah, tidak bersifat toksik, serta memiliki pori yang kecil. Agarosa merupakan polisakarida yang diekstrak dari rumput laut. Hasil dari elektroforesis gel agarosa akan menunjukkan warna biru dari loading dye pada posisi paling depan kemudian plasmid DNA berwarna orange terang. Berdasarkan pustaka, teknik elektroforesis pada dasarnyadidasarkan pada fakta bahwa DNA cenderung bermuatan negatif pada pH netral dengan buffer phospat sebagai penyangga pH agar. Saat dilakukan elektroforesis dengan memberikan daya listrik di kedua kutub maka DNA akan bergerak ke kutub positif, inilah prinsip kerja elektroforesis gel agarosa. Agarosa merupakan gel yang memiliki resolusi lebih rendah dalam pemisahan tetapi dapat memisahkan sampel yang berukuran sampai puluhan kilo basa. Agarosa terbuat dari polisakarida, dilarutkan dengan buffer dan dipanaskan, setelah dingin akan membentuk gelatin yang padat.

Information 2. Indon mari!!

I.  TUJUAN

1. Mempelajari teknik elektroforesis gel untuk mengetahui ukuran fragmen

    DNA tanaman, darah dan plasmid.

2. Mengetahui dan memahami prinsip kerja elektroforesis gel.

II.  TEORI

           

            Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan

memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat

berdasarkan perbedaan ukuran. Elektroforesis merupakan metode yang

paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi

molekuler (Bowen 2000: 1).  Elektroforesis gel adalah teknik memisahkan

suatu makromolekul dengan cara memberi gaya pada makromolekul

tersebut untuk melewati medium berisi gel dibantu dengan tenaga listrik

(Anonim ?: 1).

            Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang

bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik.  Molekul-

molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif

berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya (Bowen 2000:

1).  Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju

kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif

(kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda) (Klug & Cummings

1994: 215).

            Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai

ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asid nukliek.  Elektroforesis

dalam skala besar memungkinkan untuk digunakan sebagai metode

pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan komponen dari protein

atau asam nukleat setiap individu (Fairbanks & Andersen 1999:

280).  Aplikasi elektroforesis dapat digunakan dalam uji paternitas dan

identifikasi pelaku kejahatan (DNA fingerprinting).  Elektroforesis juga

berperan dalamhuman genome project (Anonim ?: 3).

Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju

perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan

listrik.  Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA

menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan

panjang yang sama (Campbell dkk. 2002: 396--397). Ada tiga jenis gel yang

dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:

1.    Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda

oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.

2.    Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang

berukuran besar.

3.    Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem

elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar.

(Davis dkk. 1994: 151).

Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang

mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu:

1.    Ukuran Molekul DNAMolekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.

2.    Konsentrasi gel

Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga

sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih

tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi

agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran

yang lebih besar.

3.    Bentuk molekul

Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak

dibandingkan dengan yang berbentuk bulat.

4.    Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan

densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul

dengan densitas muatan yang rendah.

5.    Pori-pori gelSemakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA.

6.    VoltaseSemakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA.

7.    Larutan buffer elektroforesis

Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga

mempercepat migrasi DNA.

(Wolfe 1993: 127; Bowen 2000: 3-4).

Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui

ukurannya.  Marker berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA

hasil ampifikasi.  Marker DNA yang terdapat di dalam ruang elektroforesis

berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang

bermigrasi.  Marker-marker DNA tersebut merupakan marker yang telah

dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya jelas. Salah satu

contohmarker DNA adalah lambda HindIII.  Marker tersebut memiliki

delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23.130

pb. Penggunaan DNA marker tersebut dikarenakan molekul DNA yang akan

diamati memiliki fragmen DNA dengan ukuran 110--20.000 pb. (Birren & Lai

1993: 82; Martin 1996: 77).

            Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari:  1.  Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarosa.

2.  Tray: digunakan untuk sebagai cetakan gel agarosa.

3.  Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarosa.

4.  Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis.

 Etidium Bromida - meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat

terlihat jelas, sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk

memantau kecepatan molekul DNA pada gel (Birren & Lai 1993: 79--81).

Manfaat elektroforesis gel -mengetahui ukuran fragmen DNA dari

produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda

ukuran, lalu dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi

DNA.  Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan,

antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda,

mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA finger printing,

mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau

penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau

jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai

tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan

tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui variasi

genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi

berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik,

menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi

persamaan dan perbedaan genetik antar individu, dan menentukan jumlah

fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan plasmid DNA (Russell 1994:

299--310 & 500--501; Fairbanks & Andersen 1999: 278).

III.  ALAT, BAHAN DAN CARA KERJA

A.  ALAT

Alat yang digunakan dalam praktikum elektroforesis gel adalah

aparatus elektroforesis yang terdiri dari tray, comb, chamberdan sumber

listrik; sarung tangan karet; mikropipet dan tips; alat dokumentasi gel (gel

doc) merek BIORAD tipe XR.

B.  BAHAN

            Bahan yang digunakan dalam praktikum elektroforesis gel adalah

bubuk agarosa 1 gr; running buffer; loading buffer; parafilm; sampel DNA

(produk PCR); Etidium bromida (EtBr); DNA marker (lambda DNA/Hind III).

C.  CARA KERJA

1.    Gel agarose dibuat (telah dilakukan oleh asisten) dengan campuran 2 gr

agarose + 200 ml 1x TBE, dididihkan dan ditambahkan etidium bromida

2 L dicampur dengan baik, kemudian dituangkan ke dalam cetakan yang

telah disiapkan dengan combnya dan dibiarkan sampai mengeras.

