Teknik Kimia Politeknik Negeri Malang

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Della Fajar PDinni HayyuFarid JatmikaPutri Fenny

M. Rizky AlfizRetno Sari

Tujuan PraktikumMenganalisa

sampel secara kualitatif dan

kuantitatif dengan HPLC

Mempelajari cara kerja alat

HPLC

Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (stationary) dan fase bergerak (mobile).

Kromatografi

Fase diamPadat

Cair

Fase gerakCair

Gas

Kromatografi cair berperforma tinggi (high performance liquid chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fase cair dan zat padatnya merupakan fase diam (stasioner).

HPLC

Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif).

Analisa kualitatif bertujuan untuk mengetahui informasi tentang identitas kimia dari analat dalam suatu sample. Sedangkan analisa kuantitaif untuk mengetahui jumlah dan konsentrasi analat tersebut dalam sample

Pompa

Katup

Kolom

Gerbang suntikDetektor

Data Prosesor

Botol penampu

ng

Komponen HPLC

Komponen-komponen HPLC

Botol penampung berjumlah 4 buah Berisi fase gerak (Aquabidest dan Methanol) Berfungsi sebagai wadah pencampuran jika

memang di perlukan.

Botol Penampung

Tekanan dapat mencapai 400 bar

Laju air yang dihasilkan konstan dan tidak berfluktuasi

Dapat menghasilkan laju hingga 10 ml/menit

Dapat memproduksi laju alir secara tepat

Tidak bersifat korosif

Pompadengan kriteria :

• Tangki dan piston bergerak maju mundur dilengkapi beberapa katup

Reciprocating pump

• Batang berulir dan pistonDisplacement pump

• Tangki bertekanan yang didalamnya memiliki gelembung fleksibel terbuat dari karet

Pneumatic pump

Jenis Pompa

Berfungsi mengatur komposisi pelarut yang diperlukan dan mengatur laju alir pelarut.

Katup

Terbuat dari baja tahan karat dengan permukaan yang sangat halus dan berdinding tebal. Ukurannya biasanya 4.6 mm dan panjang 25 cm.

Kolom yang digunakan saat praktikum bersifat nonpolar dari jenis C-18/RP-18

Kolom

Gerbang suntik didesain sedemikian rupa sehingga mampu membatasi jumlah analit yang masuk kolom pada volum tertentu misalnya 20 mikroliter. Jika analit yang disuntikkan melebihi dari jumlah maka sisanya akan dibuang .

Gerbang suntik

Kriteria: Mimiliki sensitivitas 0, 1 pikogram hingga 10 nanogram/detik Mampu memberikan respon linier sesuai jumlah yang terdeteksi Respon harus lebih cepat dan tidak tergantung pada laju alir Mudah dioperasikan Dapat mendeteksi beragam senyawa Tidak berifat destruksif

Jenis-jenisnya Spektofotometer UV, Fluorometri, Spekrofotometer Infra Merah,

Refraktometer, Konduktometer dan Spektogram massa.

Yang digunakan pada saat praktikum: Spektofotometer UV yang merupakan detektor selektif.

Detektor

Detektor

Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, maka akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap. Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV.

Untuk mengubah sinyal dari detektor menjadi data berupa angka-angka yang diperlukan misalnya waktu retensi (Rt), luas kurva, presentase luas kurva dan lainnya.

Data prosesor dapat berupa integrator atau komputer.

Data Prosesor

Berfungsi untuk membawa analit melalui kolom dan mencapai detektor yang harus memiliki syarat : Kemurnian tinggiMudah didapat dan murahTitik didih 20-50 C diatas suhu kolomViskositas rendahTidak bereaksi dengan analit dan fase diamTidak melarutkan fase diam maupun pelapisnyaSifatnya berbeda dengan analit pada detektorTidak berbahaya dari segi kebakaran dan keracunan

Fase Gerak (Mobile Phase)

Kromatografi Normal

Kromatografi Reverse

Packing materialPolar

Silica gel Silica NH2 Silica CN

Non Polar

Silica C-18Silica C-8Silica Polimer

Mobile Phase Non polar Polar

MetanolCH3CN/H2OMeOH/Buffer sol

Tipe Kromatografi HPLC

Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran karena perbedaan kekuatan interaksi anata solut-solut terhadap fasa daiam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu sehingga waktu retensi yang dicapai lebih cepat. Begitu pula sebaliknya.

Waktu retensi adalah waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak maksimum pada grafik dari senyawa itu.

