GALUR CABAI TRANSGENIK TOLERAN KEKERINGAN … filePERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI...

GALUR CABAI TRANSGENIK TOLERAN KEKERINGAN DENGAN GEN P5CS

PENYANDI ENZIM KUNCI BIOSINTESIS PROLINA: REGENERASI DAN KARAKTERISASI REGENERAN

YUSNIWATI

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2008

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi yang berjudul : “Galur Cabai

Transgenik Toleran Kekeringan dengan Gen P5CS-Penyandi Enzim Kunci

Biosintesa Prolina : Regenerasi dan Karakterisasi Regeneran” adalah karya

saya sendiri dengan arahan Komisi Pembimbing dan belum pernah diajukan

dalam bentuk apapun untuk memperoleh gelar program sejenis di perguruan

tinggi lain. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang

diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks

dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.

Bogor, November 2008

Yusniwati NRP A361040041/AGR

ABSTRACT

YUSNIWATI. Drought Tolerance Transgenic Hot Chilli Line Carrying P5CS Transgene Encoding Key Enzyme for Proline Biosynthese : Plantlet Regeneration and Characterization. Supervisors Committee : SUDARSONO, HAJRIAL ASWIDINNOOR, SRI HENDRASTUTI HIDAYAT, dan DJOKO SANTOSO.

The objectives of this experiments were to evaluate effects of drought stress at vegetative stage on growth, yield and leaf proline content of hot pepper. Drought stress was conditioned by watering plants every five days during the period of 21 – 54 days after planting (DAP). Results of the experiment indicated that drought stress reduced plant height, branch numbers, stem diameter, root length, shoot, root and biomass dry weight and fruit yield. Sensivity index calculated based on biomass of five hot pepper cultivars showed that Prabu was the only tolerance cultivar while those based on proline concentration showed that Prabu, Laris and Jati Laba were the medium tolerance to drought stress. There was no drought tolerance cultivar if the sensitivity index was calculated based on fruit yield. Genetic engineering manipulation to develop drought tolerance transgenic plant through over-expression of gene P5CS-key enzyme for proline biosinthesis is hot chilli needed regeneration of chilli by in vitro. Regeneration of Chilli by in vitro by using young leaf have been conducted to 13 varietas of chilli. Eksplant of culture at medium induce callus that is elementary medium of MS with vitamin of L2 enhanced by BAP 4 ppm and IAA 0.5 ppm. Then for medium of regeneration and elong of cell, callus subculture at medium of MS added by vitamin L2 , BAP 1 ppm, GA3 2 ppm, Calsium Pantotenat 2 ppm and AgNO3 5 ppm. The result showed that all of the varieties were able to form callus, but do not all of callus can differentiate to be new bud. Amongs of 13 of varieties of hot chilli, the most responsive to differentiation and bud elongation was Tit Super variety.

With use chilli cv. Tit Super done genetic engineering, the objectives of this experiment were to (1) regenerate of transgenic chilli cv. Tit Super constitutively expressing P5CS transgene through Agrobacterium, (2) analyze integration of P5CS transgene in the genome of transgenic chilli by total nucleic acid PCR, (3) analyze proline accumulation in leaf tissues of the transgenic chilli. There were 67 transgenic line but only 5 transgenic line were positive based on total nucleic acid PCR testing. The transgenic line also accumulate higher proline than control plant under drought stress which induced by Poly Ethylene Glicol (PEG) 15%. Over-expression of gene P5CS for key enzyme for proline biosynthesis for tobacco as model plant to drought stress at vegetatif stage showed that drought stress reduced plant height, shoot diameter, leaf dry weight and leaf area. Keyword: Dehydration stress, hot pepper, drought sensitivity index, Direct shoot

regeneration, Agrobacterium-mediated transformation, proline

SUMMARY YUSNIWATI. Drought Tolerance Transgenic Hot Chilli Line Carrying P5CS Transgene Encoding Key Enzyme for Proline Biosynthese : Plantlet Regeneration and Characterization. Supervisors Committee : SUDARSONO, HAJRIAL ASWIDINNOOR, SRI HENDRASTUTI HIDAYAT, dan DJOKO SANTOSO. Genetic engineering of chilli (Capsicum annuum L.), an important vegetable, crop is difficult to do. This was proven by the existence of only a few numbers of publication describing hot chilli genetic engineering in scientific journals. The difficulty of genetic engineering of this crop is because the in vitro bud regeneration and Agrobacterium-mediated genetic transformation of hot chilli are both difficult to do.

This disertation was written based on results of experiments conducted to determine effects of drought stress on growth and development of hot chilli, to develop drought tolerance transgenic hot chilli, and to investigate possible drought tolerance mechanisms in transgenic plants using transgenic tobacco. Therefore, there are three major experiments associated with this dissertation.

The drought stress tolerance phenotype in various crops is a dynamic response. Testing for drought tolerance response need to be conducted at various stages of plant growth (i.e. vegetative and generatives stages). Moreover, glass house test might be the better alternative of evaluation techniques for drought tolerance than that of field evaluation since environmental conditions in the glass house test was more homogeneous than that of field stations. In this research a condition of reducing the amount of supplied water to irrigate the evaluated hot chilli cultivar was used as drought stress treatment.

Result of this experiment showed that the tested hot chilli cultivars (five cultivars) were all sensitive against drought stress. Drought stress under this experiments reduced production of hot chilli by as much as 50%. Such results further supported the need to develop more drought tolerance hot chilli cultivars.

Regeneration of drought tolerance transgenic hot pepper should be possible if the effective methods for in vitro bud regeneration and Agrobacterium-mediated genetic transformation are available. Parts of this desertation research were conducted to answer those question. In this disertation effective research methods for inducing in vitro bud regeneration among chilli cultivars (13 cultivars) were evaluated. Direct shoot regeneration from young seedling associated-leaf approach was employed in this research. Result of the experiment showed that inducing in vitro bud regeneration from experiments of hot chilli cv. Tit Super was easiest.

In subsequent experiment, Agrobacterium mediated transformation was conducted to introduce P5CS transgene into hot chilli genome and regenerate transgenic hot chilli. After a numbers of phenotypic and molecular characterization of the regenerated putative transgenic shoots, the regenerated

they were evaluated for their respons against in vitro simulated drought stress using polyethylene glycol (PEG).

Result of the experiment showed 67 kanamycine resistance planlets were regenerated after Agrobacterium-mediated transformation of hot chilli, indicating that they were transgenic carrying at least nptII transgene and probably also carry the P5CS one.

The hot chilli plantlets positively identified carrying P5CS transgene showed different phenotype than that of non-transgenic control. The transgenic shoots carrying P5CS transgene showed broader leaves than that of non-transgenic one. Subsequent result also indicated, transgenic shoots identified as carrying P5CS transgene tolerance were more against PEG treatment up to 15% (w/v) concentration. They also exhibited different pattern of proline accumulation in evaluated leaves under in vitro PEG stimulated strees condition.

To answer the possible mechanisms of drought tolerance in transgenic plants carrying P5CS transgene, R2 generation of transgenic tobacco carrying P5CS transgene were evaluated under glass house conditions. The stress conditions were either applied by reducing water supplies or simulated using PEG (0, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5 and 15% (w/v).

Testing of drought stress tolerance on transgenic crops carrying P5CS transgene was conducted using R2 generation of transgenic tobacco. Drought stress treatment on R2 progeny transgenic tobacco resulted. But R2 generation of transgenic P5CS tobacco showed better performance than R2 generation of non- transgenic tobacco. The high increased of proline content was seen on the tested transgenic tobacco. It proved that increasing of proline accumulation caused by over-expression of P5CS gen reduced negative effect of drought stress. Crop age also influence accumulation of praline. Progressively increase of age may increased leaf praline accumulation.

Drought stress treatment using PEG at 2.5% to 15% concentrations caused decrease of growth. Higher accumulation of proline occured early in root, followed by in the leaf tissue. The higher accumulation of proline in transgenic tobacco probably have a role in decreasing of negative effect to drought stress.

RINGKASAN

YUSNIWATI. Galur Cabai Transgenik Toleran Kekeringan dengan Gen P5CS- Penyandi Enzim Kunci Biosintesa Prolina : Regenerasi dan Karakterisasi Regeneran. Komisi Pembimbing: SUDARSONO, HAJRIAL ASWIDINNOOR, SRI HENDRASTUTI HIDAYAT, dan DJOKO SANTOSO. Tanaman cabai merah (Capsicum annuum L.) adalah tanaman sayuran penting dan teknik rekayasa genetika pada cabai sulit dilakukan. Hal ini terbukti dari sedikitnya publikasi tentang rekayasa genetika cabai merah di jurnal ilmiah. Rekayasa genetika pada cabai merah sulit dilakukan karena sulitnya meregenerasikan tunas cabai secara in vitro serta sulitnya meregenerasikan eksplan hasil inokulasi Agrobacterium.

Disertasi ini ditulis berdasarkan hasil-hasil percobaan untuk menentukan pengaruh dari cekaman kekeringan terhadap pertumbuhan dan perkembangan cabai, mengembangkan tanaman cabai transgenik yang toleran kekeringan serta menentukan mekanisme tanggapan cekaman kekeringan pada tanaman transgenik menggunakan tanaman tembakau transgenik. Dengan demikian ada tiga kelompok besar percobaan dalam disertasi ini.

Respon dari berbagai genotipe tanaman terhadap cekaman kekeringan bersifat dinamis, sehingga pengujian tingkat toleransi terhadap cekaman kekeringan perlu dilakukan pada berbagai tingkat pertumbuhan tanaman (fase vegetatif dan generatif). Selain itu pengujian toleransi terhadap cekaman kekeringan di rumah kaca perlu dilakukan, karena kondisi di rumah kaca lebih baik dibandingkan di lapangan serta kondisi di rumah kaca lebih homogen di bandingkan lapangan. Evaluasi cekaman kekeringan pada cabai dilakukan dengan pengurangan pemberian air.

Hasil penelitian pengujian cekaman kekeringan terhadap lima kultivar cabai unggul nasional menunjukkan tidak satupun dari ke lima kultivar yang diuji toleran terhadap cekaman kekeringan, cekaman kekeringan yang diberikan menurunkan hasil sampai 50%. Hal tersebut memperkuat alasan perlunya pengembangan kultivar cabai yang toleran kekeringan

Pengembangan cabai transgenik yang toleran cekaman kekeringan dapat dilakukan jika metode regenerasi tunas cabai secara in vitro dan metode transformasi genetika dengan bantuan Agrobacterium telah tersedia. Sebahagian dari penulisan disertasi ini digunakan untuk menjawab pertanyaan tersebut. Dalam disertasi ini dievaluasi metode in vitro yang efektif untuk meregenerasikan 13 genotipe cabai. Regenerasi tunas langsung dilakukan dengan menggunakan daun kecambah cabai. Hasil percobaan menunjukkan bahwa kultivar Tit Super yang paling mampu menghasilkan regenerasi tunas secara in vitro paling banyak

Pada percobaan selanjutnya dilakukan transformasi genetika dengan menggunakan Agrobacterium untuk memasukkan gen P5CS ke dalam genom cabai dan meregenerasikan cabai transgenik. Setelah itu dilakukan karakterisasi

fenotipe secara molekuler dari calon tunas transgenik yang dihasilkan kemudian dievaluasi responnya terhadap kondisi cekaman kekeringan yang disimulasikan secara in vitro dengan menggunakan PEG.

Hasil percobaan menunjukkan 67 planlet yang resisten kanamysin berhasil diregenerasikan setelah transformasi dengan menggunakan Agrobacterium yang mengindikasikan bahwa planlet tersebut merupakan planlet transgenik yang membawa gen nptII dan kemungkinan juga membawa gen P5CS.

Planlet cabai yang teridentifikasi secara positif sebagai pembawa gen P5CS menunjukkan fenotipe yang berbeda dibandingkan dengan tanaman kontrol non transgenik. Tunas cabai transgenik yang membawa gen P5CS menunjukkan daun yang lebih lebar dibandingkan dengan daun yang non transgenik. Hasil selanjutnya juga mengindikasikan bahwa tunas transgenik yang membawa gen P5CS lebih toleran terhadap perlakuan PEG pada konsentrasi 15% (w/v). Tunas transgenik juga menunjukkan pola yang berbeda pada akumulasi prolina daun.

Pengujian mekanisme cekaman kekeringan dilakukan pada tanaman tembakau transgenik generasi R2 yang membawa gen P5CS di rumah kaca Kondisi cekaman kekeringan disimulasikan dengan pengurangan pemberian air dan penyiraman dengan PEG (0, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15% w/v).

Hasil penelitian menunjukkan bahwa cekaman kekeringan menghambat pertumbuhan semua tanaman tembakau R2 (tembakau transgenik dan non transgenik), tetapi generasi R2 transgenik memperlihatkan penampilan yang lebih baik dibandingkan tanaman tembakau non transgenik. Tanaman tembakau transgenik R2 juga menunjukkan pola akumulasi prolina yan berbeda pada daun yang diuji. Umur tanaman juga mempengaruhi akumulasi prolina dimana dengan semakin bertambahnya umur tanaman akumulasi prolina juga semakin meningkat.

Perlakuan cekaman kekeringan dengan penyiraman larutan PEG pada konsentrasi 5% sampai 15%, menunjukkan penurunan pertumbuhan. Akumulasi prolina yang terjadi awalnya lebih tinggi di akar, tetapi kemudian produksi prolina yang tinggi terjadi di jaringan daun. Peningkatan kandungan prolina yang lebih tinggi pada tanaman tembakau transgenik diduga berperan dalam mengurangi dampak negatif terhadap cekaman kekeringan.

© Hak cipta milik IPB, tahun 2008 Hak cipta dilindungi

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan

atau menyebutkan sumber

a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tujuan suatu masalah

b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB

2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya

tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

GALUR CABAI TRANSGENIK TOLERAN KEKERINGAN DENGAN GEN P5CS-PENYANDI ENZIM KUNCI

BIOSINTESIS PROLINA : REGENERASI DAN KARAKTERISASI REGENERAN

YUSNIWATI

Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor

pada Departemen Agronomi dan Hortikultura

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2008

Judul Disertasi : Galur Cabai Transgenik Toleran Kekeringan dengan Gen P5CS-Penyandi Enzim Kunci Biosintesis Prolina: Regenerasi dan Karakterisasi Regeneran

Nama Mahasiswa : Yusniwati

NRP : A. 361040041

Disetujui Komisi Pembimbing

Prof Dr Ir Sudarsono, MSc

Ketua

Dr Ir Hajrial Aswidinnoor, MSc Anggota

Dr Ir Sri Hendrastuti Hidayat, MSc

Anggota

Dr Ir Djoko Santoso, APU Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Agronomi Dekan Sekolah Pascasarjana IPB Dr Ir Munif Ghulamahdi, MS Prof Dr Ir Khairil Anwar Notodiputro, MS

Tanggal Ujian : 30 Oktober 2008 Tanggal Lulus : 19 November 2008

PRAKATA

Alhamdulillahirabbil ‘alamin, puji syukur yang sangat dalam penulis

sampaikan kepada Allah SWT atas izin dan petunjuk-Nya yang Maha Rahman

dan Rahim yang telah dilimpahkan kepada penulis sehingga penelitian dan

penulisan Disertasi ini dapat diselesaikan. Disertasi ini merupakan salah satu

syarat untuk mendapatkan gelar doktor dari Institut Pertanian Bogor.

Disertasi ini yang berjudul “Galur Cabai Transgenik Toleran

Kekeringan dengan Gen P5CS-Penyandi Enzim Kunci Biosintesa Prolina:

Regenerasi dan Karakterisasi Regeneran”, disusun berdasarkan penelitian yang

dilakukan di Laboratorium Molekuler Tanaman Institut Pertanian Bogor dan

Rumah Kaca Balitbio Cimanggu Bogor.

Penelitian dan penulisan disertasi ini dapat diselesaikan karena peran dan

bantuan berbagai pihak. Oleh karena ini pada kesempatan ini penulis sampaikan

terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: Bapak Prof Dr Ir Sudarsono, MSc,

selaku Ketua Komisi Pembimbing, yang telah memberikan bimbingan intensif

dalam pelaksanaan penelitian, analisis data, penulisan publikasi, penulisan naskah

disertasi dan telah memberikan kesempatan dan fasilitas seluas-luasnya, serta

yang begitu sabar secara terus menerus memberikan perhatian dan wawasan baru.

Kepada Bapak Dr Ir Hajrial Aswidinnoor, MSc, Ibu Dr Ir Sri Hendrastuti Hidayat,

MSc dan Bapak Dr Ir Djoko Santoso, MSc sebagai Anggota Komisi Pembimbing;

yang telah memberikan bimbingan, arahan, dorongan moril dan semangat, kritik

serta saran yang sangat bermanfaat dalam penulisan disertasi ini. Penulis juga

tidak lupa menyampaikan ucapan terimakasih kepada Bapak Dr Ir Asep

Setiawan, M,Sc, selaku penguji luar komisi pada ujian prakulifikasi program

Doktor. Ucapan terimakasih juga disampaikan kepada Bapak Dr Ir Agus Purwito,

M.Sc selaku penguji luar komisi pada ujian tertutup, juga untuk Prof Dr Ir

Nurhajati A Mattjik MS dan Dr Ir Ika Mariska, APU selaku penguji luar komisi

pada Ujian Terbuka. Ucapan terimakasih juga disampaikan kepada ketua

Program Studi, seluruh staf pengajar dan pegawai, Departemen Agronomi dan

Hortikultura, SPs IPB, kepada Rektor, Dekan Fakultas Pertanian, dan Ketua

Jurusan Budidaya Pertanian, Ketua Program studi Pemuliaan Tanaman dan

kepada seluruh staf pengajar dan pegawai jurusan Budidaya Pertanian Universitas

Andalas Padang, atas izin, dukungan dan motivasi serta doa yang diberikan.

Kepada Pimpinan Proyek BPPS Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi

Departemen Pendidikan Nasional dan Yayasan DAMANDIRI yang telah

memberi kesempatan beasiswa.