2.    Gel dimasukkan kedalam electrophoresis chamber dan ditambahkan

larutan running buffer serta etidium bromida.

3.    Sampel DNA hasil PCR dicampurkan dengan loading bufferkemudian

dimasukkan ke dalam well pada gel dengan menggunakan mikropipet.

4.    Marka DNA dimasukkan.

5.    Penutup electrophoresis chamber dipasang dan power supplydinyalakan.

6.    Setelah pewarna bergerak sampai bagian ujung gel, gel dikeluarkan dan

dilihat dengan sinar UV.

Information 3

1.4 TEKNIK ELEKTROFORESISMerujuk kepada migrasi pelarut atau partikel yang bercas dalam media cecair di bawah pengaruh medan elektrik. Iontoforesis merujuk kepada migrasi ion kecil. Zon elektroforesis merujuk kepada migrasi makromolekul bercas dalam media sokongan yang poros seperti kertas, selulosa, asetat, atau film gel agaros.

PRINSIP ELEKTROFORESISA. Pemisahan makromolekul bergantung kepada dua ciri iaitu berat dan cas.

B. Aliran elektrik dari elektrod akan menolak molekul manakala elektrod yang lagi satu akan menariknya pada masa yang sama.C. Molekul akan bergerak antara liang yang terbina antara jalinan matriks yang bertindak sebagai penapis yang akan memisahkan molekul berdasarkan saiz.D. Pergerakan partikel bercas yang dipengaruhi oleh aliran elektrik.E. Adalah kaedah untuk memisahkan makromolekul seperti asid nukleik dan protein berdasarkan saiz , cas , elektrik dan cirri fizikal (ketumpatan) dan lain – lain.F. Pemisahan dibantu oleh matriks seperti polioakrilamid atau agaros.G. Elektroforesis gel agaros iaitu matriks yang sering digunakan untuk memisahkan asid nukleik adalah agaros atau poliakrilamid.Sampel mengandungi DNA akan dimasukkan ke dalam telaga yang letaknya berdekatan dengan elektrod bercas negative.DNA yang bercas negative akan ditarik kea rah elektrod positif.

LIMITASI ALAT· Aliran dari elektrod akan menolak molekul manakala elektrod yang lagi satu akan menariknya pada masa yang sama.· Molekul akan bergerak antara liang yang terbina antara jalinan matriks yang bertindak sebagai penapis yang akan memisahkan molekul berdasarkan saiz.· Aliran elektrik akan memaksa makromolekul antara liang.

· Pergerakan makromolekul bergantung kepada kekuatan medan elektrik,saiz,dan bentuk molekul,sifat hidrofobik relative sampel dan kekuatan ionic serta suhu penimbal elektroforesis.· Pewarnaa akan membolehkan makromolekul kelihatan dalam bentuk siri jaluran yang terpisah.

1.5 TEKNIK IMUNOKIMIA

Prinsip :Antibodi merupakan immunoglobulin yang berupaya bergabung dengan spesifik pelbagai antigen semulajadi atau sinetik. Reagen untuk mengesan bahan kimia antigen yang dikehendaki. Imunokimia berfungsi menerangkan reaksi kimia contohnya bendasing.

Kelas utama Immunoglobulin : IgG, IgA, IgM, IgD dan IgE.

Kaedah kualitatif· Difusi gel pasif.· Immunoelektroforesis

Kaedah kuantitatif· Radial immunodiffusion and Electroimmunoassay· Turbidimetric and nephelometrc assay· Labelled immunochemical assay

Peranan imunokimia :· Antibodi adalah immunoglobulin suatu glikoprotein , dalam biokimia gen adalah DNA suatu polinukleotida.

· Interaksi antigen antibody merupakan interaksi yang dapat dianalogikan dengan interaksi enzim dengan substratnya.· Pemberian transfusi darah yang tidak sesuai akan menimbulkan hemolisis dan koagulasi.

Dua ciri utama immunoglobulin :· Kekhususan dan keankaragaman.Spesifik berkaitan dengan kemampuan Ig tertentu untuk berinteraksi dengan antigen tertentu.kerana terdapat antigen dalam jumlah yang banyak dan beraneka ragam diperlukan juga Ig dalam jumlah banyak dan beranekaragam.· Fungsi lain adalah untuk pengikatan komplemen , fasilitas , fagositosis,fiksasi pada kulit dan pengangkutan melewati barier plasenta.

KESIMPULAN

Kesimpulan bagi tugasan ini ialah teknik atau kaedah – kaedah penganalisaan biokimia mempunyai banyak kepentingan kepada manusia terutama dari segi dalam bidang perubatan. Teknik – teknik tersebut sangat penting untuk mendiagnosiskan pelbagai penyakit yang banyak wujud pada masa ini. Teknik – teknik ini juga berupaya dalam bidang penyelidikan seperti melakukan eksperimen atau menganalisiskan ke atas sesuatu jenis bakteria yang menyebabkan penyakit. Selain itu, teknik ini juga digunakan di makmal – makmal tertentu untuk tujuan memberi rawatan yang sesuai kepada pesakit. Teknik – teknik ini sememangnya penting dan mempunyai banyak kepentingan dalam bidang perubatan dan penyelidikan.

RUJUKAN

1) Delvin Thomas, Textbook of Biochemistry with Chemical Correlation 1986.2) A . L Lehinger Principles of Biochemistry 1982.3) Linne & Ringsrud’s, Clinical Laboratory Science 6TH Edition 2007.