High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Indah Solihah

HPLC

Merupakan teknik pemisahan senyawa dengan cara melewatkan senyawa melalui fase diam (stationary phase)

Senyawa dalam kolom tersebut akan dielusi dengan fase gerak (mobile phase)

Senyawa dalam kolom akan keluar dari kolom atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi kekuatan interaksi senya-wa dengan fase diam dan fase gerak

HPLC

Senyawa yang keluar dari kolom akan dideteksi dengan detektor yang sesuai dan dilaporkan sebagai kromatogram

Dari kromatogram dapat diidentifikasi waktu retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak

Untuk:

- analisis kualitatif digunakan informasi tR,

- analisis kuantitatif digunakan informasi luas

area/tinggi puncak kromatogram

Kualitatif vs Kuantitatif

Kegunaan HPLC :

• Pemisahan sejumlah seny.organik, anorganik, maupun seny.biologis

• Analisis ketidakmurnian (impurities)

• Analisis senyawa tdk mudah menguap (non volatile)

• Penentuan molekul2 netral, ionik, maupun zwitter ion

• Isolasi dan pemurnian senyawa

• Pemisahan seny2 yg strukturnya hampir sama

• Pemisahan seny2 dlm jml sekelumit (trace elements)

• Menetapkan kadar seny2 tertentu

Kelebihan HPLC

• HPLC dapat dipakai untuk senyawa non volatile dan senyawa berbobot molekul tinggi.

• HPLC dapat dipakai untuk senyawa anorganik yg sebagian besar non volatile.

• HPLC biasanya dilakukan pada suhu kamar sehingga aman bagi senyawa yg tidak tahan panas

• Pada HPLC kemungkinan antaraksi antara fase gerak dan analit besar sekali (mencakup antaraksi ikatan hidrogen dan reaksi ion) proses pemisahan lebih optimal

• Fase gerak pada HPLC dapat diubah dengan mencampur pelarut dalam berbagai gradient

• Dapat digunakan untuk menganalisis beberapa senyawa sekaligus (secara simultan)

Keterbatasan HPLC

• Sulit untuk mengidentifikasi senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dg spektrometer massa

• Jika sampel yang digunakan sangat kompleks, maka resolusi (pemisahan) yg baik sulit diperoleh

Tujuan Akhir HPLC

HPLC P e m i s a h a n

Resolusi

• Tingkat pemisahan komponen dalam suatu campuran dengan metode kromatografi direfleksikan dalam kromatogram yang dihasilkan

• Untuk hasil pemisahan yang baik, puncak-puncak dalam kromatogram harus terpisah secara sempurna dari puncak lainnya dengan sedikit tumpang tindih (overlap) atau tidak tumpang tindih

Resolusi

Ukuran Daya Pisah

Resolusi

Instrumentasi HPLC

Komponen instrumen HPLC :

1. Wadah fase gerak

2. Sistem penghantaran fase gerak = Pompa

3. Alat utk memasukkan sampel

4. Kolom

5. Detektor

6. Wadah penampung buangan fase gerak

7. Tabung penghubung

8. Suatu komputer atau integrator atau perekam

Wadah Fase gerak

• Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert).

• Contoh wadah fase gerak yg biasa digunakan mis.wadah pelarut kosong atau labu laboratorium dg kapasitas 1-2L

Fase gerak

• Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.

• Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel.

• Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.

• Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

18 HPLC-2011

Normal-Phase HPLC [ Fase diam lebih polar dibanding fase gerak ]

Senyawa polar:

- terelusi belakangan (tR panjang)

- semakin non-polar fase gerak,

tR senyawa polar makin panjang

Solven:

- campuran metilen klorid, dietileter, kloroform

Eluent strength:

- dimodifikasi dengan n-heksan

19 HPLC-2011

Reversed-Phase HPLC

Senyawa polar:

- terelusi lebih dahulu

Semakin polar fase gerak, senyawa non-polar

lebih kuat tertahan

Solvent: Campuran metanol, asetonitril, tetra-

hidrofuran

Eluent strength:

- dimodifikasi dengan air (Kellner dkk., 1998)

Reversed-Phase HPLC [ Fase diam lebih nonpolar dibanding fase gerak ]

Kriteria pemilihan fase gerak

• Viskositas rendah

• Transparansi terhadap UV; jika detektor UV yg digunakan

• Perbedaan indeks bias antara fase gerak dg sampel harus besar; jika digunakan detektor indeks bias

• Titik didih rendah

• Kemurnian tinggi

• Inert

• Tidak toksis

• Harga

Pelarut UV cut off (nm)

n-heksana 195

Sikloheksana 200

Tetraklorometan 265

Metilbenzen 285

Triklorometan 245

Diklorometan 230

Tetrahidrofuran 212

Propanon 330

Asetonitril 190

Iso-propanol 205

Etanol 205

Metanol 205

Asam etanoat 255

Air 170

Sem

akin

Po

lar

• Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril.

• Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorinasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol, dietileter, atau kloroform.

• Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.

• Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi)

Catatan

• Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas)

• Pelarut yg digunakan harus dg kemurnian tinggi (HPLC grade)

Pompa • Syarat Pompa HPLC: inert terhadap fase gerak.

• Bahan yang umum dipakai adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam.

• Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, 20 mL/menit.

• Tujuan penggunaan pompa adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan.

• Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan.

• Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.

Alat untuk memasukkan sampel

• Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.

Rheodyne Loop Injector

Parameter Kolom Konvensional Kolom Mikrobor

Tabung Kolom

Stanless steel P = 3,10,15,20, dan 25 cm o.d = 0,25 inci i.d = 4,6mm

Stanless steel P = 25 dan 50 cm o.d = 0,25 inci i.d = 1 atau 2 mm

Tek. Operasional 500-3000 psi (35-215 bar) 1000-5000 psi (70-350 bar)

Fase Gerak

NP : hidrokarbon+pelarut2 terklorinasi atau alkohol . RP : metanol atau asetonitril + air atau buffer Kec.Alir : 1-3mL/menit

NP : hidrokarbon+pelarut2 terklorinasi atau alkohol . RP : metanol atau asetonitril + air atau buffer Kec.Alir : 10-100µL/menit Modifikasi Instrumen : Aliran < 10µL/menit. Katup injeksi sampel dan sel detektor bervolume kecil

Kinerja

Efisiensi meningkat dg berkurangnya uk.partikel fase diam, akan tetapi umur kolom dg ukuran partikel 3µm lbh pendek

Sangat efisien dan sensitif, akan tetapi lambat. Konsumsi fase gerak hanya ¼ dari kolom konvensional

Kolom

• Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.

• Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:

1. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).

2. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

• Dalam prakteknya, kolom mikrobor tidak setahan kolom kovensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin

Bagaimana memilih kolom???

Untuk memilih kolom (fase diam),

perhatikan beberapa sifat senyawa seperti:

- kelarutan

- kepolaran

Dengan memperhatikan sifat-sifat tersebut,

kolom dapat dipilih dengan petunjuk berikut

ini

Kolom Fase Diam HPLC

Particle Size

Beda Ukuran Partikel

Kolom

• Performance kolom menurun seiring

dengan lamanya waktu penggunaan,

yang ditandai dengan peningkatan

“backpressure” dan lebar puncak

kromatogram

Pengoperasian Kolom

Untuk kolom “Reversed-Phase” [C8, C18, fenil, dll], gunakan petunjuk berikut:

- simpan kolom dalam asetonitril atau metanol

atau campuran air dan pelarut organik

- jangan mengoperasikan kolom melebihi pH

yang diperbolehkan (untuk kolom berbasis

silika, disarankan pH 2,5 – 8).

pH > 8 silika terlarut

pH < 2 bonded silika terhidrolisis

Pengoperasian Kolom

Selalu flush (aliri) kolom dengan pelarut

kuat (strong solvent) seperti metanol

sebelum digunakan untuk mengeliminasi

setiap analit yang tertahan kuat

Jangan pernah biarkan komponen bufer

tertinggal dalam pompa atau kolom,

karena komponen bufer dapat

mengendap dan menimbulkan kerusakan

Pencucian Kolom

Bersihkan kolom dengan solven yang kuat.

- Untuk kolom Reversed-phase:

gunakan campuran 96% diklorometan dan 4%

metanol dengan 0,1% amonium hidroksida

- Untuk kolom Normal-phase:

gunakan metanol

Pada keadaan yang sulit:

- lakukan “back-flushing” kolom dengan kece-

patan alir rendah [ bila diperbolehkan !!! ]

46 HPLC-2011

Teknik Elusi

Isokratik: - teknik elusi menggunakan komposisi fase

gerak tetap (polaritas tetap) selama proses

kromatografi berlangsung

Gradien: - teknik elusi menggunakan komposisi fase

gerak yang berubah-ubah (polaritas berubah)

selama proses kromatografi berlangsung

47 HPLC-2011

Teknik Isokratik

48 HPLC-2011

Eluen= campuran A + B

50 % B

40 % B

49 HPLC-2011

30 % B

35 % B

50 HPLC-2011

Teknik Gradien

Dengan mendasarkan data pada teknik isokratik di atas,

kemudian dilakukan

teknik elusi gradien

51 HPLC-2011

Hasilnya