Dengan segenap rasa hormat dan terima kasih khusus penulis sampaikan

kepada Ibunda tercinta Majiar dan Ayahanda tercinta Bismi Tk. Marajo, semua

Kakak, Kakak Ipar, Adik dan Adik Ipar serta ponakan yang telah melimpahkan

bantuan, kasih sayang, bimbingan, dan do’a yang tulus.

Terima kasih secara khusus disampaikan kepada Uda Apri Yendi, SPt, atas

motivasi dan do’anya.

Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada rekan-rekan mahasiswa dan

staf teknisi di Laboratorium Molekuler Tanaman yang selama ini banyak

membantu dalam pelaksanaan penelitian yaitu: Bapak Dr Ir Ahmad Riduan, MSi

Ibu Dr Ir Endang Puji Hartati,MSi, Ibu Dr Ir Enni S. Rahayu,Msi, Dr Ir Desta

Wirnas, MSi, Dr Susiyanti, SP.MP, Ibu Munarti, SP,MSi, Ibu Yuliasti, SP. M.Si,

Bapak Ir. Syamsudin, MSi, Ibu Ir Lollie Agustina P Putri, MSi, Ibu Ir. Sukendah,

M.Sc, Ibu Ir Reni, MSi, Darmawan S, SP.MSi, Zulherman S, SP, Susilawati, Mas

Agus, dan Pak Juanda yang banyak membantu dalam penyelesaian penelitian serta

semua anggota IMPACS (Ikatan Mahasiswa Pascasarjana Sumatera Barat) dan

rekan-rekan di pondokan Ponytail atas bantuan dan persahabatan dan semua pihak

yang tidak dapat disebutkan satu persatu dalam tulisan ini.

Akhirnya dengan segala kerendahan hati penulis berharap agar hasil

penelitian ini dapat digunakan untuk kepentingan penelitian, kemajuan ilmu

pengetahuan dan bermanfaat bagi kehidupan. Amin.

Bogor, November 2008 Penulis,

Yusniwati NRP A361040041

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bukittinggi pada tanggal 17 Desember 1970, dari

pasangan Bapak Bismi Tk. Marajo dan Ibu Majiar sebagai putri ke tiga dari lima

bersaudara.

Pendidikan dasar diselesaikan pada tahun 1984 di SD Negeri 1 Teladan

Gadut Bukittinggi. Pendidikan menengah pertama diselesaikan pada tahun 1987

di SMP Negeri Gadut Bukittinggi. Pada tahun 1990 lulus dari SMA Negeri 3

Bukittinggi. Gelar Sarjana Pertanian diraih pada tahun 1995 pada Fakultas

Pertanian Universitas Andalas Padang. Pada tahun 2000 memperoleh gelar

Magister Pertanian dari Program Studi Agronomi, pada Program Pascasarjana

Universitas Andalas Padang, melalui Program Bea Siswa BPPS Ditjen Dikti. Pada

tahun 2004 melanjutkan studi ke program Doktor (S3) melalui program Bea Siswa

BPPS Ditjen Dikti pada program studi Agronomi Institut Pertanian Bogor. Sejak

Desember tahun 2000 sampai sekarang, penulis adalah staf pengajar pada Fakultas

Pertanian Universitas Andalas Padang.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR ISI ................................................................................................. xiii

DAFTAR TABEL ......................................................................................... xiv

DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xv

DAFTAR ISTILAH ...................................................................................... xx I PENDAHULUAN …………………………………………………….. 1 Latar belakang ………………………………..……………………… 1 Tujuan penelitian …………………………………………….…….…. 5 Garis Besar Disertasi…………………………………………………… 6 II TINJAUAN PUSTAKA ……………………………………………. 11 Tanaman Cabai…………………………………………………………. 11 Perbanyakan Tanaman Cabai Secara In Vitro ........................................ 14

Cekaman Kekeringan pada Tanaman....................................................... 16 Respon Tanaman terhadap Cekaman Kekeringan dengan Penyesuaian Osmotik .............................................................................. 18 Plasmid pBI-P5CS ………………………………………..………….. 23 Sifat-sifat Biologi Agrobacterium ……………………..……………... 24 Transfer Gen pada Genom Tanaman dengan Bantuan Agrobacterium . 25

III DAMPAK FISIOLOGIS STRES KEKERINGAN TERHADAP PERTUMBUHAN, HASIL DAN KANDUNGAN PROLINA DAUN CABAI .................................................................................................. 26 Abstrak ………………………………………………………………. 26 Abstract ………………………………………………………………. 27 Pendahuluan ………............................................................................... 28 Bahan dan Metode ……….……………………………………………. 29 Hasil …………………………………………………………..……….. 31 Pembahasan ……….…………………………………………..………. 36 Simpulan ………..……………………………………………………… 39 IV STUDI REGENERASI BEBERAPA GENOTIPE CABAI (Capsicum annum L.) SECARA IN VITRO .......................... 40 Abstrak .................................................................................................... 40 Abstract ……………………………………………………………… 41 Pendahuluan ………............................................................................... 42 Bahan dan Metode …….……………………………………….……… 43 Hasil ………………………………………………………………….. 45 Pembahasan …………………………..……………………………… 52 Simpulan ……….…..………………………………………………… 54

V. INTRODUKSI GEN P5CS KE DALAM GENOM CABAI DENGAN BANTUAN Agrobacterium DAN EKSPRESI TERHADAP CEKAMAN AKIBAT PEMBERIAN PEG ............................................................. 55

Abstrak .................................................................................................... 55 Abstract ………………………………………………………………… 56 Pendahuluan ………................................................................................ 57 Bahan dan Metode …………………………………………………… 60 Hasil ………………………………………………………………….. 64

Pembahasan ………………………..……………………………… 69 Simpulan ……….…..………………………………………………… 72 VI TOLERANSI TEMBAKAU TRANSGENIK GENERASI R2 YANG MENGEKSPRESIKAN GEN P5CS TERHADAP STRES KEKERINGAN AKIBAT PENGURANGAN PEMBERIAN AIR .. 73 Abstrak ………………………………………………………………… 73 Abstract…………………………………………………………… ....... 74 Pendahuluan ………................................................................................ 75 Bahan dan Metode …….……………………………………………… 76 Hasil ………………………………………………………………….. 78 Pembahasan …………………………..……………………………… 89 Simpulan ……….…..………………………………………………… 91 VII TOLERANSI TEMBAKAU TRANSGENIK GENERASI R2 YANG

MENGEKSPRESIKAN GEN P5CS TERHADAP STRES AKIBAT PENYIRAMAN POLIETILEN GLIKOL (PEG) ............................... 92

Abstrak………………………………………………………… ............ 92 Abstract ……………………………………………………………… 93 Pendahuluan ………............................................................................... 94 Bahan dan Metode …….……………………………………………… 97 Hasil ………………………………………………………………….. 97 Pembahasan …………………………..……………………………… 102 Simpulan ……….…..………………………………………………… 102 VIII PEMBAHASAN UMUM ...................................................................... 104 IX SIMPULAN DAN SARAN UMUM .................................................... 109 DAFTAR PUSTAKA ………………….…………………………………. 110

DAFTAR TABEL

Nomor J u d u l Halaman

1 Pengaruh cekaman kekeringan pada periode 21 – 54 hari setelah tanam terhadap tinggi tanaman, jumlah cabang, diameter batang, dan panjang akar beberapa genotipe cabai........................

32

2 Pengaruh cekaman kekeringan pada periode 21 – 54 hari setelah

tanam terhadap berat kering batang dan biomasa total beberapa genotipe abai.................................................................................

33

3 Pengaruh cekaman kekeringan pada periode 21 – 54 hari sesudah

tanam terhadap bobot biomassa total, jumlah dan bobot buah per tanaman beberapa genotipe cabai....................................

34

4 Indeks kepekaan terhadap cekaman (S) yang dihitung berdasarkan

biomasa total, jumlah dan bobot buah per tanaman beberapa genotipe cabai.................................................................

35

5 Kandungan Prolina daun beberapa genotipe cabai pada umur 37

HST pada kondisi tanam optimum dan cekaman kekeringan........ 36

6 Persentase pembentukan kalus dan tunas serta persentase tunas

yang terbentuk dari beberapa genotype cabai secara in vitro…… 46

7 Rata-rata berat kalus, diameter kalus, jumlah tunas dan panjang

tunas dari beberapa genotype cabai yang diinduksi secara in vitro………………………………………………………………

48

8 Perkembangan jaringan daun cabai var. Tit Super dalam berbagai

tahapan transformasi genetika dengan bantuan Agrobacterium hingga menjadi tanaman transgenik. Transformasi genetika untuk mengintroduksikan gen P5CS dengan bantuan Agrobacterium dilakukan sebanyak empat eksperimen.....................................................................................

65

9 Kandungan prolina daun cabai transgenik dan non transgenik pada

kondisi optimum dan dengan perendaman dalam larutan PEG 15% selama 10 hari ..............................................................

69

10 Pengaruh stres kekeringan pada periode 35 hari sesudah tanam

(HST) terhadap tinggi tanaman, panjang buku dan diameter batang tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik.............................

79


11 Pengaruh stres kekeringan pada periode 35 hari sesudah tanaman

(HST) terhadap berat kering daun, luas daun dan jumlah daun tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik…………………………....

80

12

Pengaruh stres kekeringan pada periode 55 hari sesudah tanam (HST) terhadap tinggi tanaman, panjang buku dan diameter batang tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik..................................................... 81


(HST) terhadap berat kering daun, luas daun dan jumlah daun tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik………………………..……… 82

14 Pengaruh stres kekeringan pada periode 78 hari sesudah tanam

(HST) terhadap tinggi tanaman, panjang buku dan diameter batang tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik..................................................... 83


(HST) terhadap berat kering daun, luas daun dan jumlah daun tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik………………….……………… 84

16 Pengaruh perlakuan stres kekeringan pada periode 15-78 hari

sesudah tanam (HST) terhadap kandungan prolina daun tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik. Contoh daun diambil 78 HST..............................

86

17 Segregasi fenotipe bibit R2 yang ditanam dalam medium MS

selektif dengan penambahan antibiotika kanamisin 100 mg/l, hasil analisis χ2, dan pendugaan jumlah lokus nptII fungsional yang terintegrasi dalam genom tembakau transgenik................................. 99

18 Pengaruh penyiraman polietilena glikol (PEG) dengan konsentrasi

0%,2.5%, 5%,7.5%, 10%,12.5% dan 15% pada umur 35 HST terhadap tinggi tanaman,bobot akar kering, bobot kering daun,dan panjang akar dari tanaman R1 zuriat tembakau GS transgenik P5CS generasi R2 dan tembakau GS non-transgenik........................ 100

19 Pengaruh penyiraman polietilena glikol (PEG) dengan konsentrasi

0%,2.5%, 5%,7.5%, 10%,12.5% dan 15% pada umur 55 HST terhadap tinggi tanaman, bobot akar kering, jumlah daun, berat kering daun,dan panjang akar dari tanaman R2 zuriat tembakau GS transgenik P5CS R2 dan tembakau GS non-transgenik……………... 101

DAFTAR GAMBAR


1 Skema strategi penelitian : Galur Cabai Transgenik dengan Gen

P5CS-Penyandi Enzim Kunci Biosintesis Prolina Regenerasi dan Karakterisasi Regeneran ………………………………………… 9

2 Alur disertasi Galur Cabai Transgenik dengan Gen P5CS-

Penyandi Enzim Kunci Biosintesis Prolina Regenerasi Dan Karakterisasi Regeneran dan hubungan masing-masing topik penelitian………………………………………………………… 10

3 Lintasan biosintesis L-prolina dari L-glutamin dan berbagai gen

penyandi ensim yang diperlukan untuk biosintesis L-prolina. Gen P5CS merupakan gen penyandi ensim kunci dalam biosintesis prolina, yang ekspresinya meningkat dengan adanya stres kekeringan (dehidrasi) dan menurun dalam kondisi non-stres (rehidrasi)………………………………………………………... 22

4 Peta restriksi plasmid pBI-P5CS.................................................... 23

5 a) Bibit cabai umur 21 hari yang ditanam secara in vitro

b) Daun muda cabai yang ditanam pada media induksi kalus…... 45

6 Kalus-kalus yang terbentuk dari beberapa varietas dan galur cabai

secara in vitro……………………………………………... 47

7 Waktu yang diperlukan beberapa varietas cabai untuk membentuk

kalus………………………………………………… 48

8 Hubungan antara berat kalus dengan jumlah tunas yang terbentuk

pada beberapa varietas cabai………………………. 49

9 Kalus yang terbentuk dari daun muda setelah 14 hari induksi

(9A) kalus yang berwarna putih yang akan berubah menjadi kehijauan dalam beberapa hari dan kalus ini merupakan kalus organogenik (organogenic callus) (OC) (9B) kalus yang berwarna coklat merupakan kalus yang tidak dapat diregenerasikan (non-regenerable callus) (NRC)................ 50

10 Tahapan perkembangan kalus cabai organogenik mulai dari tahap

globular sampai membentuk tunas, (A) – (E) tahapan globular sampai kotiledonary, (F) terbentuknya tunas .................. 50


11 Tunas yang berkembang dalam media perpanjangan tunas (A)

tunas yang abnormal, dimana tidak menghasilkan batang, (B) tunas yang normal yang dapat berkembang membentuk batang....

51

12 Peta konstruksi plasmid biner pBI-P5CS yang membawa gen kimera P5CS, gen marker NPTII, dan gen marker GUS pada struktur T-DNA. Lokasi situs pemotongan oleh ensim restriksi pada T-DNA ditunjukkan dengan angka dan identitas ensimnya (Kavi Kishor et al., 1995)............................................................... 61

13 Hasil total nucleic acid PCR untuk mendeteksi integrasi gen

P5CS: dalam genom cabai transgenik dengan marker NPT II....... 65

14 Perkembangan eksplan daun muda cabai var Tit Super dalam

tahapan transformasi dengan bantuan Agrobacterium (A1) Prekultur eksplan daun muda cabai var Tit Super dalam media MSR-I, (A2) Kokultivasi eksplan daun muda cabai var Tit Super dalam mdia MSR-I, (B1&2) Respon tunas cabai var Tit Super yang resisten dan sensitif terhadap kanamaycin dalam media MSR-II, (C1&2) Planlet cabai var Tit Super transgenik dalam media perakaran…………………………………………………. 66

15 Penampilan daun regeneran cabai cv Tit Super yang direndam

dalam larutan PEG 15% selama 10 hari secara in vitro (A) Kontrol dan (B) Transgenik P5CS………………………………. 67

16 Pengaruh perendaman PEG 0 dan 15% selama periode 10 hari

secara in vitro terhadap kandungan prolina total daun tanaman cabai kontrol dan transgenik R0…………………………………. 68

17 (A) Distribusi kandungan prolina total daun cabai transgenic R0

dan non transgenik dalam kondisi optimum, (B) Distribuís kandungan prolina total daun cabai transgenik R0 dan non tansgenik dalam kondisi cekaman dengan perendaman PEG 15% selama 10 hari……………………………………………………. 68

18 Distribusi kandungan prolina total daun cabai transgenik R0 dan

non transgenik dalam kondisi optimum dan dalam kondisi cekaman dengan perendaman PEG 15% selama 10 hari pada genotype yang sama……………………………………………... 69

19 Penampilan regeneran cabai cv Tit Super secara in vitro (A)

Kontrol dan (B) Transgenik…………………………………….

71

20 Rangkaian reaksi oksidasi prolina.................................................. 72


21 Tanaman tembakau transgenik R2 dalam media kanamisin (A dan

B), tembakau R2 kontrol (non transgenik (C)......................... 78

22 Tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi

R1 dan tembakau GS non-transgenik pada kondisi optimum dan cekaman kekeringan, A1 = Tanaman tembakau non transgenik yang mendapat perlakuan cekaman kekeringan, B1= Tanaman tembakau non transgenik yang tidak mendapat perlakuan cekaman kekeringan, A2= Tanaman tembakau transgenik GS-1 yang tidak mendapat perlakuan cekaman, B2= Tanaman tembakau transgenik GS-1 yang mendapat perlakuan cekaman, A3= Tanaman tembakau transgenik GS-2 yang tidak mendapat perlakuan cekaman,B3= Tanaman tembakau transgenik GS-1 yang mendapat perlakuan cekaman, A4= Tanaman tembakau transgenik GS-3 yang tidak mendapat perlakuan cekaman, B4= Tanaman tembakau transgenik GS-3 yang mendapat perlakuan cekaman, A5= Tanaman tembakau transgenik GS-4 yang tidak mendapat perlakuan cekaman,B5=Tanaman tembakau transgenik GS-4 yang mendapat perlakuan cekaman,A6= Tanaman tembakau transgenik GS-5 yang tidak mendapat perlakuan cekaman,B6= Tanaman tembakau transgenik GS-5 yang mendapat perlakuan cekaman……………………………...

85

23 Kandungan prolina beberapa galur tembakau pada kondisi stres umur 35 dan 78 HST……………………………………………. 86

24 Kandungan prolina beberapa galur tembakau pada kondisi

optimum umur 35 dan 78 HST…………………………………... 86

25 Regresi antara kandungan prolina daun dari tembakau GS non-

transgenik dan tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik R 1, dengan tinggi tanaman dan bobot kering daun per tanaman Kandungan prolina daun ditentukan umur 78 hari sesudah tanam (hst) sedangkan tinggi tanaman dan berat kering daun ditentukan 110 hari setelah tanam (hst). (■) tembakau GS-non transgenik, (♦) tembakau GS transgenik P5CS……………………………… 87

26 Keterkaitan antara indeks sensitivitas terhadap cekaman

kekeringan yang dihitung menggunakan data tinggi tanaman dan panjang akar dari tembakau GS non-transgenik (♦) dan transgenic (Ο,♦■). Nilai indeks sensitivitas ≤ 0.5 dikategorikan toleran, diantara 0,5 dan 1 dikategorikan medium, dan >1 dikategorikan peka......................................................................... 89

27 Menunjukkan bahwa ekspresi pembentukan senyawa prolina

lebih banyak di daun daripada di akar tanamn………………….. 99

DAFTAR ISTILAH

Aklimatisasi proses penyesuaian peralihan lingkungan hidup heterotroph menjadi autotroph pada planlet yang diperoleh melalui teknik in vitro

CaMV 35 S promotor yang terdapat pada DNA viral yang ekspresinya bersifat konstitutif (di seluruh bagian), yang merupakan strong promoter

Cekaman kekeringan kondisi ketersediaan air media tanaman yang tidak memadai baik jumlah maupun distribusinya, yang terjadi pada sebagian atau sepanjang siklus hidup tanaman sehingga tanaman tidak dapat mengekspresikan potensi genetiknya.

