High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Kromatografi merupakan teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas). Fase diam berupa zat padat yang aktif, dikenal istilah kromatografi penyerapan(adsorption chromatography). Sedangkan fase diam berupa zat cair, teknik ini disebut kromatografi pembagian(partition chromatography).Berdasarkan fase gerak yang digunakan, kromatografi dibedakan menjadi dua golongan besar yaitugas chromatographydanliquid chromatography. Kromatografi Gas (gas chromatography) adalah proses pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya dengan menggunakan gas sebagai fase bergerak yang melewati suatu lapisan serapan (sorben) yang diam. Sedangkan pada kromatografi cair menggunakan fase gerak cairan.High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau biasa disebut Kromatografi Cair Tingkat Tinggi (KCKT) adalah salah satu metode analisis terbaru dalam pemisahan senyawa pada sampel uji. Jenis kromatografi ini memiliki beberapa kelebihan dibandingkan dengan kromatografi yang lain.

Penulisan ini bertujuan untuk mengetahui teknik pemisahan senyawa dengan menggunakan Kromatografi Cair Tingkat Tinggi (KCKT).

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara fase gerak yang bisa berupa gas ataupun cairan dan fase diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan.High Performance Liquid Chromatography(HPLC) atau kromatografi cair penampilan tinggi atauHigh Performance= tekanan atau kinerja tinggi ,High Speed= kecepatan tinggi, danModern= moderen berhasil dikembangkan saat ini.Kromatografi Cair Kinerja Tinggi merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fase diam.

Prinsip Kerja Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Dengan bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detector. Kemudian cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Oleh karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fase diam, solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fase diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Pada kromatogram, jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem KCKT dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran KCKT.

Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Beberapa alat yang menyusun Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, antara lain:1)Wadah fase gerak dan fase gerakWadah fase gerak harus bersih dan lembap (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.2)PompaPompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan.Ada 2 jenis pompa dalam KCKT yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.

3)Tempat Injeksi Sampel.Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.4)KolomAda 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian KCKT yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 l/menit).Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.5)DetektorDetektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detector fluoresensi, dan elektrokimia.Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil.3. Stabil dalam pengopersiannya.4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.6)Rekorder Rekorder merupakan alat perekam dari deteksi pemisahan senyawa sampel uji oleh detector, dimana hasil perekaman dalam bentuk kromatogram.Cara Kerja dari KCKT ini sebagai berikut:1)Mula-mula solven diambil melalui pompa.2)Solven ini kemudian masuk ke dalam katupinjeksiberbutar, yang dipasang tepat padasampel loop.3)Sampel dimasukan ke dalam sampel loop yangkemudian bersama-sama dengan solven masukkedalam kolom.4)Hasil pemisahan dideteksi olehdetektor, yang penampakannya ditunjukan oleh perekam (pencatat = recorder).

Skema Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kelebihan dan Kekurangan KCKT

Kelebihan KCKT ini, yaitu:1)Cepat dalam memisahkan senyawa2)Kolom dapat digunakan kembali3)Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik4)Mudah rekoveri sampelKekurangan KCKT ini, yakni:1)Memerlukan biaya yang banyak untuk proses pemisahannya2)Memerlukan orang yang trampil dalam pemisahannya

PENUTUP

HPLC adalah singkatan dari High Performance Liquid Chromatography atau yang lebih dikenal Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), yaitu alat yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam ( yaitu sebuah tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom.KCKT secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah gravitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm.