Host Cell yang Digunakan dalam Kloning, Khususnya E-coli yang Digunakan dalam

Kloning Gen Apoptin

Oleh: Muslimah / 1106017622 / Teknologi Bioproses

Host cell merupakan tempat dimana gen atau plasmid rekombinan yang akan

diperbanyak dalam kloning ditempatkan. Sel ini juga menjadi agen yang akan memperbanyak

hasil kloning melalui proses perkembangbiakannya. Terdapat bermacam-macam sel yang

dapat dijadikan sebagai host cell dalam kloning, diantaranya adalah sel bakteri, yeast, sel

mamalia, tumbuhan, dan serangga. Namun kali ini akan lebih banyak dibahas host cell dari

E-coli terutama untuk kloning gen apoptin.

Terdapat beberapa karakteristik host cell yang diinginkan dalam kloning, diantaranya

berdasarkan:

1. Efficient Transformation

Host yang digunakan diharapkan memiliki kemampuan memasukkan plasmid atau DNA

ke dalam selnya dengan cepat dan tidak mudah terdegradasi. Oleh karena itu host yang

digunakan biasanya telah mengalami mutasi deoR untuk mempercepat penyerapan DNA

dari luar serta memiliki gen hsdM yang berfungsi mensintesis Metilase untuk mencegah

degradasi DNA.

2. Stable maintenance of plasmid

Plasmid yang telah berhasil masuk ke dalam sel dan tidak dipotong oleh enzim restriksi

masih dapat mengalami masalah dalam proses replikasi. Plasmid ini dapat mengalami

delesi maupun inversi. Untuk menjaga kestabilan dari plasmid biasanya digunakan 3

sistem rekombinan, menggunakan produk dari gen recBCD, recE, dan recF.

3. Disablement

Sel yang dijadikan sebagai host diharapkan dapat ditekan kemampuan hidupnya di alam

luar sehingga dapat meminimalisir pencemaran akibat sel yang terlepas dari laboratorium.

oleh karena itu, host yang digunakan harus membawa sifat mutasi yang menurunkan

kemampuan hidupnya di alam liar.

4. Features allowing use of the LacZ’minigene

Seperti marker yang menandakan bahwa host yang tumbuh hanyalah host yang membawa

plasmid F. Plasmid F ini merupakan plasmid pengkode lacZ.

5. Other markers

Selain itu, masih banyak jenis penanda yang dapat digunakan. Penanda ini penting untuk

memisahkan target yang diinginkan dengan host lain yang gagal dalam proses kloning.

Penanda ini dapat berupa genotip yang menunjukkan sifat tertentu, misal resisten terhadap

antibiotik, dan lain-lain. Diantara jenis-jenis genotip tersebuat adalah endA1, hsdR17,

supE44, thi-1, recA1 gyrA (nalR), relA1, ∆(lacZYA-argF), U169, θ80lacZDM15.

Jenis sel yang dapat digunakan sebagai host dalam kloning juga bermacam-macam,

ada bakteri, yeast, sel mamalia, tumbuhan, dan serangga. Namun kali ini hanya akan diulas

satu jenis host yaitu E-coli.

Escherichia coli merupakan bakteri berbentuk batang dengan panjang sekitar 2

micrometer dan diameter 0.5 micrometer. Bakteri ini umumnya hidup pada rentang 20- 400C,

optimum pada 370. E. coli ditemukan pertama kali oleh Theodore Eschetrch pada tahun 1885,

dan hingga kini bakteri ini menjadi salah satu tulang punggung dunia bioteknologi. Hapir

semua rekayasa genetika di dunia bioteknologi selalu melibatkan E.coli, termasuk dalam

proses kloning.

Pemilihan penggunaan E-coli sebagai host dalam kloning diantaranya didasarkan pada

beberapa alasan, yaitu:

1. Genetik yang sederhana

Bakteri memiliki materi genetic yang lebih sederhana dibandingkan eukariotik.

Misalnya pada E. coli  terdapat sekitar 4.400 gen sedangkan pada manusia sekitar

30.000 gen. Selain itu, bakteri, termasuk E.coli, tinggal seumur hidup mereka dalam

keadaan haploid, tanpa alel kedua untuk menutupi efek mutasi pada rekayasa

protein percobaan.

2. Laju Pertumbuhan

Bakteri biasanya tumbuh lebih cepat dibandingkan organisme yang lebih

kompleks. Misalnya E. coli yang dapat tumbuh pesat pada tingkat satu generasi per dua

puluh menit. Dengan kemampuan pertumbuhan dan replikasi yang cepat

memungkinkan dihasilkan produk dengan lebih cepat.

3. Keselamatan

E. coli secara alami ditemukan di saluran usus manusia dan hewan di mana ia

membantu memberikan nutrisi (vitamin K dan B12) ke host-nya. Dengan demikian

penggunaan E-coli sebagai host dalam kloning untuk memproduksi suatu jenis protein

yang akan digunakan oleh manusia atau makhluk hidup lain menjadi relatif aman.