Embriosomatik proses pembentukan embrio secara aseksual dari sel somatik dalam kultur in vitro

Kultur in vitro suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma

sel, sekelompok sel, jaringan dan organ, serta menumbuhkannya dalam kondisi aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak

diri dan beregenerasi menjadi tanaman lengkap. Genersi R0 tanaman yang merupakan hasil regenerasi jaringan dari kultur in vitro Generasi R1 tanaman yang merupakan zuriat dari tanaman generasi R0 Mekanisme avoidance (ketahanan)

mekanisme respon terhadap cekaman kekeringan yang ditunjukkan dengan kemampuan tanaman untuk mempertahankan potensial air jaringan yang relatif tinggi pada saat mengalami cekaman kekeringan

Mekanisme escape (pelarian) mekanisme respon terhadap cekaman kekeringan yang ditunjukkan dengan kemampuan tanaman untuk menyelesaikan siklus hidupnya sebelum terjadi cekaman kekeringan sehingga tidak mengalami cekaman

Mekanisme tolerance (toleran) mekanisme respon terhadap cekaman kekeringan yang ditunjukkan

dengan kemampun tanaman untuk bertahan hidup dengan potensial air jaringan yang rendah

Nisbah akar/tajuk ratio bobot kering akar dan tajuk Osmolit senyawa yang terlarut dalam plasma sel yang dapat berperan untuk

mempertahankan potensial osmotik sel dan melindungi kerusakan struktur sel akibat senyawa radikal pada saat mengalami cekaman

PCR (Polymerase Chain Reaction) Amplifikasi enzimatik dari fragmen DNA spesifik dengan menggunakan

siklus berulang dari denaturasi, penempelan primer, dan elongasi Peka respon tanaman yang tidak mampu mempertahankan diri atau mengatasi

pengaruh cekaman kekeringan, yang ditunjukkan dengan menurunnya pertumbuhan dan atau hasil panen secara signifikan pada kondisi cekaman kekeringan

PEG (Poly Ethylene Glycol) senyawa polimer yang tersusun atas sub unit etilen-oksida yang mampu

mengikat molekul air pada atom oksigennya dengan ikatan hidrogen Plasmid elemen genetik ekstrakromosomal yang memiliki kemampuan untuk

menggandakan diri sendiri. Untaian DNA berbentuk lingkaran diluar kromosom yang terdapat dalam sel bakteri.

Potensial osmotik potensi suatu larutan untuk melakukan osmosis atau menarik molekul air,

yang nilainya negatif dan ditentukan oleh konsentrasi larutan, suhu, konstanta gas dan konstanta ionisasi

Primer sebuah oligonukleotida khusus yang komplemen pada region tertentu dari

strand template, yang mana sintesis DNA baru terjadi Prolina salah satu jenis asam amino yang terlarut dalam plasma sel dan dapat

berperan sebagai osmolit T-DNA utas nukleotida yang merupakan bagian dari sistem penginduksi tumor

yang dimiliki oleh Agrobacterium tumefaciens yang terintegrasi dalam genom tanaman. Segmen dari plasmid Ti yang di transfer dan masuk dalam lokasi kromosomal pada inti sel tanaman.

Terminator situs dimana transkripsi berhenti

Transforman sel yang telah mengalami proses transformasi Transgenik organisme yang genomnya telah disisipi dengan DNA asing Toleran respon tanaman yang mampu mempertahankan diri atau mengatasi

pengaruh cekaman kekeringan, yang ditunjukkan dengan menurunnya pertumbuhan dan atau hasil panen yang tidak signifikan pada kondisi cekaman kekeringan

Vektor molekul DNA yang dapat membawa DNA yang disisipkan dan

memindahkannya ke dalam sel inang

I PENDAHULUAN

Latar Belakang

Cabai (Capsicum spp) merupakan sayuran penting di dunia dan termasuk

spesies pertama yang ditemukan telah digunakan manusia di seluruh dunia (Berke

2002a). Cabai dapat dikonsumsi dalam bentuk buah segar, kering atau bentuk

olahannya dan memiliki berbagai manfaat. Cabai telah menjadi bagian penting

dalam resep masakan (Berke 2002b), kaya akan vitamin C, A, dan B, potasium,

fosfor dan kalsium (Xuefeng 1999; Boslan and Votava 2000), dan kandungan

kimianya merupakan bagian penting dalam obat-obatan, pewarna makanan, dan

kosmetika (Taychasinpitak dan Taywiya 2003; IISR 2006).

Cabai merah (Capsicum annuum L.) merupakan spesies yang

dibudidayakan paling luas (Zhang 1989) karena merupakan spesies cabai pertama

yang ditemukan oleh Columbus dan diintroduksikan ke seluruh dunia. Cabai

merah masuk ke Indonesia dibawa oleh bangsa Portugis sekitar 450 – 500 tahun

yang lalu (Berke 2002b). Cabai merah beradaptasi dengan cepat dan diterima

oleh bangsa Indonesia sehingga menjadi komoditi sayuran penting, mempunyai

nilai ekonomis yang tinggi dan seiring dengan peningkatan jumlah penduduk

maka permintaan akan cabai juga terus meningkat. Di Indonesia ternyata luasnya

pertanaman cabai merah tidak diikuti oleh tingginya produktivitas. Data Dirjen

Bina Produksi Hortikultura tahun 2000, tercatat bahwa luas areal pertanaman

cabai merah adalah sebesar 183,347 ha, dengan rata-rata produktivitas 5,5 ton /ha,

dan tahun 2001 menurun menjadi 4,17 ton/ha, yang masih jauh di bawah rata-rata

produktivitas dunia sebesar 9,5 ton/ha, sehingga tidak mampu mencukupi

kebutuhan nasional (Dirjen Produksi Hortikultura dan Aneka Tanaman 2001).

Data BPS Produksi Tanaman Sayuran dan Buah-buahan Indonesia tahun 2002,

rata-rata hasil pertanaman cabai dari semua provinsi di Indonesia kurang dari 2

ton/ha, sedangkan potensi produksi cabai merah dapat berkisar antara 12 – 20

ton/ha (Duriat 1996)

Banyak faktor yang menyebabkan rendahnya produktivitas cabai di

Indonesia di antaranya adalah: penggunaan benih yang kurang bermutu, teknik

budidaya yang belum sempurna, dan tingginya serangan hama dan penyakit.

Secara umum pertumbuhan dan perkembangan tanaman dipengaruhi oleh faktor

genetik dan lingkungan. Kenyataan di lapangan lingkungan pertumbuhan

tanaman tidak selalu merupakan kondisi yang optimum bagi tanaman, sehingga

seringkali tanaman tidak mampu mengekspresikan seluruh potensi genetik yang

dimilikinya. Menurut Blum (1982) cekaman lingkungan merupakan faktor yang

paling berperan terhadap kesenjangan antara potensi dan hasil aktualnya.

Produksi cabai dapat ditingkatkan melalui program perluasan pertanaman

dan intensifikasi budidaya. Kedua program ini sangat membutuhkan benih yang

berkualitas, baik secara genetik maupun fisiologis. Benih yang berkualitas

genetik tinggi dapat diperoleh melalui persilangan konvensional yang diikuti

dengan proses seleksi dan melalui rekayasa genetika.

Kehadiran teknologi transformasi genetika memberikan wahana baru bagi

para pemulia tanaman untuk memperoleh gen-gen baru (Greenberg dan Glick

1993). Rekayasa genetika akan memberikan perbaikan dari karakter-karakter

penting pada tanaman. Sifat ketahanan tanaman terhadap beberapa cekaman

biotik seperti gulma, virus, serangga dan mikroorganisme telah dapat diperbaiki

dengan pendekatan ini. Demikian pula terhadap cekaman abiotik dan modifikasi

kualitas dan kuantitas produk tanaman (Bennet 1993). Suatu gen yang tidak

terdapat pada suatu spesies tanaman tertentu dimungkinkan untuk dapat diperoleh

dari organisme lain seperti bakteri, virus, binatang dan tanaman lain (Herman

1996).

Teknik penyisipan gen (transformasi gen) akan menghasilkan tanaman

transgenik yang kemudian dapat dimanfaatkan sebagai sumber plasma nutfah atau

langsung diseleksi menjadi galur harapan. Transformasi gen secara in vitro

dengan menggunakan vektor Agrobacterium akan berhasil dan bermanfaat apabila

sudah diperoleh protokol regenerasi tanaman yang efisien dan stabil. Kompetensi

untuk beregenerasi yaitu kemampuan membentuk tanaman lengkap (mempunyai

tunas dan akar dan kompetensi untuk ditransformasi) merupakan dua kunci

penting penentu keberhasilan program transformasi genetik.

Kultur sel atau jaringan dan sistem regenerasinya memegang peranan yang

sangat penting di dalam aplikasi bioteknologi atau transformasi genetika untuk

program perbaikan sifat tanaman. Beberapa usaha yang dilakukan untuk

mencapai sistem regenerasi yang efisien adalah dengan menentukan parameter

penting yang spesifik pada tanaman (Parrot et al. 1992). Oleh karena itu, sebelum

dilakukan transformasi genetik untuk memperoleh tanaman cabai yang tahan

terhadap kondisi cekaman kekeringan diperlukan adanya sistem regenerasi yang

efisien dan stabil secara in vitro.

Salah satu kendala pengembangan penanaman cabai adalah terbatasnya

lahan yang sesuai sehingga harus menggunakan lahan-lahan marginal. Lahan

marginal memiliki keterbatasan, khususnya dalam ketersediaan air yang

menyebabkan tanaman mengalami kekeringan. Disamping itu, perubahan suhu

global dengan siklus musim kemarau panjang yang semakin pendek (setiap 2-3

tahun) juga menyebabkan cekaman kekeringan pada tanaman (Winarso 1992).

Cekaman kekeringan menjadi masalah yang perlu diperhatikan dalam

budidaya cabai karena penanaman cabai biasanya di lahan sawah dilakukan pada

akhir musim hujan. Kondisi musim kemarau atau penanaman di lahan tegal

meyebabkan ketersediaan air tidak selalu terjamin sepanjang musim tanam.

Lahan pertanaman yang mengalami kekurangan air akan mengakibatkan fungsi

dan pertumbuhan akar sebagai bagian tanaman yang penting akan terganggu.

Akibatnya pertumbuhan seluruh tanaman akan ikut terganggu sehingga akan

berefek juga pada perkembangan tanaman cabai, akhirnya, mutu, dan produksi

cabai akan merosot (Setiadi 2004).

Penanaman kultivar cabai yang toleran terhadap cekaman kekeringan dan

yang berdaya hasil tinggi menawarkan harapan dapat mengembangkan budidaya

cabai di lahan kering. Toleransi terhadap cekaman kekeringan dapat terjadi jika

tanaman dapat bertahan terhadap kondisi yang terjadi dan adanya toleransi atau

mekanisme yang memungkinkan menghindari dari situasi cekaman tersebut.

Tanaman mempunyai toleransi yang berbeda terhadap cekaman kekeringan

karena perbedaan dalam mekanisme morfologi, fisiologi, biokimia dan molekuler

(Perez-Molphe-Balch et al. 1996).

Toleransi cekaman kekeringan pada tanaman hampir selalu melibatkan

akumulasi senyawa yang dapat melindungi sel dari kerusakan yang terjadi pada

saat potensial air rendah. Sejalan dengan itu, hasil penelitian menunjukkan bahwa

mekanisme adaptasi tanaman untuk mengatasi cekaman kekeringan adalah dengan

pengaturan potensial osmotik sel. Pada mekanisme ini terjadi sintesis dan

akumulasi senyawa organik yang dapat menurunkan potensial air dalam sel tanpa

membatasi fungsi ensim serta menjaga turgor sel. Beberapa senyawa yang

berperan dalam penyesuaian osmotikal sel diantaranya yaitu senyawa prolina dan

gula total. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa ketahanan terhadap cekaman

kekeringan berhubungan dengan peningkatan kandungan prolina yang berperan

penting dalam menjaga pertumbuhan akar pada Potensial Osmotik (PO) air yang

rendah (Sharp 1994). Hasil penelitian lain menunjukkan terjadi peningkatan

konsentrasi prolina 5-6 kali pada padi toleran kering TKM 1 sedangkan pada padi

peka Sabarmati hanya meningkat 1-2 kali pada kondisi potensial osmotik –10 bar

(Mali dan Mehta 1977).

Akumulasi prolina dalam respon terhadap cekaman kekeringan telah

dilaporkan pada beberapa tanaman secara in vitro dan ex vivo (Hanson et al.

1979; Handa et al, 1986; Sarkar1993; Madan et al. 1995; Girousse et al. 1996).

Jumlah prolina yang meningkat dianggap merupakan indikasi toleransi terhadap

cekaman kekeringan karena prolina berfungsi sebagai senyawa penyimpan N dan

osmoregulator dan/atau sebagai protektor ensim tertentu (Kim dan Janick 1991;

Madan et al. 1995; Prasad dan Potluri 1996; Yoshiba et al. 1997). Sebagai

akibatnya sel, jaringan atau tanaman yang overproduksi prolina dianggap

mempunyai sifat toleransi terhadap cekaman kekeringan yang lebih baik.

Akumulasi prolina pada tanaman yang mengalami cekaman kekeringan

disebabkan oleh aktivasi biosintesis prolina dan inaktivasi degradasi prolina. Pada

tanaman tingkat tinggi, prolina disintesis melalui lintasan asam glutamin dan

ornitin. Lintasan dari glutamin merupakan lintasan primer untuk biosintesis

prolina dalam kondisi cekaman kekeringan (Madan et al. 1995; Yoshiba et al.

1997). Prolina disintesis dari glutamin melalui dua senyawa antara yaitu glutamin

semialdehyde (GSA) dan Pyrroline-5-carboxylate (P5C). Ada dua ensim yang

berperan dalam biosintesis prolina yaitu P5C synthetase (P5CS) pada tahap awal

dan P5C reductase (P5CR) pada step kedua (Gambar 3). Gen yang menyandi

P5CS dan P5CR telah diisolasi dari berbagai tanaman dan ekspresi serta fungsinya

telah diteliti. Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen P5CS merupakan penyandi

ensim yang menjadi faktor pembatas dalam biosintesis prolina pada tanaman

tingkat tinggi (Hu CA et al. 1992).

Over-ekspresi dari P5CS menghasilkan akumulasi prolina pada tanaman

transgenik dan terbukti meningkatkan toleransi tanaman terhadap cekaman

kekeringan. Over-produksi prolina mampu meningkatkan secara signifikan

terhadap biomassa akar dan perkembangan bunga pada tanaman transgenik

dibawah kondisi cekaman kekeringan atau cekaman osmotik. Transformasi gen

P5CS yang berasal dari V. aconitifolia ke tanaman tembakau di bawah kendali

promoter konstitutif CaMV 35S, secara nyata terbukti meningkatkan produksi

prolina yang meningkatkan pula toleransi tanaman transgenik tersebut terhadap

cekaman kekeringan (Kavi Kishor et al. 1995). Pada tanaman transgenik padi,

over-ekspresi gen P5CS terbukti dapat meningkatkan kadar prolina daun dan

mampu menghasilkan peningkatan biomassa tanaman dalam kondisi stres air dan

garam tinggi (Zhu et al. 1998). Transformasi gen P5CS yang diikuti regenerasi

tanaman transgeniknya diperkirakan mampu menghasilkan tanaman cabai

transgenik yang toleran terhadap cekaman kekeringan.

Berdasarkan uraian di atas, terdapat peluang yang cukup besar dalam

pengembangan galur cabai transgenik dengan karakter toleran terhadap cekaman

kekeringan melalui over-ekspresi gen P5CS – penyandi enzim kunci biosintesis

prolina, yaitu dengan mengintroduksi gen P5CS menggunakan Agrobacterium ke

dalam genom cabai dan tembakau sebagai tanaman model.

Tujuan penelitian

1. Memperoleh informasi tentang respon fisiologis cabai sebagai bagian dari

mekanisme toleransi tanaman terhadap cekaman kekeringan

2. Mendapatkan varietas cabai yang mempunyai daya regenerasi yang tinggi

secara in vitro

3. Mendapatkan populasi tanaman cabai yang diduga membawa gen P5CS,

hasil transformasi menggunakan Agrobacterium.

4. Mengevaluasi regeneran cabai hasil transformasi gen P5CS

5. Memperoleh informasi apakah pada kondisi optimum terjadi ekspresi P5CS

pada tanaman tembakau

6. Memperoleh informasi apakah over ekspresi terjadi di semua jaringan

tanaman tembakau

7. Apakah umur/developmental tanaman berpengaruh pada ekspresi P5CS

Garis Besar Disertasi

Disertasi ini disusun berdasarkan pemikiran bahwa keberhasilan untuk

mengembangkan tanaman cabai merah yang toleran terhadap cekaman kekeringan

dan berdaya hasil tinggi melalui pemuliaan tanaman akan lebih tinggi jika:

tersedia populasi tanaman cabai yang bersegregasi zuriat dari hasil persilangan

antara tetua donor yang membawa sifat daya hasil tinggi dengan tetua donor yang

membawa sifat toleransi cekaman kekeringan.

Toleransi terhadap cekaman kekeringan dikendalikan oleh banyak sifat

(Blum 1983) maka untuk memperoleh metode seleksi yang efektif perlu dilakukan

serangkaian percobaan identifikasi sifat toleransi cekaman kekeringan. Pada tahap

awal, percobaan untuk memperoleh karakter yang dapat memberi petunjuk

toleransi kekeringan pada cabai. Rangkaian percobaan respon cabai terhadap

cekaman kekeringan dilakukan terhadap lima genotipe cabai. Karena toleransi

kekeringan bersifat dinamik, diantaranya dipengaruhi oleh tingkat perkembangan

tanaman, maka identifikasi sifat toleran tersebut dilakukan pada tahap

pertumbuhan vegetatif dan pertumbuhan generatif.

Evaluasi toleransi terhadap cekaman kekeringan biasanya dilakukan

dengan dua pendekatan: (1) secara langsung, dengan mengamati pengaruh

langsung cekaman kekeringan terhadap pertumbuhan, perkembangan, dan daya

hasil; (2) secara tidak langsung, dengan mengamati berbagai peubah morfologi,

fisiologi, atau molekuler yang terkait dengan sifat toleransi terhadap kekeringan.

Pada pendekatan secara langsung, tanaman diberi perlakuan cekaman kekeringan

dengan pengurangan pemberian air. Hasil yang diperoleh selanjutnya dibahas

pada BAB III, BAB IV, BAB V, dan BAB VI. BAB III membahas “Dampak

Cekaman Kekeringan Terhadap Pertumbuhan, Hasil dan Kandungan Total

Prolina Daun Cabai (Capsicum annuum L), dan tulisan ini telah diterbitkan di

jurnal ilmiah nasional terakreditasi AGRISTA volume 12 nomor 1, halaman 19-

27, April 2008, Universitas Syiah Kuala Banda Aceh. Percobaan-percobaan yang

dilakukan untuk pembahasan tersebut ditujukan untuk menentukan keefektifan

penggunaan simulasi cekaman kekeringan pada berbagai tahap pertumbuhan

menggunakan pot dengan pengurangan penyiraman air dalam menapis karakter

toleransi tanaman cabai. Hasil yang didapat akan dipakai sebagai penduga

toleransi tanaman cabai terhadap cekaman kekeringan. Peubah yang diukur dalam

percobaan ini adalah kandungan prolina daun, tinggi tanaman, jumlah cabang

utama, dan bobot kering tajuk dan akar. Peubah yang terkait dengan pertumbuhan

generatif meliputi jumlah dan bobot buah .

Sejalan dengan penelitian ini dilakukan penelitian tentang ”Studi

Regenerasi Beberapa Genotipee Cabai (Capsicum Annum L.) Secara In

Vitro” Hasil percobaan ditulis pada BAB IV, penelitian ini bertujuan untuk

mendapatkan genotipe cabai yang respon untuk dikembangkan secara in vitro

untuk digunakan dalam rekayasa genétika tanaman guna memasukan gen

ketahanan terhadap cekaman kekeringan pada genom cabai.

Hasil percobaan dan analisis studi tersebut kemudian digunakan untuk

tahapan penelitian yang ditulis dalam BAB V dengan judul “Introduksi Gen

P5CS ke dalam Genom Cabai dengan Bantuan Agrobacterium dan

Ekspresinya terhadap Cekaman Akibat Pemberian PEG”.

Untuk membuktikan bahwa gen P5CS dapat memberikan ketahanan

terhadap tanaman yang mengalami cekaman kekeringan dilakukan penelitian

terhadap tanaman model tembakau transgenik yang telah mengandung gen P5CS,

generasi R2, yang ditulis dalam BAB VI ”Toleransi Tembakau Transgenik

Generasi R2 yang Mengekspresikan Gen P5CS terhadap Cekaman

Kekeringan Akibat Pengurangan Pemberian Air”. Berdasarkan evaluasi

terhadap percobaan simulasi cekaman kering menggunakan pot dengan

pengurangan penyiraman yang telah dilakukan ada beberapa hal yang perlu

disempurnakan. Adanya perbedaan perawakan pada genotipe toleran (yang

cenderung lebih besar) dan genotipe peka (cenderung lebih kecil) menyebabkan

perbedaan kebutuhan air di antara keduanya.

Respon yang diberikan oleh masing-masing individu pada simulasi

kekeringan dalam pot dapat berbeda. Untuk mengatasi hal tersebut dilakukan

percobaan dengan menggunakan simulator yang lebih baik. Penggunaan larutan

PEG 6000 untuk mengatasi kelemahan yang muncul merupakan pilihan yang

diambil untuk percobaan selanjutnya. Pengamatan dilakukan terhadap berbagai

peubah pertumbuhan vegetatif. Hasil percobaan dan analisis penggunaan larutan

PEG dalam menapis sifat toleransi pada tembakau ditulis pada BAB VII dengan

judul “Toleransi Tembakau Transgenik Generasi R2 Yang Mengekspresikan

Gen P5CS terhadap Stres Akibat Penyiraman Polietilen Glikol ”.

Gambar 1 Skema strategi penelitian : Galur Cabai Transgenik dengan Gen

P5CS-Penyandi Enzim Kunci Biosintesis Prolina Regenerasi dan Karakterisasi Regeneran

Transformasi genetika: Introduksi gen P5CS menggunakan Agrobacterium

Analisis respon

beberapa varietas cabai secara in vitro

Tahapan In Vitro Induksi kultur Embrio Somatik (ES) sebagai

eksplan

Plasma Nutfah Cabai

Analisis respon tanaman cabai transgenik terhadap cekaman

kekeringan

Analisis respon tanaman tembakau transgenik R2 yang membawa gen P5CS terhadap cekaman kekeringan

Regenerasi tanaman transgenik R0 yang mengandung gen P5CS

Evaluasi keberadaan transgene pada transforman R0 yang mengandung gen P5CS

Analisis respon tanaman tembakau transgenik T2 terhadap cekaman kekeringan dengan penyiraman PEG

Tanaman transgenik yang toleran cekaman kekeringan

Analisis respon tanaman cabai transgenik terhadap cekaman

kekeringan

Analisis respon tanaman tembakau transgenik R2 yang membawa gen P5CS terhadap cekaman kekeringan

Regenerasi tanaman transgenik R0 yang mengandung gen P5CS

Evaluasi keberadaan transgene pada transforman R0 yang mengandung gen P5CS

Analisis respon tanaman tembakau transgenik R2 terhadap cekaman kekeringan dengan penyiraman PEG

Tanaman transgenik yang toleran cekaman kekeringan

Gambar 2 Alur disertasi Galur Cabai Transgenik dengan Gen P5CS-Penyandi

Enzim Kunci Biosintesis Prolina Regenerasi Dan Karakterisasi Regeneran dan hubungan masing-masing topik penelitian

Dampak Cekaman Kekeringan Terhadap Pertumbuhan, Hasil, Dan Kandungan Prolina Daun Cabai (Capsicum annum L.) (Bab III)

Studi Regenerasi Beberapa Genotipe Cabai

(Capsicum annum L.) Secara In Vitro (Bab IV)

Toleransi Tembakau

Transgenik Generasi R2 Yang mengekspresikan Gen

P5CS terhadap Cekaman Kekeringan Akibat

Pengurangan Pemberian Air (Bab VI)

Toleransi Tembakau

Transgenik Generasi R2 Yang mengekspresikan

Gen P5CS terhadap Cekaman Kekeringan Akibat Penyiraman

Polietilen Glikol (PEG) (Bab VII)

Introduksi Gen P5CS dengan Bantuan

Agrobacterium dan Regenerasi Cabai

Transgenik (Bab V)

Luaran Penelitian : Dengan didapat genotipe cabai yang respon terhadap perbanyakan secara in vitro, dan dilakukan introduksi gen P5CS maka diharapkan di dapatkan tanaman cabai transgenik

yang tahan terhadap cekaman kekeringan

II TINJAUAN PUSTAKA

Tanaman Cabai

Berdasarkan klasifikasi tanaman cabai termasuk dalam kingdom: Plantae,

Divisio: Magnoliophyta, Kelas: Magnoliopsida; Ordo: Solanales; Famili:

Solanaceae; dan Genus: Capsicum. Kebanyakan spesies cabai adalah diploid

dengan 24 kromosom (2N = 2 x = 24) dan mempunyai 1 atau 2 pasang kromosom

acrosentrik dengan 10 atau 11 pasang metasentrik atau submetasentrik (Bosland

dan Votata 2000).

Genus Capsicum adalah anggota dari famili Solanaceae yang di dalamnya

termasuk tomat, kentang, tembakau dan petunia. Genus Capsicum terdiri dari 22

spesies liar dan 5 spesies yang dibudidayakan (Bosland 1994): C. annuum,

C. baccatum, C. chinense, C. frutescens, dan C, pubescens.

Cabai (Capsicum spp) merupakan sayuran penting di dunia dan termasuk

spesies pertama yang ditemukan telah digunakan manusia di seluruh dunia (Berke

2002a). Cabai dapat dikonsumsi dalam bentuk buah segar, kering atau bentuk

olahannya dan memiliki berbagai manfaat. Cabai telah menjadi bagian penting

dalam resep masakan (Berke 2002b), kaya akan vitamin C, A, dan B, potasium,

fosfor dan kalsium (Xuefeng 1999; Boslan dan Votava 2000), dan kandungan

kimianya merupakan bagian penting dalam obat-obatan, pewarna makanan, dan

kosmetika (Taychasinpitak dan Taywiya 2003; IISR 2006).

Jenis-jenis cabai yang sudah dibudidayakan secara komersial dan

berkembang di Indonesia ada dua spesies yaitu: cabai besar (Capsicum annuum L)

dan cabai kecil (Capsicum frutescens L.). Cabai besar dikenal 3 varietas, yaitu:

cabai merah (varietas longum), cabai keriting, dan cabai paprika (varietas

grossum). Perbedaan varietas cabai merah besar dengan cabai merah keriting

terletak pada morfologi buahnya. Cabai merah besar ukuran buahnya besar,

panjang, ujungnya runcing, dan rasanya sedikit pedas serta agak manis. Buah

pada saat muda berwarna hijau, dan setelah tua menjadi merah. Sedangkan cabai

merah keriting ukuran buahnya panjang, runcing, dan rasanya lebih pedas dari

cabai merah pedas besar. Disamping itu kulit buah agak tipis serta diameter

buahnya lebih kecil disbanding cabai merah besar (Messiaen 1992; Rukmana

1996).

Cabai besar (Capsicum annuum L.) termasuk tanaman semusim yang

berbentuk perdu, dan mempunyai akar yang menyebar. Penyebaran akarnya

dangkal sehigga cabang dan rambut akar banyak terdapat di permukaan tanah, dan

semakin ke dalam akar-akar tersebut semakin berkurang. Akar horizontal cepat

berkembang di dalam tanah dan menyebar dengan ke dalaman 10 – 15 cm

(Messiaen 1992). Tanaman ini mempunyai batang tegak, tingginya 50 – 90 cm

dari permukaan tanah. Daun berbentuk lonjong dan bagian ujungnya meruncing.

Panjang daun antara 4-10 cm, dan lebarnya antara 1,5 – 4 cm.

Cabai besar berbunga tunggal, yang keluar dari ketiak-ketiak daun. Posisi

bunga menggantung, dan memiliki 5-6 daun mahkota bunga. Panjang bunga

biasanya 1 - 1,5 cm, lebar 0,5 cm cm dan panjang tangkai bunga 1 – 2 cm.

Tangkai putik berwarna putih, panjangnya sekitar 0,5 cm, sedangkan kepala

putiknya berwarna kekuning-kuningan. Tangkai sari berwarna putih dengan

panjangnya sekitar 0,5 cm. Kepala sari yang belum matang berwarna biru atau

ungu (Rukmana 1996).

Berdasarkan data Informasi Hortikultura dan Aneka Tanaman,

Departemen Pertanian (2000) produsen terbesar cabai adalah Jawa Timur, Jawa

Barat, Jawa Tengah, Sumatera Utara, Nusa Tenggara Barat, dan Sulawesi selatan.

Tanaman cabai ini mempunyai nilai ekonomis yang tinggi, sehingga berpeluang

besar menjadi salah satu komoditas ekspor yang unggul. Berdasarkan data ekspor

komoditi hortikultura, cabai merah telah berhasil diekspor ke Negara Singapura,

Taiwan, Emirat Arab dan arab Saudi.

Data statistik menunjukkan bahwa areal pertanaman cabai merah adalah

yang terluas antara sayuran yang diusahakan di Indonesia yaitu sekitar 19,12

persen dari total areal pertanaman sayuran (Direktorat Jendral Bina Produksi

Hortikultura 2007). Jumlah penduduk yang semakin bertambah menggambarkan

permintaan cabai yang semakin besar. Pada tahun 2002 terjadi penambahan areal

pertanaman cabai dari 142,556 ha menjadi 150,598 ha. Namun luasnya areal

pertanaman belum diikuti dengan tingginya produktivitas. Produksi cabai merah

di Indonesia pada tahun 2000 adalah 4,2 ton/ha, sedangkan pada tahun 2004 dan

2005 berturut-turut 5,67 ton/ha dan 5,84 ton/ha (Direktorat Jendral Bina Produksi

Hortikultura 2007). Potensi produksi cabai merah dapat mencapai 12-20 ton/ha

(Duriat 1996). Jika dibandingkan dengan negara-negara Asia lainnya, daya hasil

cabai merah Indonesia tertinggal jauh. Sebagai contoh daya hasil cabai merah

Cina mencapai 14,5 ton/ha (Rubatzky dan Yamaguchi 1997).

Banyak faktor yang menyebabkan rendahnya produktivitas cabai di

Indonesia di antaranya adalah: penggunaan benih yang kurang bermutu, teknik

budidaya yang belum sempurna, dan tingginya serangan hama dan penyakit.

Secara umum pertumbuhan dan perkembangan tanaman dipengaruhi oleh faktor

genetika dan lingkungan. Kenyataan di lapangan lingkungan pertumbuhan

tanaman tidak selalu merupakan yang optimum bagi tanaman, sehingga seringkali

tanaman tidak mampu mengekspresikan seluruh potensi genetika yang

dimilikinya. Menurut Blum (1982) cekaman lingkungan merupakan faktor yang

paling berperan terhadap adanya kesenjangan antara potensi dan hasil aktualnya.

Produksi cabai dapat ditingkatkan melalui program perluasan pertanaman

dan intensifikasi budidaya. Kedua program ini sangat membutuhkan benih yang

berkualitas, baik secara genetika maupun fisiologis. Benih yang berkualitas

genetika tinggi dapat diperoleh melaui persilangan konvensional yang diikuti

dengan proses seleksi.

Pemuliaan tanaman cabai konvensional untuk merakit varietas unggul

merupakan cara yang banyak dilakukan untuk mengendalikan serangan hama

penyakit. Kehadiran teknologi transformasi memberikan wahana baru bagi para

pemulia tanaman untuk memperoleh gen baru yang lebih luas (Greenberg dan

Glick 1993). Rekayasa genetika akan memberikan perbaikan dari karakter-

karakter penting pada tanaman. Sifat ketahanan tanaman terhadap beberapa

cekaman biotik seperti gulma, virus, serangga dan mikroorganisme telah dapat

diperbaiki dengan pendekatan ini. Demikian pula terhadap cekaman abiotik dan

modifikasi kualitas dan kuantitas produk tanaman (Bennet 1993). Suatu gen yang

tidak terdapat pada suatu spesies tanaman tertentu dimungkinkan untuk dapat

diperoleh dari organisme lain seperti bakteri, virus, binatang dan tanaman lain

(Herman 1996).







tunas dan akar) dan kompetensi untuk ditransformasi merupakan dua kunci

penting penentu keberhasilan program transformasi genetika.



program perbaikan tanaman. Beberapa usaha yang dilakukan untuk mencapai

sistem regerasi yang efisien adalah dengan menentukan parameter penting yang

spesifik pada tanaman (Parrot et al. 1992). Oleh karena itu, sebelum dilakukan

transformasi genetika untuk memperoleh tanaman cabai yang tahan terhadap

kondisi kekeringan diperlukan adanya sistem regenerasi yang efisien dan stabil.

Perbanyakan Tanaman Cabai Secara In Vitro

Terbatasnya informasi tentang regenerasi langsung atau organogenesis

tanaman cabai merah merupakan salah satu indikasi sulitnya tanaman ini untuk

diregerasikan secara in vitro. Informasi yang ada umumnya merupakan hasil

penelitian terhadap cabai manis atau páprika (Sweet pepper), sehingga penelitian

yang dilakukan terhadap cabai merah banyak mengacu kepada hasil penelitian

regenerasi tanaman cabai paprika.

Sistem transformasi genetika memerlukan sel/jaringan yang mampu untuk

membelah dan dapat diregenerasikan serta dapat ditumbuhkan dalam media

seleksi antibiotik atau herbisida yang sesuai dengan gen yang dibawa dalam DNA

yang tertransformasi.

Teori totipotensi yang dikemukakan oleh Schleiden dan Schwann pada

tahun 1838 merupakan dasar dari kultur jaringan. Teori tersebut menyatakan

bahwa setiap sel tanaman memiliki informasi genétika lengkap sehingga mampu

beregenerasi membentuk tanaman lengkap bila ditumbuhkan dalam lingkungan

yang sesuai (Pierik 1987). George dan Sherington (1984) menyatakan bahwa

keberhasilan perbanyakan tanaman dengan metode kultur jaringan dipengaruhi

banyak faktor antara lain : sifat genetikaa tanaman, pemilihan bagian tanaman

yang digunakan sebagai sumber eksplan, umur eksplan, komposisi media tumbuh,

zat pengatur tumbuh, dan lingkungan kultur.

Bagian tanaman cabai yang digunakan sebagai eksplan adalah kotiledon,

hipokotil, daun muda, embrio muda, dan embrio matang. Untuk studi regenerasi

langsung eksplan kotiledon, hipokotil, dan daun muda banyak digunakan (Hyde

dan Philips 1996; Valera-Montero dan Ochoa-Alejo 1992; Philips dan

Hubstenberger 1985; Agrawal et al. 1989; Ochoa-Alejo dan Garcia-Bautista 1992;

Ebida dan Hu 1993).