A. Alat Seperangkat alat HPLC Personal komputer Alat suntik UV-VIS detektor Printer

B. Bahan Metanol Air Fenol Toluena

Alat dan Bahan

Hidupkan detektor UV-VIS 200, atur panjang gelombang 254 nm, RANGE (AUFS) pada 0,0005 RISE TIME pada 0,1 detik

Menghidupkan alat, menekan tombol on/off pada bagian belakang user sebelah kanan

Mengisi botol penampung A ; Metanol : Air (15:85) B ; Metanol : Air (85:15)

sebagai fase pembawa atau fase gerak

Skema Kerjaa. Persiapan

Hidupkan personal komputer, program windows 3,1 pilih menu Chromatography, klik HPLC, klik OK, ketik Lab. Pada user name,

ketik “1” pada password, klik OK, klik HPLC

Atur laju alir fasa pembawa pada3 ml/menit dengan menekan “FLOW” “A” “100” “ENTER”. Tekan kembali “FLOW “3”

“ENTER”

Tunggu gelembung dan fasa pembawa keluar, tekan “PUMP/STOP”. Tutup kembali kran purging

Lakukan “purging” untuk mengeluarkan gas dari saluran, dengan buka tutup HPLC, putar ke kiri (membuka) kran

purging, tekan tombol “PURGE” “D”

b. analisis

Suntikkan sampel (min. 20 mikron) pada posisi tuas “INJECT”

Lakukan kembali dengan menyuntikkan sampel dan campuran pada langkah 4-6

Mengamati signal yang tergambar daam monitor

Aur menu mulai merekam monitor, menggerakkan tuas dari INJECT ke LOAD, tekan “PUMP” dan “ENTER” (pada PC) secara serentak.

Lihat petunjuk program HPLC

Tentukan jenis dan kadar sampel setelah proses analisis selesai

Data PengamatanInject 1 (Toluen)

Inject 2 (Fenol)

Inject 3(fenol+toluen)

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

Interpretasi output dari detektor

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama karena Y lebih polar daripada X. Ini mungkin ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi kepolaran lemah, ini akan hanya memberikan puncak yang kecil.

Data Pengamatan

Waktu retensi pada 14 menit

Dari data dapat diketahui bahwa sampel yang keluar terlebih dahulu (waktu retensi 9,325) adalah fenol dan yang keluar berikutnya adalah toluena (waktu retensi 11,983). Hal tersebut dapat diperoleh dengan cara membandingkan hasil sampel dengan data inject toluena dan fenol standar. Toluena standar mempunyai peak pada Rt 12,6 menit sehingga pada data peak pada Rt 11,983 menit merupakan toluena. Sedangkan fenol standar memiliki peak pada Rt 9,500 sehingga pada peak 9,325 menit adalah fenol. Sehingga dari data sesuai dengan teori bahwa sampel yang keluar terlebih dahulu adalah sampel yang lebih polar yaitu fenol yang dilanjutkan dengan toluen karena fase diam yang digunakan adalah nonpolar.

Dari data juga dapat diperoleh bahwa jumlah Fenol lebih besar dibandingkan jumlah toluena pada sampel hal tersebut diketahui dari % area Fenol sebesar 48,160 % dan % area Toluen sebesar 20 %. Dan sisa persentasi lainnya yang dapat dilihat dari peak-peak kecil yang muncul merupakan pengotor yang mengontaminasi campuran, yang diakibatkan sample campuran dipakai berulang-ulang untuk berbagai kelompok,juga syringe yang dipakai secara bergantian.

1. HPLC (High Performance Liquid Kromatografi) merupakan suatu metode Kromatografi cair-cair berdasarkan tingkat kepolaran

2. Senyawa yang sifatnya sama dengan kolomnya maka interaksinya lebih kuat sehingga lebih lama di kolom, sebaliknya senyawa atau komponen yang sifatnya berbeda dengan fasa diamnya akan lebih cepat keluar dari kolom karena interaksi antara sampel dengan fasa diam

3. Senyawa yang keluar terlebih dahulu (Waktu retensinya lebih pendek) adalah Fenol dengan Rt 9,326 yang lebih polar dibandingkan Toluena dengan Rt 11,983 karena kolom yang digunakan adalah kolom nonpolar

4. Konsentrasi Fenol lebih besar dibandingkan dengan konsentrasi toluena dalam sampel hal ini dapat diketahui dari % area masing-masing peak komponen dengan Fenol 48% dan Toluen 20 %..

Kesimpulan

Terimakasih