4. Kemampuan untuk host DNA asing

E-coli juga memiliki kemampuan mutasi yang relatif lebih cepat, sehingga lebih mudah

dibuat menjadi sel kompeten dalam kloning. Selain itu E-coli mudah mengalami

transduksi serta perubahan plasmid dan vektor, sehingga mudah dimanipulasi untuk

dapat menerima gen asing dari luar.

5. Mudah dikultivasi dalam berbagai medium

E-coli relatif mudah untuk dikultivasi pada berbagai jenis medium, sehingga pemilihan

dan penggunaan medium relatif tidak mempersulit kegiatan kloning.

Namun penggunaan E.coli sebagai host cell juga memiliki kelemahan, diantaranya:

1. Sinyal transkripsi dan translasi spesies lain tidak dikenali dengan baik oleh inang

E.coli, sehingga ekspresi gen-gen heterolog di E.coli lemah.

2. Masalah serius pada ekspresi protein rekombinan pada E.coli, yaitu degradasi protein

produk secara cepat dan seringkali protein rekombinan justru terakumulasi dan

membentuk agregat kompak, yang bersifat inaktif tidak larut (sehingga menghambat

proses purifikasi), yang disebut dengan badan inklusi (inclusion bodies).

3. Efek dari penggumpalan menyebabkan protein menjadi tidak aktif. Hal ini terjadi

karena keterbatasan E.coli dalam membentuk struktur tiga dimensi protein secara benar

dalam proses pelipatan pasca translasi.

E.coli memiliki banyak strain yang dapat digunakan dalam tahapan rekayasa genetika.

Setiap strain memiliki tingkat efisiensi transformasi yang berbeda-beda dan kemampuan

untuk mengekspresikan gen pengkode yang terdapat pada pUC19.

Tabel 1. Protein Expression Strain Properties

(Sumber. Anonim. 2000. Competent Cell Clining and Protein Expression. New England Biolabs Inc.

http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/pdf/brochures/CompetentCell.pdf/. Diakses pada 03 Oktober

2013 pukul 21:17)

Untuk kloning gen apoptin, hots cell yang dapat digunakan salah satunya adalah

E.coli BL21(DE3). Selain memiliki tingkat efisiensi transformasi yang cenderung lebih

tinggi, Strain BL21(DE3) memiliki gen λDE3 pengkode T7 RNA polimerase yang dapat

mengekspresikan gen target pada vektor ekspresi dengan induksi IPTG (Isopropil

thiogalaktosida). Induksi dari T7 RNA polimerase pada E.coli BL21 (DE3) akan mensintesis

mRNA dalam jumlah yang tinggi. Dan pada sebagian besar penelitian, akumulasi protein

heterologus dalam jumlah tinggi juga dapat diperoleh. Strain tersebut juga memiliki mutasi

Ion dan OmpT protease sehingga dapat meminimalisir degradasi protein rekombinan yang

terekspresi.

Selain itu, sel inang yang digunakan dalam hal ini E.coli BL21(DE3), adalah bakteri

yang diperoleh pada tahap logaritmik (log phase) karena pada tahap ini masih ada

kesempatan bagi sel inang untuk membelah dan memperbanyak diri sehingga ada peluang

bagi plasmid yang diperoleh menjadi lebih banyak sebelum disebar pada media.

Pembuatan bakteri kompeten

Sebelum dilakukan proses transformasi, terlebih dahulu E.coli BL21(DE3) harus

dibuat kompeten. Keadaan kompeten adalah keadaan dimana bakteri (host cell) siap untuk

dimasukin oleh materi genetik asing. Pembuatan bakteri kompeten dilakukan dengan

penambahan larutan CaCl2, sehingga mengingkatkan kemapuannya untuk mengambil DNA.

Larutan CaCl2 dalam keadaan dingin efektif untuk memperlemah dindig sel dan

meningkatkan permeabilitasnya sehingga mudah mengikat DNA. Dinding sel yang dilindungi

oleh lipoprotein dengan plasmid yang sama-sama bermuatan negatif akan sulit untuk

menempel. Penambahan larutan CaCl2 membantu mengubah sifat permeabilitas sel.

Bakteri yang tadinya terdapat pada bagian pelet kemudian diresuspensi kembali

dengan larutan MgCl2. Mg2+ dapat menurunkan kerapatan membran. Hal ini dikarenakan

adanya interaksi antara mineral tersebut dengan bagian hidrofilik membran. Melalui hasil ini

dapat diketahui bahwa penamabahan MgCl2 berperan dalam mengganggu kestabilan

membran sel E.coli BL21(DE3).

Daftar Sumber

Anonim. 2000. Competent Cell Clining and Protein Expression. New England Biolabs Inc.

http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/pdf/brochures/CompetentCell.pdf/

Casali, Nicola. 2011. Escherichia coli Host  Strains. http://www.mfa.od.ua/page34.htm.

diakses pada 04 Oktober 2013 pukul 04.35

Howe, Christopher. 2007. Gene Cloning and Manipulation. New York: Cambridge

University Press.