Umur eksplan dan orientasi pengambilan eksplan mempengaruhi

kemampuan eksplan untuk membentuk tunas secara in vitro (Fari dan Zcako

1981; Kato et al. 1996). Fari dan Zcako (1981) melaporkan bahwa segmen bagian

hipokotil dapat terinduksi membentuk tunas, segmen bagian tengah dominan

membentuk akar, dan segmen bagian bawah cendrung membentuk kalus yang

banyak. Kato et al. (1996) melaporkan bahwa umur kecambah 25 hari merupakan

umur terbaik sebagai sumber eksplan daun.

Eksplan daun muda dan hipokotil mempunyai potensi yang sama dalam

kapasitasnya untuk membentuk tunas secara in vitro. Perbedaan respon terutama

disebabkan oleh perbedaan genotip tanaman (Mahmood et al. 1995). Menurut

hasil penelitiannya, Christopher dan Rajam (1996) bahwa eksplan daun lebih

konsisten untuk membentuk tunas dibandingkan dengan eksplan hipokotil dan

kotiledon. Efisiensi tunas tergantung kepada eksplan yang digunakan (Fari dan

Zcako 1981; Zhu et al. 1998).

Sistem regenerasi tanaman secara in vitro paling tidak tiga faktor penting

yang sangat berpengaruh. Faktor-faktor tersebut adalah genotipe, tipe eksplan dan

komposisi media (Moghaieb et al.1999; Gubis et al. 2003). Media dasar yang

paling banyak digunakan adalah mediaum dasar MS (Murashige dan Skoog

1962). Walaupun terdapat komposisi medium dasar lain, sampai sekarang belum

ditemukan komposisi medium dasar lain yang digunakan terhadap regenerasi

tanaman cabai.

Umumnya zat pengatur tumbuh yang paling banyak digunakan untuk

regenerasi tanaman cabai adalah komposisi antara BAP dan IAA (Gunay dan Rao

1978; Fari dan Zcako; 1981; Philips dan Hubstenberger 1985; Agrawal et al.

1989; Arroyo dan Revilla 1991; Valer-Monero dan Ochoa-alejo 1992; Mahmood

et al. 1996). Pada studi generasi tanaman cabai secara in vitro kombinasi BAP

dan IAA ekstensif digunakan. Penggunaan BAP tinggi dan IAA rendah untuk

induksi tunas adventif, BAP rendah dan IAA rendah untuk pemanjangan tunas,

dan IAA rendah untuk merangsang perakaran (Gunay dan Rao 1978; Philips dan

Hubstenberger 1985). Beberapa laporan juga menyatakan bahwa medium

regenerasi tunas yang han ya ditambah dengan BAP saja berhasil dilakukan

(Mahmood et al. 1995; Agrawal et al. 1989).

Cekaman Kekeringan pada Tanaman

Cekaman kekeringan merupakan salah satu faktor lingkungan terpenting

yang menjadi faktor pembatas pertumbuhan tanaman yang menghambat aktivitas

fotosintesis dan translokasi fotosintat (Yakushiji et al. 1998; Savin dan Nicolas,

1996), selanjutnya mempengaruhi produktivitas tanaman. Istilah kekeringan ini

menunjukkan bahwa tanaman mengalami kekurangan air akibat keterbatasan air

dari lingkungan tumbuhnya yaitu media tanam. Menurut Levit (1980) dan Bray

(1997) cekaman kekeringan yang biasa disebut drought stress pada tanaman dapat

disebabkan oleh dua hal yaitu (1) kekurangan suplai air di daerah perakaran dan

(2) permintaan air yang berlebihan oleh daun akibat laju evapotranspirasi melebihi

laju absorpsi air walaupun keadaan air tanah tersedia cukup. Pada lahan kering,

cekaman kekeringan pada tanaman terjadi karena suplai air yang tidak mencukupi.

Menurut Wang et al. (1995) cekaman kekeringan yang dialami tanaman

pada setiap periode pertumbuhan dan perkembangan dapat menurunkan hasil

meskipun besar penurunannya tergantung fase pertumbuhan pada saat terjadi dan

lamanya cekaman. Pada fase pertumbuhan vegetatif, ketersediaan air berpengaruh

pada beberapa asfek fisiologi serta morfologi, antara lain: menurunkan laju

kecepatan fotosintesis dan luas daun. Jika tanaman terkena cekaman kekeringan,

potensial air daun akan menurun, pembentukan klorofil daun akan terganggu dan

struktur kloroplas akan mengalami disintegnasi (Alberte et al. 1977). Kramer

(1983) menjelaskan lebih lanjut bahwa pengaruh cekaman kekeringan pada

pertumbuhan vegetatif terutama pada perluasan area daun dan pertumbuhan tunas

baru dan nisbah akar-tajuk. Sedangkan pada pertumbuhan reproduktif

mengakibatkan ketidaknormalan pembungaan, aborsi embrio, ketidaknormalan

perkembangan biji dan buah. Ditambahkan oleh Sloane et al. (1990) bahwa

tanaman pada fase perkembangan reproduktif sangat peka terhadap cekaman

kekeringan. Kondisi cekaman kekeringan dapat menyebabkan gugurnya bunga,

polong, dan biji yang telah terbentuk. Hal ini berhubungan dengan penurunan

kecepatan fotosintesis akibat keterbatasan ketersediaan air.

Bray (1997) menyatakan respon tanaman terhadap cekaman kekeringan

tergantung pada jumlah air yang hilang, tingkat kerusakan dan lama cekaman

kekeringan, dan juga sangat tergantung pada genotipe tanaman, lama dan jenis

penyebab kehilangan air, umur dan fase perkembangan, tipe organ dan tipe sel

dan bagian-bagian sub seluler. Kehilangan air pada tingkat seluler dapat

menyebabkan perubahan konsentrasi senyawa osmotik terlarut, perubahan volume

sel dan bentuk membran, perubahan gradien potensial air, kehilangan turgor,

kerusakan atau kehancuran integrasi membran dan denaturasi protein. Menurut

Savin dan Nicolas (1996), cekaman kekeringan tidak hanya mengurangi laju

fotosintesis tetapi juga dapat mengakibatkan terjadinya senesen pada organ-organ

fotosintesis. Akibat cekaman kekeringan dapat menyebabkan perbedaan

penurunan hasil antara pada tanaman yang peka, dan juga pada tanaman yang

toleran tetapi berbeda tingkat penurunannya.

Toleransi tanaman terhadap cekaman kekeringan dapat terjadi jika

tanaman dapat bertahan terhadap cekaman yang terjadi dan adanya toleransi atau

mekanisme yang memungkinkan menghindari dampak buruk dari situasi cekaman

tersebut. Karakter morfologi atau fenotipik (secara konvensional) umumnya

digunakan untuk menduga tingkat toleransi tanaman terhadap cekaman

kekeringan yaitu dengan mengamati gejala secara visual di tingkat in vitro

(Hooker dan Thorpe 1997), maupun di lapang (Vallejo dan Kelly 1998), misalnya

perkembangan perakaran, gejala layu sebagian atau keseluruhan pada organ

vegetatif atau organ reproduktif, merosotnya hasil panen dan kualitas hasil, serta

ketidaktahanan hasil dalam penyimpanan.

Respon Tanaman terhadap Cekaman Kekeringan dengan Penyesuaian Osmotik Beberapa tanaman dapat mempertahankan tekanan turgor yang tinggi juga

pada potensial air yang agak rendah dengan cara meningkatkan potensial osmotik

melalui akumulasi zat terlarut yang meningkat di dalam sel. Proses ini disebut

penyesuaian osmotik (osmotic adjustment) atau regulasi osmotik. Adanya

penyesuaian osmotik, berarti menjaga turgor sel sehingga berarti pula menjaga

integritas dan proses fisiologi sitoplasma. Penyesuaian osmotik berpotensi

menjaga proses fotosintesis dan pertumbuhan tanaman (Riduan et al 2007).

Naiola dan Syarif (1996) dan Blum (1982) menyatakan bahwa potensial

turgor merupakan faktor utama yang mempengaruhi pertumbuhan atau perluasan

sel. Jika terjadi akumulasi atau peningkatan senyawa osmotik atau perpindahan

K+, maka potensial osmotik menurun, sehingga air berdifusi ke dalam sel dan

potensial turgor meningkat. Kandungan air tanaman untuk mempertahankan

turgor ini dijaga oleh keseimbangan laju transpirasi dan penyerapan air oleh akar.

Jika tanaman mengalami cekaman kekeringan, maka potensial turgor tanaman

akan terganggu sebagai akibat ketidakseimbangan antara laju transpirasi yang

terjadi dengan jumlah air yang dapat diserap oleh tanaman.

Respon tanaman yang mengalami cekaman kekeringan akan mengurangi

dampak negatif yang ditimbulkan melalui mekanisme pertahanan yang dimiliki

oleh tanaman itu sendiri. Menurut Jones (1981) mekanisme ketahanan tanaman

terhadap kekeringan adalah (1) penghindaran terhadap defisit air yang meliputi: a)

melepaskan diri dari cekaman misalnya dengan memperpendek siklus

pertumbuhan dan memperpanjang periode dorman, b) konservasi air pada

tanaman yang diwujudkan dalam bentuk ukuran daun yang kecil, penutupan

stomata dan penyerapan air yang efektif, diwujudkan dalam bentuk morfologi

akar yang memanjang, dalam dan tebal, (2) toleran terhadap defisit air yaitu

dengan cara: a) memelihara tekanan turgor, b) mengaktifkan larutan-larutan

pelindung untuk aktivitas enzim-enzim yang toleran kekeringan, dan (3)

mekanisme efisiensi yaitu penggunaan air yang tersedia secara efisien dan

memaksimalkan indeks panen.

Penyesuaian osmotik terjadi pada tanaman yang mengalami cekaman

kekeringan secara perlahan dan juga pada cekaman medium. Namun, tidak semua

tanaman mengembangkan penyesuaian osmotik sebagai respon terhadap cekaman

kekeringan. Penyesuaian osmotik dipegaruhi oleh laju perkembangan cekaman,

tingkat cekaman, kondisi lingkungan dan perbedaan genotipe tanaman.

Disamping itu penyesuain osmotik melalui perubahan potenasial osmotik

dipengaruhi oleh akumulasi senyawa terlarut, ukuran sel, volume senyawa terlarut

dan ketebalan dinding sel. Menurut Levitt (1980) dan Blum (1996) penurunan

potensial osmotik disebabkan oleh dua hal yaitu akibat menurunnya kadar air pada

sel karena terjadi kehilangan air dan karena adanya tambahan akumulasi senyawa

terlarut sehingga lebih menurunkan potensial osmotik. Ingram dan Bartels (1996)

menyatakan potensial air daun total dapat dipelihara selama cekaman kekeringan

sedang, melalui penyesuaian osmotik dengan melibatkan senyawa osmotik

kompatibel.

Menurut Ingram dan Bartels (1996) dan Nguyen et al. (1977) senyawa

organik terlarut yang terlibat pada penyesuaian osmotik bervariasi, antara lain

gula-gula, asam organik, asam amino, dan senyawa terlarut kompatibel. ABA dan

prolina merupakan senyawa yang memegang peranan penting untuk toleransi

tanaman terhadap cekaman kekeringan (Kim & janick 1991; Hanson et al. 1979)

Prolina merupakan salah satu senyawa osmotik yang dibiosintesis dan

diakumulasi pada berbagai jaringan tanaman yang dicekam kekeringan, terutama

pada bagian daun (Yang dan Kao 1999). Fungsi lain yaitu memproteksi adanya

denaturasi protein, sebagai sumber energi dari group asam amino dan merupakan

protektan bagi enzim akibat pengaruh toksik biologi seperti urea, oleh karena itu

prolina dikenal sebagai salah satu osmoprotektan (Notle et al. 1997). Sebagai

osmoprotektan, prolina diduga sangat terlibat dalam osmoregulasi, menjaga

kelarutan protein, kestabilan membran fosfolipid dan juga sebagai sumber

cadangan karbon, nitrogen dan energi (Walton et al. 1998). Peranan prolina tidak

hanya terbatas pada penyesuaian osmotik yang dikaitkan dengan status air, tetapi

juga mempunyai peranan lain seperti menetralisir pengaruh toksik NH; hasil

hidrolisis protein sebagai sumber energi dan sumber N bagi pemulihan proses

tanaman pasca cekaman kekeringan (Levitt 1980).

Prolina dijumpai terakumulasi lebih banyak pada tanaman yang lebih

toleran terhadap cekaman kekeringan dibandingkan dengan tanaman yang peka

(Kirkham 1990; Yoshiba et al. 1997). Akumulasi prolina merupakan salah satu

respon pada tanaman akibat cekaman kekeringan. Hasil penelitian Maesteri et al.

(1995) menunjukkan bahwa kandungan prolina pada Coffea arabica clan C.

canehora dapat meningkat dua kali lebih bayak pada kondisi cekaman kekeringan

dibandingkan dengan tanpa perlakuan kekeringan. Dingkuhn et al. (1991)

melaporkan bahwa akumulasi prolina berbeda antar kultivar padi dan berkorelasi

negatif dengan potensial air dan berkorelasi positif dengan penyesuaian osmotik.

Delauney dan Verna (1983) menyatakan bahwa ditemukan indikasi

korelasi positif antara akumulasi prolina dan adaptasi tanaman terhadap cekaman

kekeringan dan garam positif. Oleh karena itu sejumlah peneliti menyatakan

bahwa prolina dapat dipertimbangkan sebagai indikator seleksi menyangkut

adaptasi tanaman terhadap cekaman lingkungan, terutama cekaman kekeringan

dan salinitas (Kuznetsov dan Shevyakova 1997; Yoshiba et al. 1997).

Akumulasi prolina pada tanaman yang mengalami cekaman kekeringan

disebabkan oleh aktivasi biosintesis prolina dan inaktivasi degradasi prolina. Hasil

penelitian hubungan antara ekspresi gen-gen untuk enzim yang terlibat dalam

biosintesis dan metabolisme prolina dan akumulasi prolina dibawah kondisi

cekaman kekeringan menunjukkan bahwa level prolina pada tanaman diatur

pada level transkripsi selama terjadinya cekaman kekeringan. Pada tanaman

tingkat tinggi, prolina disintesis melalui lintasan asam glutamin dan ornitin.

Lintasan dari glutamin merupakan rute primer untuk biosintesis prolina dalam

kondisi cekaman kekeringan (Madan et al. 1995; Yoshiba et al. 1997). Prolina

disintesis dari glutamin melalui dua senyawa intermediet yaitu glutamin

semialdehyde (GSA) dan Pyrroline-5-carboxylate (P5C). Ada dua enzirn yang

berperan dalam biosintesis prolina yaitu P5C synthetase (P5CS) pada step awal

dan P5C reductase (P5CR) pada step kedua (Gambar 3).

Enzim P5CS adalah senyawa yang mengkatalis biosintesis prolina

melalui jalur glutamat pada tanaman. Hasil penelitian menunjukkan bahwa

P5CS merupakan penyandi enzim yang menjadi faktor pembatas dalam

biosintesis prolina pada tanaman tingkat tinggi (Hu CA et al. 1992). Gen yang

menyandi P5CS telah berhasil diisolasi dari berbagai tanaman yaitu dari Vigna

aconitifolia (Hu CA et al. 1992), Arabidopsis thaliana dan padi serta

ekspresi dan fungsinya telah diteliti. Dalam kondisi salinitas tinggi dan

kekeringan, stimulasi biosistesis prolina berkorelasi dengan meningkatnya

level P5CS.

Over-ekspresi dari P5CS menghasilkan akumulasi prolina pada tanaman

transgenik dan terbukti meningkatkan toleransi tanaman terhadap cekaman

kekeringan. Over-produksi prolina mampu meningkatkan secara significan

terhadap biomassa akar dan perkembangan bunga pada tanaman transgenik di

bawah kondisi cekaman kekeringan atau cekaman osmotik. Transformasi gen

P5CS yang berasal dari V. aconitifolia ke tanaman tembakau di bawah kendali

promoter konstitutif CaMV 35S, secara nyata terbukti menghasilkan aktivitas

enzim P5CS yang lebih tinggi dan meningkatkan produksi prolina 10 sampai

18 kali lebih banyak dibandingkan tanaman non transgenik. Hasil

membuktikan bahwa aktivitas enzim P5CS mempunyai peranan penentu dalam

sintesis prolina. Hasil penelitian ini menyimpulkan bahwa over-ekspresi gen

P5CS mampu meningkatkan kandungan prolina secara nyata dan over-produksi

prolina dapat meningkatkan pula toleransi tanaman transgenik tersebut

terhadap cekaman kekeringan (Kavi Kishor et al. 1995).

Hasil penelitian pada tanaman padi yang diintroduksi gen P5CS dari

mothbean (Vigna aconitifolia L.) mampu menunjukkan peningkatan aktivitas

gen P5CS 5,3 sampai 9,8 kali lebih tinggi dan meningkatkan kandungan

prolina 167 sam 252 % lebih tinggi dibandingakn tanaman control. Tanaman

padi transgenik yang membawa gen P5CS juga dapat meningkatakn biomassa

tanaman dalam kondisi cekaman kekeringan melalui peningkatan panjang akar

48%, berat tajuk 32% dan berat akar 164% lebih tinggi dibandingkan tanaman

control (Zhu et al. 1998).

(A) Lintasan biosintesis L-prolina dari L-glutamin:

(B) Berbagai gen penyandi enzim untuk biosintesis L-prolina: Gambar 3 Lintasan biosintesis L-prolina dari L-glutamin dan berbagai gen

penyandi enzim yang diperlukan untuk biosintesis L-prolina. Gen P5CS merupakan gen penyandi enzim kunci dalam biosintesis prolina, yang ekspresinya meningkat dengan adanya cekaman kekeringan (dehidrasi) dan menurun dalam kondisi non-cekaman (rehidrasi)

L-glutamine (L-glu)

Pyrroline-

5-

b l t

Glutamic-

semialdehy

d

L-prolinae (L-pro)

P5C dehydroge- nase (P5CDH)

Prolinae dehydro- genase (ProDH)

Spontan

Pyrroline 5-carboxylase synthetase (P5CS)

P5C reductase (P5CR)

Spontan

Dehidrasi Rehidrasi

ABA

L-glu P5C GSA L-pro

P5CDH ProDH Spontan

P5CS P5CR Spontan

P5CDH gene ProDH gene

P5CS gene P5CR gene

Dehidrasi

Dehidrasi Rehidrasi Rehidrasi

Plasmid pBI-P5CS

Molekul DNA sirkular yang terdapat bebas di dalam sitoplasma sel bakteri

dikenal dengan nama plasmid. Plasmid pBI-P5CS merupakan plasmid

rekombinan yang digunakan untuk menghasilkan tanaman transgenik. Plasmid ini

telah dimodifikasi dari plasmid alami. Plasmid alami direkonstruksi, dikurangi

dan ditambah dengan sifat-sifat tertentu sehingga dihasilkan plasmid rekombinan.

Plasmid rekombinan ini digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen ke

dalam kromosom sel tanaman. Plasmid rekombinan P5CS, mempunyai promotor

konsitutif 35S CaMV, dilengkapi juga gen npt II untuk seleksi ketahanan terhadap

antibiotik kanamisin dan gen reporter GUS untuk mendeteksi keberadaan gen

dalam jaringan tanaman tertentu. Peta restriksi dari plasmid pBI-P5CS dapat

dilihat pada Gambar 4.

Plasmid dari bakteri yang satu dapat memasuki sel bakteri lain. Plasmid

juga mempunyai kemampuan memperbanyak diri dalam sel bakteri. DNA plasmid

mempunyai kisaran ukuran dari 1 kb sampai 200 kb, plasmid ini berlaku sebagai

unit genetika pelengkap yang bereplikasi dan diwariskan secara independen dari

kromosom bakteri. Plasmid hampir selalu membawa satu gen yang merupakan

ciri penting yang ditunjukkan bakteri donor, seperti kemampuan hidup dalam

antibiotik tertentu dengan konsentrasi yang biasanya bersifat toksik seperti

kanamisin dan higromisin. Hal ini disebabkan adanya plasmid yang membawa

gen resistensi di dalam bakteri.

Gambar 4 Peta restriksi plasmid pBI-P5CS

EcoR1

RB LB NPT II NPT II NPT II NosNosNos 3”3”3”NosNos Nos PPP 35S P35S P35S P GUSGUSGUS NosNos Nos 3”3” 3”

P5CSP5CSP5CS35S P 35S P 35S P Nos Nos Nos 3” 3”3” P5CS 35S P Nos 3”

NPT II NPT II NPT II NosNosNos 3”3”3”NosNos Nos PPP 35S P35S P35S P GUSGUSGUS NosNos Nos 3”3” 3”NPT II Nos 3” Nos P 35S P GUS Nos 3”

Sifat-sifat biologi Agrobacterium

Agrobacterium adalah bakteri tanah yang dapat menyebabkan penyakit

tumor (crown gall) atau akar rambut (hairy root) pada bagian tanaman terifeksi.

Hal ini disebabkan karena bakteri ini mampu menstranfer T-DNA yang terdapat

pada plasmid Ti ataupun plasmid Ri ke dalam sel tanaman (Zambryski et al.

1989). Dengan melakukan beberapa modifikasi, kemampuan alamiah

Agrobacterium mentransfer sebagian DNA-nya dapat dimanfaatkan untuk

memindahkan gen tertentu ke dalam tanaman.

T-DNA merupakan bagian dari megaplasmid yang ada dalam

Agrobacterium yaitu Ti-(tumor inducing) plasmid pada A. tumefaciens atau Ri-

(root inducing) plasmid pada A. rhizogenes (Winans 1992). Ti-plasmid yang

terdapat pada semua isolat virulen A. tumefaciens akan stabil selama

Agrobacterium tumbuh pada temperatur di bawah 30oC. Ti-plasmid dapat

dibedakan berdasarkan tipe opine yang dihasilkan yaitu nopaline atau oktopine,

sedangkan Ri-plasmid dibedakan menjadi kelompok manopine atau agropine

(Armitage et al. 1987). Senyawa-senyawa tersebut merupakan sumber C dan N

bagi Agrobacterium yang tidak dihasilkan oleh tanaman normal.

Terdapat dua spesies Agrobacterium yang bersifat patogen bagi jaringan

tanaman dikotil yang mengalami pelukaan yaitu Agrobacterium tumefaciens yang

dapat menginduksi pembentukan tumor pada leher batang (crow gall) dan

Agrobacterium rhizogenes yang dapat menginduksi pembentukan akar berambut

(hairy root) (Zambryski et al. 1989).

Tumor dan akar rambut dapat tumbuh terus walaupun Agrobacterium telah

mati. Selain itu, jaringan tersebut dapat tumbuh secara in vitro dalam medium

tanpa zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin yang biasanya diperlukan untuk

memacu pertumbuhan jaringan tanaman. Induksi tumor dan akar ini disebabkan

oleh ditransferkannya sebagian DNA (T-DNA) dari Agrobacterium ke dalam inti

sel tanaman.

Transfer gen pada genom tanaman dengan bantuan Agrobacterium

Dapat dikatakan bahwa lahirnya rekayasa genetikaa modern didasarkan

pada penemuan dari kemampuan rekayasa alamiah bakteri Agrobacterium.

Bakteri tipe onkogenik mengandung kopi tunggal plasmid Ti. T-DNA adalah

bagian dari plasmid Ti yang dipindahkan ke dalam genom tanaman (Binns 1990;

Day dan Lichtenstein 1990).

Plasmid Ti terlibat sebagai parasitisme secara genetikaa, infeksi

menyebabkan pengambilalihan sumber metabolit tanaman (opin) yang hanya

dapat dimetabolisasi oleh produk bakteri yang dikode oleh plasmid Ti.

Perkembangan tanaman yang terinfeksi akan semakin meningkatkan jumlah opin

yang tersedia (Gelvin 1990).

Ada tiga komponen genetika yang dimiliki Agrobacterium yang sangat

dibutuhkan untuk dapat melakukan transfer T-DNA ke sel tanaman, yaitu (1) T-

DNA itu sendiri sebagai elemen DNA aktif yang ditransfer ke tanaman,

merupakan sekuen DNA yang dapat dimanipulasi dengan cara menyisipkan suatu

sekuen DNA asing (transgen) yang kita kehendaki. Walaupun T-DNA telah

tersisipi DNA asing, transfer gen ke dalam genom tanaman tetap dapat

berlangsung dengan baik. Dalam penelitian ini T.DNA disisipi dengan sekuen gen

marker, gen reporter gus dan gen P5CS; (2) Gen virulensi (vir) yaitu gen penyandi

protein yang mengatur transfer T-DNA dari bacteri ke tanaman; dan (3) Gen-gen

penghasil protein yang terdapat pada kromosom Agrobacterium (Winans 1992).

III DAMPAK CEKAMAN KEKERINGAN TERHADAP PERTUMBUHAN, HASIL DAN KANDUNGAN TOTAL

PROLINA DAUN CABAI (Capsicum annuum L)1

Abstrak

Penelitian bertujuan untuk menentukan pengaruh cekaman kekeringan pada fase pertumbuhan vegetatif terhadap pertumbuhan dan hasil cabai, serta mengevaluasi toleransi dan kandungan prolina daun dari lima varietas cabai dalam kondisi stres tersebut. Cabai ditumbuhkan dalam pot plastik dan diberi perlakuan stres kekeringan pada umur 21 – 54 hari sesudah tanam, dengan penyiraman setiap 5 hari sekali. Tanaman yang disiram setiap hari dari saat tanam digunakan sebagai non-stres. Kandungan prolina ditentukan pada umur 27 dan 37 hari setelah tanam. Hasil percobaan menunjukkan stres kekeringan yang diberikan pada tanaman cabai menurunkan tinggi tanaman, panjang akar, bobot akar. Bobot tajuk, bobot biomassa dan produksi. Indeks sensivitas yang dihitung berdasarkan kandungan prolina daun menunjukkan varietas Tit Super dan Hot Chili dikategorikan peka sedangkan Jatilaba, Prabu dan Laris dikategorikan toleran terhadap stres kekeringan baik pada fase vegetatif maupun generatif.

Kata kunci: Cekaman Kekeringan, Cabai Merah, Indeks Sensitivitas

1 Bagian dari disertasi ini telah dipublikasikan di Jurnal Ilmiah Agrista vol. 12 no 1, hal

19-27, April 2008

III DROUGHT STRESS EFFECT ON GROWTH, YIELD AND TOTAL LEAF PROLINE CONTENT OF

HOT PEPPER (Capsicum annuum L)∗

Abstract

The objectives of this experiments were to evaluate effects of drought stress at vegetative stage on growth, yield and leaf proline content of hot pepper. Drought stress was conditioned by watering plants every five days during the period of 21 – 54 days after planting (DAP). Results of the experiment indicated that drought stress reduced plant height, branch numbers, stem diameter, root length, shoot, root and biomass dry weight and fruit yield. Sensivity index calculated based on biomass of five hot pepper cultivars showed that Prabu was the only tolerance cultivar while those based on proline concentration showed that Prabu, Laris dan Jati Laba were the medium tolerance to drought stress. There was no drought tolerance cultivar if the sensitivity index was calculated based on fruit yield.

Keyword: Dehydration stress, hot pepper, drought sensitivity index ∗ Bagian dari disertasi ini telah dipublikasikan di Jurnal Ilmiah AGRISTA vol.12 no.1, hal 19-27, April 2008

PENDAHULUAN

Cabai merah di Indonesia merupakan tanaman sayuran penting. Namun

demikian produktivitas cabai yang ditanam petani relatif masih rendah akibat

gangguan hama dan penyakit serta kondisi cekaman lingkungan seperti

kekeringan.

Cekaman kekeringan merupakan satu kendala dalam budidaya cabai

merah. Pada berbagai tanaman cekaman kekeringan berpengaruhi negatif

terhadap pertumbuhan dan produksi. Kramer (1993) menyebutkan terjadinya

cekaman kekeringan pada fase pertumbuhan vegetatif menurunkan indeks luas

daun, perkembangan tunas baru, dan nisbah tajuk-akar. Pada kedelai, cekaman

kekeringan pada fase pertumbuhan vegetatif menurunkan tinggi tanaman, jumlah

nodus, panjang akar, bobot kering akar dan tajuk (Sunaryo 2002). Ridwan dan

Sudarsono (2004) melaporkan cekaman kekeringan pada kacang tanah

menurunkan tinggi tanaman, bobot kering tajuk dan hasil.

Cekaman kekeringan dapat mempengaruhi berbagai mekanisme seluler,

biokimia dan fisiologi tanaman. Pada tingkat seluler kekeringan mengakibatkan

kehilangan air protoplasmik sehingga konsentrasi ion meningkat, menghambat

fungsi-fungsi metabolik, dan meningkatkan kemungkinan terjadinya interaksi

antar molekul yang dapat menyebabkan denaturasi protein dan fusi membran

(Mundree et al. 2002). Pengaruh negatif cekaman kekeringan terhadap tanaman

ditentukan oleh tingkat cekaman dan fase pertumbuhan tanaman saat mengalami

cekaman. Pengaruh negatif cekaman kekeringan terhadap tanaman ditentukan

oleh tingkat cekaman dan fase pertumbuhan tanaman saat mengalami cekaman.

Menurut Mitra (2001) mekanisme respon terhadap kekeringan dapat

dibedakan menjadi tiga, yaitu mekanisme escape (pembebasan), avoidance

(penghindaran) dan tolerance (toleransi). Pembebasan merupakan kemampuan

tanaman untuk menyelesaikan siklus hidupnya sebelum terjadi cekaman

kekeringan sehingga tidak mengalamai cekaman. Penghindaran adalah

kemampuan tanaman untuk mempertahankan potensial air jaringan yang relatif

tinggi pada saat mengalami kekeringan. Toleransi adalah kemampuan tanaman

untuk bertahan hidup dengan potensial air jaringan yang rendah.

Salah satu mekanisme adaptasi tanaman terhadap cekaman kekeringan

dilakukan dengan mengatur potensial osmotik sel tanaman (Levitt 1980; Blum

1996). Cekaman kekeringan meningkatkan konsentrasi prolina daun. Senyawa

prolina dapat menurunkan potensial osmotik sel tanpa menghambat fungsi enzim

dan tidak mengurangi turgor sel, serta berperanan penting dalam menjaga turgor

sel dan pertumbuhan akar pada kondisi potensial air yang rendah (Ober dan Sharp

1994; Mullet dan Whilsitt 1996). Sudarsono et al. (2006) melaporkan kacang

tanah yang ditanam dalam kondisi cekaman kekeringan meningkatkan senyawa

prolinanya sebagai respon terhadap cekaman.

Informasi tentang respon tanaman cabai terhadap perlakuan cekaman

kekeringan pada fase pertumbuhan vegetatif dan generatif dapat digunakan untuk

menapis sifat toleransi cabai terhadap cekaman kekeringan. Percobaan ini

bertujuan untuk (1) menentukan pengaruh cekaman kekeringan yang terjadi sejak

fase pertumbuhan vegetatif sampai generatif terhadap pertumbuhan tanaman serta

jumlah dan bobot buah per tanaman cabai merah, (2) mengevaluasi toleransi lima

varietas cabai terhadap cekaman kekeringan dan (3) mengevaluasi kandungan

prolina total dari lima varietas cabai yang ditanam dalam cekaman kekeringan.

BAHAN DAN METODE

Bahan Tanaman dan Penanaman. Penelitian dilakukan di Laboratorium

Biologi Molekuler Tanaman, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Faperta

IPB, Bogor dari bulan Maret hingga September 2007. Kultivar cabai yang

digunakan merupakan yang umum ditanam di Indonesia, yaitu cabai cv. Tit

Super, Hot Chili, Laris, Prabu, dan Jati Laba. Benih cabai dikecambahkan dalam

bak pengecambahan dan, bibit dipindahkan ke dalam pot plastik (Φ 45 cm) berisi

media tanam campuran tanah:kompos (1:1) sebanyak 10 kg setelah umur satu

bulan.

Cekaman Kekeringan dan Pertumbuhan Cabai. Percobaan dilakukan

untuk mengetahui pengaruh cekaman kekeringan terhadap pertumbuhan vegetatif

dan awal pertumbuhan generatif. Percobaan disusun dengan rancangan

lingkungan acak kelompok dan rancangan perlakuan faktorial yang terdiri atas

kondisi lingkungan (optimal dan cekaman kekeringan) dan varietas cabai cv.Tit

Super, Hot Chili, Laris, Prabu, dan Jati Laba. Unit percobaan terdiri dari atas satu

pot plastik yang ditanami satu tanaman. Setiap kombinasi perlakuan diulang 5

kali.

Tanaman dalam kondisi lingkungan optimum diberi air sampai dengan

kapasitas lapang hingga umur 110 hari sesudah tanam (HST). Tanaman dalam

kondisi cekaman kekeringan dipelihara dalam kondisi optimal hingga 21 HST,

perlakuan cekaman kekeringan diberikan setelah muncul gejala layu pada 70%

daun dari masing-masing tanaman pada umur 21 HST hingga 54 HST, dan

dipelihara dalam kondisi optimal hingga berumur 110 HST.

Pengamatan dilakukan terhadap tinggi tanaman, jumlah cabang primer,

diameter batang, panjang dan bobot kering akar, bobot kering tajuk, biomasa,

kandungan prolina, jumlah buah dan bobot buah.

Indeks Sensitivitas terhadap Cekaman. Toleransi cabai terhadap

cekaman kekeringan dinilai dengan indeks kepekaan terhadap cekaman (S)

(Fischer dan Maurer 1978; Riduan et al 2005) dengan rumus: S = (1-Y/Yp)/(1-

X/Xp) , Y = nilai pengamatan untuk satu varietas pada kondisi cekaman

kekeringan, Yp = nilai pengamatan untuk satu varietas pada kondisi optimal, X =

nilai pengamatan untuk semua varietas dalam kondisi cekaman kekeringan, Xp =

nilai pengamatan untuk semua varieras dalam kondisi optimal. Cabai

dikelompokkan menjadi toleran jika S ≤ 0.5; medium jika 0.5 < ISK ≤ 1.00, dan

peka terhadap cekaman kekeringan jika S>1.00.

Kandungan Prolina Total Daun. Kadar prolina daun dianalisis

berdasarkan metode Bates et al. (1973); Sudarsono et al. (2006). Daun (0.2 g)

digerus dan dihomogenasi dengan 10 ml asam sulfosalisilat (3% b/v). Setelah

disentrigugasi dengan kecepatan 5000xg selama 15 menit menggunakan

Eppendorf table top centrifuge, 2 ml supernatan yang didapat direaksikan dengan

2 ml larutan asam ninhidrin 0.14 M (dengan komposisi ninhidrin 1.25 g, asam

asetat glacial serta dipanaskan di atas penangas air hingga suhu 100°C selama 60

menit. Reaksi diakhiri dengan mendinginkan larutan dalam es selama 5 menit.

Hasil reaksi diekstraksi dengan 4 ml toluene (99.5%) sehingga terbentuk

kromoform dan absorbansi kromoformnya diukur dengan spektrofotometer pada

panjang gelombang 520 nm. Sebagai standar digunakan DL-Proline (Sigma)

yang dilarutkan dalam asam sulfosalisilat (3% b/v).

HASIL

Cekaman Kekeringan dan Pertumbuhan Tanaman. Cekaman

kekeringan secara umum berdampak negatif terhadap pertumbuhan cabai. Akibat

pengurangan pemberian air menyebabkan komponen pertumbuhan vegetatif

seperti tinggi tanaman, panjang akar, bobot kering akar, dan bobot kering

tanaman, dan pertumbuhan generatif (jumlah buah dan bobot buah) cabai

menurun dibandingkan pertumbuhan tanaman pada kondisi optimum.

Masing-masing varietas cabai memberikan tanggapan yang berbeda-beda

terhadap kondisi cekaman kekeringan. Penurunan tinggi tanaman yang terbesar

akibat cekaman kekeringan terjadi pada cabai cv. Laris 25.47%, tetapi untuk

tinggi tanaman terjadi pengecualian dimana cabai cv. Tit Super dan Jati Laba

terjadi peningkatan tinggi tanaman masing-masing 1.31% dan 18.49%, untuk

jumlah cabang penurunan yang terbesar terjadi pada cabai cv. Tit Super 23.33%,

pengecualian terjadi pada cabai cv. Laris terjadi peningkatan jumlah cabang

5.50%, panjang akar terjadi penurunan yang terbesar akibat cekaman kekeringan

pada cabai cv. Jati Laba yakni 28.63%, sebaliknya pada cabai cv. Tit Super terjadi

peningkatan panjang akar sebesar 36.99% (Tabel 1).

Tabel 1 Pengaruh cekaman kekeringan pada periode 21 – 54 hari setelah tanam terhadap tinggi tanaman, jumlah cabang, diameter batang, dan panjang akar beberapa genotipe cabai

Lingkungan Peubah dan

Varietas Cabai Optimum* Cekaman

Persentase

Penurunan (%)**

Tinggi Tanaman (cm)

Tit Super 32.00 a 32.42 a -1.31

Hot Chili 30.64 a 28.66 a 6.46

Prabu 29.60 a 25.55 a 13.68

Laris 28.77 a 21.44 a 25.47

Jati Laba 26.33 a 31.20 a -18.49

Jumlah Cabang (buah)

Tit Super 2.70 a 2.07 a 23.33

Hot Chili 2.21 a 2.20 a 0.45

Prabu 2.00 a 2.00 a 0.00

Laris 2.00 a 2.11 a -5.50

Jati Laba 2.13 a 2.00 a 6.10

Diamater Batang (cm)

Tit Super 6.68 a 8.23 a -23.20

Hot Chili 9.06 a 8.77 a 3.20

Prabu 6.59 a 7.46 a -13.20

Laris 7.04 a 6.95 a 1.27

Jati Laba 7.83 a 6.49 a 17.11

Panjang Akar (cm)

Tit Super 26.38 a 36.14 a -36.99

Hot Chili 45.89 a 42.76 a 6.82

Prabu 40.61 a 32.41 a 20.19

Laris 39.58 a 28.71 a 27.46

Jati Laba 48.50 a 34.61 a 28.63

* Untuk masing-masing peubah, huruf yang sama pada baris yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan pada α = 0.05. ** Penurunan=[ (Opt-Cekaman)/Opt] x 100%. Opt=tanaman dalam kondisi optimum, dan Cekaman=tanaman dalam kondisi cekaman kekeringan.

Perlakuan cekaman kekeringan juga berpengaruh negatif terhadap bobot

kering batang dan bobot biomasa total. Bobot kering batang, penurunan yang

terbesar akibat cekaman kekeringan berturut-turut cabai cv. Tit Super 42.57% dan

cabai cv. Jati laba 20.75%. Perlakuan cekaman kekeringan juga berpengaruh

negatif terhadap bobot kering batang dan akar, serta bobot biomasa, juga jumlah

dan bobot buah cabai. Penurunan bobot biomasa masing-masing varietas cabai

berkisar antara 3.71% hingga 44.59%. (Tabel 2).

Tabel 2 Pengaruh cekaman kekeringan pada periode 21 – 54 hari setelah tanam terhadap berat kering batang dan biomasa total beberapa genotipe cabai


Varietas Cabai Optimum* Cekaman Persentase Penurunan (%)**

Bobot Kering Batang (g)

Tit Super 20.93 a 12.02 b 42.57

Hot Chili 34.17 a 29.20 b 14.54

Prabu 25.25 a 22.32 b 11.60

Laris 32.35 a 28.26 b 12.64

Jati Laba 19.56 a 15.50 b 20.75

Bobot Kering Akar (g)

Tit Super 2.14 a 2.75 b -28.03

Hot Chili 5.58 a 4.48 b 19.71

Prabu 4.63 a 3.56 b 23.11

Laris 6.03 a 3.51 b 41.79

Jati Laba 4.77 a 4.08 b 14.46

Bobot Biomassa Total (g)

Tit Super 15.34 a 14.77 b 3.71

Hot Chili 39.75 a 33.68 b 15.27

Prabu 22.35 a 21.06 b 5.77

Laris 31.55 a 25.06 b 20.57

Jati Laba 24.33 a 13.48 b 44.59

* Untuk masing-masing peubah, huruf yang sama pada baris yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan pada α = 0.05. ** Penurunan=[ (Opt-Cekaman)/Opt] x 100%. Opt = tanaman dalam kondisi optimum, dan Cekaman = tanaman dalam kondisi cekaman kekeringan.

Cekaman Kekeringan dan Hasil. Untuk jumlah buah dan bobot buah

per tanaman, penurunannya berkisar antara 27.02% hingga 51.38% dan 25.33%

hingga 52.63%. Penurunan jumlah dan bobot cabai yang terjadi akibat cekaman

kekeringan berbeda nyata dengan kondisi optimum (Tabel 3).

Tabel 3 Pengaruh cekaman kekeringan pada periode 21 – 54 hari sesudah tanam terhadap bobot biomassa total, jumlah dan bobot buah per tanaman beberapa genotipe cabai


Varietas Cabai Optimum* Cekaman

Persentase

Penurunan (%)**

Jumlah Buah per Tanaman (Butir)

Tit Super 12.50 a 8.85 b 29.20

Hot Chili 10.14 a 7.40 b 27.02

Prabu 14.40 a 7.00 b 51.38

Laris 14.33 a 7.00 b 51.15

Jati Laba 10.13 a 8.60 b 15.10

Bobot Buah per Tanaman (g)

Tit Super 83.90 a 62.64 b 25.33

Hot Chili 79.28 a 58.87 b 25.74

Prabu 83.57 a 41.09 b 50.83

Laris 66.55 a 31.52 b 52.63

Jati Laba 90.36 a 47.24 b 47.72

* Untuk masing-masing peubah, huruf yang sama pada baris yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan pada α = 0.05. **Penurunan=[ (OPT-CEKAMAN)/OPT] x 100%. OPT=tanaman dalam kondisi optimum, dan Cekaman = tanaman dalam kondisi cekaman kekeringan.

Respon Genotipe terhadap Cekaman. Indeks kepekaan terhadap

cekaman (S) yang dihitung berdasarkan biomassa total mengindikasikan di

antara lima varietas cabai yang telah diuji bahwa cabai cv. Prabu tergolong

toleran terhadap cekaman kekeringan, sedangkan cabai cv. Tit Super dan Jati

Laba tergolong peka, sebaliknya cabai cv. Hot Chili dan Laris tergolong ke dalam

kelompok medium. Jika indeks kepekaan terhadap cekaman (S) didasarkan pada

jumlah dan bobot buah cabai maka lima varietas cabai yang diuji tidak ada yang

termasuk ke dalam kelompok toleran terhadap cekaman kekeringan hanya

termasuk ke dalam kelompok peka dan medium (Tabel 4).

Tabel 4 Indeks kepekaan terhadap cekaman (S) yang dihitung berdasarkan biomasa total, jumlah dan bobot buah per tanaman beberapa genotipe cabai

Peubah untuk

menghitung nilai S Titi Super Jati Laba Hot Chili Laris Prabu

Biomassa Total 1.17(P)* 1.76(P) 0.88(M) 0.82(M) 0.46 (T)

Jumlah Buah 0.82(M) 0.51(M) 0.69(M) 1.44(P) 1.42 (P)

Bobot Buah 0.70(M) 1.26(P) 0.61(M) 1.27(P) 1.38 (P)

S=nilai indeks kepekaan terhadap cekaman kekeringan.*Huruf dalam kurung menunjukkan pengelompokan toleransi ke dalam toleran (T) jika S≤0.5, medium (M) jika 0.5<S≤ 1, atau peka (P) terhadap cekaman kekeringan jika S > 1

Kandungan Prolina Total Daun. Pada kondisi penyiraman hingga

kapasitas lapang (kondisi non-cekaman) selama penyiraman di rumah kaca

menunjukkan kandungan prolina daun cabai yang lebih rendah dibandingkan

kandungan prolina pada kondisi cekaman. Presentase peningkatan kandungan

prolina daun setelah 6 periode cekaman kekeringan nyata lebih tinggi

dibandingkan daun tanaman dalam kondisi lingkungan optimum (Tabel 5). Cabai

cv. Tit Super dalam kondisi lingkungan cekaman kekeringan mempunyai

presentase peningkatan kandungan prolina daun paling tinggi 646.31%, kemudian

diikuti oleh cabai cv. Hot Chili dan Prabu, masing-masing 436.28% dan 305.06%,

sedangkan presentase peningkatan kandungan prolina daun cabai yang terkecil

ádalah cabai cv. Laris dan Jati Laba masing-masing yaitu 53.89% dan 12.62%

(Tabel 5).

Tabel 5 Kandungan Prolina daun beberapa genotipe cabai pada umur 37 HST pada kondisi tanam optimum dan cekaman kekeringan

Prolina (ug/g daun)

Genotipe Optimum Cekaman Kekeringan

Persentase Peningkatan Prolina (%)

Tit Super 116.43 b* 868.92 a 646.31

Hot Chili 138.57 b 743.12 a 436.28

Prabu 198.06 b 802.28 a 305.06

Laris 180.42 b 277.67 a 53.89

Jati Laba 122.67 b 138.14 a 12.62

* Data rataan pada baris dengan huruf kecil yang sama, tidak berbeda nyata berdasarkan uji LSD pada α = 0.05

PEMBAHASAN

Cekaman kekeringan yang dialami beberapa varietas cabai menyebabkan

komponen pertumbuhan vegetatif seperti tinggi tanaman, panjang akar, bobot

kering akar, dan bobot kering tanaman menurun dibandingkan pertumbuhan

tanaman pada kondisi optimum, kecuali cabai cv. Tit Super dan Jati Laba panjang

akar akibat cekaman kekeringan mengalami pertambahan. Penelitian sebelumnya

mengungkapkan bahwa peningkatan volume dan panjang akar merupakan salah

satu mekanisme tanaman untuk mengatasi cekaman kekeringan (Jones 1981).

Luasnya respons tanaman terhadap cekaman kekeringan, memperlihatkan

bahwa toleransi terhadap cekaman kekeringan dikendalikan secara poligenik dan

terekspresi secara fenotipik melalui adaptasi morfologis dan fisik (Gupta 1997).

Berbagai respons tanaman terhadap cekaman kekeringan seringkali kontradiktif,

sulit diintegrasikan, dan tidak praktis untuk program pemuliaan. Hal tersebut

memperkuat dugaan bahwa karena respon tanaman terhadap cekaman kekeringan

merupakan fenomena kompleks.

Cekaman kekeringan yang dimulai dari fase vegetatif juga berpengaruh

negatif terhadap pertumbuhan generatif (jumlah dan bobot buah) cabai. Cekaman

kekeringan yang dimulai sejak fase vegetatif menghasilkan jumlah dan bobot

buah yang lebih sedikit dibandingkan dengan tanaman cabai yang ditanam dalam

kondisi normal.

Titik kritis pengaruh cekaman kekeringan adalah kelayuan, yaitu suatu

gejala defisit yang terjadi jika besarnya transpirasi melampaui laju penyerapan air

yang dilakukan akar, sehingga dapat mengganggu berbagai proses fisiologi

tanaman. Menurut Bray (1997), tanaman mengalami kelayuan sebagai respons

terhadap defisit air. Besarnya pengaruh kelayuan terhadap pertumbuhan tanaman

sangat tergantung pada jumlah air yang hilang, laju dan lamanya kondisi cekaman.

Air merupakan komponen vital bagi pertumbuhan tanaman karena

berperan langsung dalam proses fisiologi seperti serapan hara, transportasi,

fotosintesis, reaksi biokimia dan tekanan turgor sel (Mundree et al. 2002),

sehingga penurunan jumlah masukan air mengakibatkan terhambatnya

pertumbuhan dan produksi tanaman.

Cekaman kekeringan yang terjadi pada fase vegetatif menghambat

pertumbuhan tanaman dan menurunkan pembelahan dan perpanjangan sel.

Cekaman kekeringan juga menyebabkan terhambatnya aktifitas fotosintesis dan

translokasi fotosintat (Yakushiji et al. 1998; Savin dan Nicolas 1996).

Salah satu mekanisme adaptasi tanaman terhadap cekaman kekeringan

dilakukan dengan mengatur potensial osmotik sel tanamannya (Levitt 1980), yaitu

dengan peningkatan dan akumulasi senyawa organik yang dapat menurunkan

potensial air sel (Sharp 1994). Toleransi tanaman terhadap cekaman kekeringan

juga melibatkan akumulasi senyawa yang dapat melindungi sel dari kerusakan

yang terjadi pada saat potensial air rendah (Jensen et al. 1996). Prolin memegang

peranan penting untuk toleransi terhadap cekaman kekeringan (Kim dan Janick

1991; Pruvot et al. 1996; Nambara et al. 1998; Hanson et al. 1979).

Kandungan prolina daun pada berbagai tanaman tidak berbeda nyata

dalam keadaan optimum. Hal yang sama juga didapatkan pada tanaman cabai.

Hasil analisis kandungan prolina daun cabai cv. Laris dan Jati Laba menunjukkan

bahwa kandungan prolina saat cekaman dan kondisi optimum tidak jauh berbeda.

Parameter kandungan prolina daun cabai ini membuktikan bahwa prolina

merupakan senyawa yang dihasilkan tanaman untuk bisa bertahan dalam kondisi

cekaman kekeringan. Tanaman yang toleran terhadap cekaman kekeringan telah

dilaporkan lebih mampu meningkatkan kandungan prolina daun sebagai salah satu

respons terhadap cekaman kekeringan dibandingkan dengan tanaman yang peka

(Jones et al. 1981; Yoshida et al. 1997). Sudarsono et al. (2006) melaporkan

enam kultivar kacang tanah di Indonesia yang diuji juga menunjukkan

peningkatan akumulasi senyawa prolina sebagai respon terhadap cekaman

kekeringan.

Pada fase pertumbuhan vegetatif, ketersediaan air berpengaruh pada

beberapa aspek fisiologi serta morfologi, antara lain: menurunnya kecepatan

fotosintesis dan luas daun. Jika tanaman terkena cekaman kekeringan, potensial

air daun akan menurun, pembentukan klorofil daun akan terganggu dan struktur

kloroplas akan mengalami disintegrasi (Alberte et al. 1977). Kramer (1983)

menjelaskan lebih lanjut bahwa pengaruh cekaman kekeringan pada pertumbuhan

vegetatif terutama pada perluasan area daun dan pertumbuhan tunas baru dan

nisbah akar-tajuk. Sedangkan pada pertumbuhan reproduktif mengakibatkan

ketidaknormalan pembungaan, aborsi embrio, ketidaknormalan perkembangan biji

dan buah. Tanaman cabai yang mengalami cekaman kekeringan juga

mengakibatkan sebagian besar bunganya berguguran sehingga yang berhasil

membentuk buah sedikit Ditambahkan oleh Sloane et al. (1990) bahwa tanaman

pada fase perkembangan reproduktif sangat peka terhadap cekaman kekeringan.

Kondisi cekaman kekeringan dapat menyebabkan gugurnya bunga, polong dan

biji yang telah terbentuk. Hal ini berhubungan dengan penurunan kecepatan

fotosintesis akibat keterbatasan ketersediaan air. Pada kedelai, cekaman

kekeringan menyebabkan gugurnya bunga dan polong dan menurunkan hasil biji

(Sloane et al. 1990). Pada tanaman cabai kondisi ini juga terjadi sehingga

cekaman kekeringan menurunkan jumlah buah pertanaman sampai 51.38% dan

51.15% masing-masing untuk cabai cv. Prabu dan Laris.

Berdasarkan indeks kepekaan terhadap cekaman menggunakan jumlah

buah pertanaman disimpulkan toleransi cabai varietas Tit Super, Jati Laba dan Hot

Chili tergolong Medium, sedangkan Prabu dan Laris tergolong peka terhadap

cekaman kekeringan pada fase vegetatif sampai generatif. Hasil penelitian ini

sejalan dengan hasil penelitian sebelumnya yang menyatakan bahwa nilai S

berdasarkan bobot kering biji memberikan hasil yang lebih akurat untuk menduga

toleransi tanaman kacang tanah terhadap cekaman kekeringan (Riduan dan

Sudarsono 2004).

SIMPULAN

Dari hasil penelitian yang dilakukan dapat ditarik beberapa simpulan sebagai

berikut:

1. Perlakuan cekaman kekeringan pada fase vegetatif dan generatif beberapa

varietas cabai dapat menurunkan hasil cabai (Tit Super 25.33%, Jati laba

47.72%, Hot Chili 25.74%, Laris 52.63%, dan Prabu 50.83% )

2. Dari kelima varietas cabai yang diuji berdasarkan kandungan prolina daun

dan tanggap tanaman di rumah kaca didapatkan tiga varietas yang toleran

yaitu Prabu, Jati Laba dan Laris, dan dua varietas cabai yang tergolong peka

terhadap kekeringan yaitu Tit Super dan Hot Chili.

IV STUDI REGENERASI BEBERAPA GENOTIPE CABAI (Capsicum annuum L.) SECARA IN VITRO

Abstrak

Perbanyakan cabai secara in vitro dengan menggunakan daun muda telah

dilakukan terhadap 13 varietas cabai. Eksplan dikulturkan pada media induksi kalus yaitu media dasar MS dengan vitamin L2 yang ditambahkan BAP 4 ppm dan IAA 0.5 ppm. Media yang digunakan untuk regenerasi dan perpanjangan sel media MS yang ditambah vitamin L2 , BAP 1 ppm, GA3 2 ppm, Calsium Pantotenat 2 ppm dan AgNO3 5 ppm. Hasil percobaan menunjukkan bahwa pada semua kondisi yang diuji, semua genotipe mampu membentuk kalus, tetapi tidak semua kalus bisa berdifrensiasi membentuk tunas. Diantara 13 varietas cabai yang diuji genotipe yang paling respon terhadap media difrensiasi dan perpanjangan tunas adalah varietas Tit Super. Kata kunci: Capsicum annuum in-vitro, BAP (6-benzylaminopurine), IAA

(indole-3-acetic acid), Calsium Pantotenat, AgNO3

IV REGENERATION STUDY OF SOME HOT CHILLI (Capsicu annum L.) CULTIVAR BY IN VITRO

Abstract

The objective of experiment was to obtain hot chilli that was easily regenerated through in vitro technique. 13 hot chilli varieties were evaluated. In this experiment in vitro bud regeneration of hot chilli was conducted using young leaf. The Explant cultured at induce callus medium of base MS medium enriched with vitamin of L2 enhanced by BAP 4 ppm and IAA 0.5 ppm. Medium for regeneration and elongation of cell was MS medium that added with vitamin L2 , BAP 1 ppm, GA3 2 ppm, Calsium Pantotenat 2 ppm and AgNO3 5 ppm. The result showed that all of the varieties were able to form callus, but not all of callus differentiated new bud. Amongst of 13 hot chilli varieties evaluated, the most responsive to differentiation and bud elongation was Tit Super variety.

Keyword: Capsicum annuum in-vitro, BAP (6-benzylaminopurine), IAA (indole-3-acetic acid), Calsium Pantotenat, AgNO3, direct shoot regeneration

PENDAHULUAN

Studi mengenai prosedur regenerasi in vitro tanaman cabai merah masih

sangat sedikit. Kebanyakan publikasi yang ada umumnya berhubungan dengan

metode regenerasi cabai manis (paperika). Regenerasi pada tanaman cabai

bersifat kultivar spesifik, sehingga metode yang ada pada satu kultivar belum

tentu dapat digunakan untuk kultivar lainnya.

Penelitian perbanyakan secara in vitro pada jenis tanaman cabai manis

telah banyak dilakukan dan dipublikasikan antara lain oleh Fari dan Czako (1981);

Agrawal et al. (1989); Ebida dan Hu (1993); Kato at al. (1996); Hyde dan Phillips

(1996) dan hasilnya dapat dijadikan sebagai acuan. Tiga bagian kecambah

tanaman cabai, yaitu kotiledon, hipokotil dan daun muda umumnya dapat

dijadikan sebagai sumber eksplan oleh para peneliti tersebut.

Di dalam aplikasi bioteknologi atau transformasi genetika untuk program

perbaikan tanaman, kultur sel atau jaringan dan sistem regenerasinya memegang

peranan yang sangat penting. Beberapa usaha yang dilakukan untuk mencapai

sistem regenerasi yang efisien adalah dengan menentukan parameter penting yang


transformasi genetik untuk memperoleh tanaman cabai yang tahan terhadap


Genotipe cabai yang responsif untuk diregerasikan menjadi tanaman yang

lengkap akan diperoleh pada penelitian ini sehingga dapat digunakan untuk

trasnformasi genetik tanaman. Dengan diperolehnya sistem regerasi tanaman

cabai yang efisien maka akan sangat membantu di dalam program perbaikan

tanaman melalui transformasi genetik.

Rekayasa genetika akan memberikan perbaikan dari karakter-karakter

penting pada tanaman. Sifat ketahanan tanaman terhadap beberapa cekaman

biotik seperti gulma, virus, serangga dan mikroorganisme telah dapat diperbaiki

dengan pendekatan ini. Demikian pula terhadap cekaman abiotik dan modifikasi

kualitas dan kuntitas produk tanaman (Bennet 1993). Suatu gen yang tidak

terdapat pada suatu spesies tanaman tertentu dimungkinkan untuk dapat diperoleh

dari organisme lain seperti bakteri, virus, binatang dan tanaman lain (Herman

1996).







tunas dan akar) dan kompetensi untuk ditransformasi merupakan dua kunci

penting penentu keberhasilan program transformasi genetik.

Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari sistem regenerasi beberapa

genotipe cabai secara in vitro yang akan digunakan di dalam program transformasi

genetika untuk memperoleh tanaman cabai tahan kekeringan.

BAHAN DAN METODE Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler Tanaman

(PMB) Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut

Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan bulan Juli 2006 sampai Desember

2006.

Pada percobaan ini digunakan benih dari tiga belas genotipe cabai (cabai

besar Sudra, cabai keriting North Redstyar, cabai rawit Salmon, cabai besar Jati

Laba, Cabai keriting Taro, cabai besar Nenggala, cabai besar Prabu, cabai keriting

Tepon, cabai besar Chili 409, hot pepper Cayane, Tit Super, New Zaland, galur

375, galur 535).

Perkecambahan benih in vitro. Benih cabai disterilkan permukaannya

dalam laminar dengan merendam pada 20% (v/v) larutan Clorox (R) tiga kali

berturut-turut selama 10 menit. Benih dibilas tiga kali dengan air steril dan

direndam 12 jam untuk merangsang perkecambahan. Benih dikecambahkan

secara in vitro pada medium MS (Murashige dan Skoog, 1962), sukrosa (3%), dan

agar (0.8 %) tanpa zat pengatur tumbuh.

Induksi kalus dari eksplan potongan daun. Kecambah berumur 21

hari dikeluarkan dari botol dan diambil daunnya, kemudian dipotong ujung dan

pangkal daun dengan meninggalkan sedikit petiolenya. Eksplan daun muda

tersebut ditanam pada medium induksi kalus [MS + Vit L2 (Thiamin-HCL dan

Pyrodoxine) + BAP 4 mg/L + IAA 0.5 mg/L + Sukrosa 3 g/L dan pH 5.8].

Potongan daun dikulturkan selama 2 minggu pada suhu 22ºC sehingga

membentuk kalus.

Regenerasi tunas. Setelah 2 minggu pada media induksi kalus, eksplan

daun muda yang telah berkalus dipindahkan ke medium regenerasi (MS + Vit L2

+ BAP 1 mg/l + AgNO3 5 mg/L + GA3 2 mg/L dan Kalsium pantotenat 2 mg/L)

dengan permukaan atas menghadap ke atas. Semua kultur dipindahkan ke

medium regenerasi yang baru setiap 2 minggu. Setelah dua minggu kultur berada

pada media regenerasi, kalus dengan warna hijau, kompak dapat dipindahkan ke

medium regenerasi yang baru. Kalus-kalus dengan primordia tunas akan mulai

tumbuh setelah 2 minggu dan segera dipotong menjadi potongan kecil dan

dipindahkan ke media regenerasi yang baru pada botol untuk pemanjangan tunas.

Perakaran tunas. Apabila batang dari tunas berukuran 2-4 cm, tunas

dipisahkan dari kalus dan dipindahkan ke media perakaran (MS + Vit L2 + IAA

0.1 mg/L) pada botol kultur. Potongan kalus dari dasar batang tunas sebisa

mungkin tidak diikutsertakan karena akan mengganggu pembentukan akar.

Tunas-tunas akan membentuk akar dan berkembang selama 2 minggu setelah

dipindahkan ke medium perakaran. Jika tidak berakar, potong kembali tunas dan

dipindahkan ke media perakaran yang baru, kemudian tunas tersebut akan

berakar. Planlet yang terbentuk berukuran sekitar 5 cm siap dipindahkan ke tanah

(aklimatisasi).

Pengamatan dilakukan terhadap masing-masing varietas tanaman cabai

dengan beberapa parameter, yaitu: jumlah eksplan yang membentuk kalus, berat

kalus, diamater kalus,dan jumlah eksplan yang membentuk tunas. Data-data

yang telah diperoleh kemudian dibandingkan untuk setiap varietas untuk melihat

respon regenerasi dari masing-masing varietas dan dapat ditentukan varietas yang

paling responsif untuk regenerasi.

HASIL Pada studi sebelumnya telah diketahui bahwa penggunaan daun muda dari

kecambah cabai yang berumur 21-23 hari merupakan jenis eksplan yang paling

responsif untuk menginduksi kalus dan organogenesis tunas dibandingkan jenis

eksplan yang lain seperti hipokotil dan batang. Mengacu pada penelitian

sebelumnya, pada penelitian ini juga digunakan eksplan daun muda dari

kecambah cabai yang berumur 21 hari setelah tanam yang ditumbuhkan secara in

vitro (Gambar 5). Dari kecambah umur 21 hari tersebut, kemudian daun mudanya

dipotong bagian ujung dan pangkalnya dengan mengikutkan petiole untuk

selanjutnya di tanam pada media induksi kalus.

Gambar 5 a) Bibit cabai umur 21 hari yang ditanam secara in vitro b) Daun muda cabai yang ditanam pada media induksi kalus

Kalus-kalus akan terbentuk pada bagian bekas potongan pada eksplan

setelah berada pada media induksi kalus selama 1 minggu (Gambar 5). Semua

eksplan daun muda dari beberapa genotipes cabai yang digunakan mempunyai

kemampuan membentuk kalus 100%, tapi tidak semua kalus berkembang

membentuk tunas (Tabel 6).

a b

Tabel 6 Persentase pembentukan kalus dan tunas serta persentase tunas yang terbentuk dari beberapa genotipe cabai secara in vitro

No Genotipe Kalus Yang Terbentuk (%)

Tunas Yang terbentuk (%)

1 Cabe besar Sudra 100% 0.49

2 Cabe Keriting (North Redstar) 100% 0.22

3 Rawit Salmon 100% 0.25

4 Cabe besar Jati Laba 100% 0.59

5 Cabe keriting Taro 100% 0.47

6 Cabe besar Prabu 100% 0.39

7 Cabe keriting Topon 100% 0.45

8 Chili 409 100% 0.25

9 535 100% 0.64

10 375 100% 0.22

11 398 100% 0.39

12 NZ 100% 0.15

13 Tit Super 100% 0.90

Sudra North Redstar Rawit Salmon

Jati Laba Topon Chili 409

535 75 NZ

398 TS Jati laba

Gambar 6 Kalus-kalus yang terbentuk dari beberapa varietas dan galur cabai secara in vitro

0

2

4

6

8

10

12

14

Genotipe Sudra NorthRedstar

Rawit Jati laba Taro Prabu Topon Chili 409 535 375 398 NZ

Beberapa Varietas cabai

Har

i Ter

bent

uk K

alus

Tit Super

Gambar 7 Waktu yang diperlukan beberapa varietas cabai untuk membentuk

kalus

Beberapa genotipe yang mempunyai kemampuan membentuk tunas yang

tinggi (Cabai besar Jati Laba, Tit Super, Cabai besar Sudra dan Chili 409), dipilih

untuk penelitian selanjutnya. Kemudian dilakukan perhitungan terhadap berat

kalus, diameter kalus serta panjang tunas yang terbentuk. Disini terlihat bahwa

kalus yang terbentuk tidak semuanya yang berkembang membentuk tunas karena

tidak semua kalus tersebut bersifat organogenik.

Tabel 7 Rata-rata berat kalus, diameter kalus, jumlah tunas dan panjang tunas dari beberapa genotipe cabai yang diinduksi secara in vitro

No Genotipe Rata-rata

Berat Kalus (mg)

Rata-rata Diameter Kalus

(mm)

Jumlah Tunas (buah)

Rata-rata Panjang Tunas

(mm) 1 Jati laba 300 30

2 9.5

2 Tit Super 300 30 8

23

3 Sudra 81 27 5

20.6

4 Chili 409 56 15 0

0

Tabel 7 menunjukkan bahwa kalus dari genotipe Chili 409 paling ringan

sekali, kalus yang terbentuk persentase menghasilkan tunasnya juga sangat kecil

sekali. Untuk kalus-kalus yang organogenik dia mempunyai berat yang lebih besar

dari pada kalus yang non organogenik sebagian besar kalus dari genotipe Chili

409 adalah non organogenik. Semua kalus yang terbentuk hampir sama besar,

karena umur sumber eksplan yang digunakan adalah sama.

y = 17.449x + 118.82R2 = 0.2076

0

50

100

150

200

250

300

350

0 2 4 6 8 10

Jumlah Tunas

Ber

at K

alus

(mg)

Gambar 8 Hubungan antara berat kalus dengan jumlah tunas yang terbentuk

pada beberapa varietas cabai Berat kalus tidak mempunyai hubungan yang nyata dengan jumlah tunas

yang terbentuk (Gambar 8). Karena tidak semua kalus yang terbentuk bisa

berkembang membentuk tunas. Kalus-kalus yang remah yang bisa berdiferensiasi

membentuk tunas. Kalus-kalus yang berwarna kecoklatan (Gambar 9b) tidak

dapat berkembang membentuk tunas, kalus yang berwarna putih kehijauan

(Gambar 9A) yang bisa berkembang membentuk tunas.

Gambar 9 Kalus yang terbentuk dari daun muda setelah 14 hari induksi

(9A) kalus yang berwarna putih yang akan berubah menjadi kehijauan dalam beberapa hari dan kalus ini merupakan kalus organogenik (organogenic callus) (OC)

(9B) kalus yang berwarna coklat merupakan kalus yang tidak dapat diregenerasikan (non-regenerable callus) (NRC)

Ada 2 tipe kalus yang diamati pada penelitian ini, kalus yang berwarna

coklat merupakan kalus yang tidak dapat diregenerasikan (non-regenerable

callus) (NRC) dan kalus yang berwarna putih yang akan berubah menjadi

kehijauan dalam beberapa hari dan kalus ini merupakan kalus organogenik

(organogenic callus) (OC). Kalus organogenik ini akan menghasilkan atau

membentuk primordial-primordia tunas sekitas 15-21 hari (Gambar 9). Untuk

mempercepat pembentukan primordia tunas maka merupakan hal penting untuk

melakukan subkultur kalus-kalus tersebut pada media baru sehingga akan tersedia

nutrisi yang cukup bagi kalus-kalus untuk membentuk primordial tunas.

Gambar 10 Tahapan perkembangan kalus cabai organogenik mulai dari tahap

globular sampai membentuk tunas, (A) – (E) tahapan globular sampai cotiledonary, (F) terbentuknya tunas

9A 9B

9B

A B

D E F

C

Pengamatan dari tahap perkembangan kalus organogenik mulai dari tahap

kalus globular sampai berbentuk kotiledonary dan akhirnya membentuk tunas

dapat dilihat pada Gambar 10.

Persentase jumlah eksplan berkalus yang dapat beregenerasi ditampilkan

pada Tabel 6. Dari Tabel 6 terlihat bahwa kemampuan eksplan membentuk

primordia tunas yang tinggi ditunjukkan oleh genotipe Tit Super, dibandingkan

genotipe-genotipe lain. Eksplan yang berasal dari daun muda dari semua genotipe

cabai yang digunakan mempunyai kemampuan untuk membentuk kalus 100%

setelah ditumbuhkan pada media induksi kalus (Tabel 6). Bahkan diantara

eksplan-eksplan yang berkalus tersebut terdapat eksplan yang telah berinisiasi

membentuk primordia tunas. Primordia tunas ditandai dengan munculnya

jaringan seperti daun yang berukuran kecil dan akan berkembang menjadi tunas

kecil. Selanjutnya kalus-kalus dengan primordial tunas ini dipindahkan ke media

regenerasi untuk mendorong kalus berkembang dan membentuk tunas yang lebih

besar.

Setelah di media induksi kalus selama 2 minggu kemudian disubkultur,

eksplan yang berkalus dan membentuk primordial tunas dipindahkan ke media

regenerasi sehingga primordial tunas dapat berkembang menjadi tunas. Setelah

beberapa hari dalam media regenerasi maka primordial akan terlihat membesar

dan berkembang membentuk tunas dengan bagian daun yang lengkap.

Gambar 11 Tunas yang berkembang dalam media perpanjangan tunas (A) tunas

yang abnormal, dimana tidak menghasilkan batang, (B) tunas yang normal yang dapat berkembang membentuk batang (C) tunas dalam media perakaran

Respon dari genotipe cabai untuk beregenerasi ditandai dengan

kemampuan eksplan dari genotipe tersebut untuk membentuk tunas dengan bagian

BA C

Batang

daun dan batang. Ada dua jenis tunas yang dapat diamati pada media regenerasi,

yaitu; (1) tunas yang mempunyai daun dan batang, dan (2) tunas yang hanya

punya daun saja tanpa batang (rosset daun). Tunas yang dapat dipindahkan ke

media perakaran adalah tunas yang mempunyai bagian daun dan batang

sedangkan tunas yang abnormal dimana tunas tersebut bagian batangnya tidak

berkembang dengan baik tidak bisa dipindahkan ke media perakaran, sebab bila

dipindahkan ke media perakaran akan sulit membentuk akar bahkan tidak bisa

membentuk akar sama sekali. Untuk menginduksi terbentuknya akar maka tunas-

tunas yang terbentuk pada media regenerasi kemudian dipisahkan dari

kalus/eksplan dan kemudian dipindahkan ke media perakaran (Gambar 11 C).

PEMBAHASAN

Berdasarkan serangkaian percobaan di atas tiga bagian kecambah cabai,

yaitu hipokotil, kotiledon dan daun muda yang umumnya digunakan sebagai

sumber eksplan oleh para peneliti, ternyata induksi tunas dari beberapa genotipe

cabai di atas dapat dikatakan bahwa eksplan daun muda mempunyai potensi yang

besar dalam membentuk tunas secara in vitro. Perbedaan respon eksplan terutama

disebabkan karena perbedaan genotipe.

Teori totipotensi yang dikemukakan oleh Schleiden dan Schwann

merupakan dasar dari kultur jaringan. Teori tersebut menyatakan bahwa setiap sel

tanaman memiliki informasi genetika lengkap sehingga mampu beregenerasi

membentuk tanaman lengkap bila ditumbuhkan dalam lingkungan yang sesuai

(Pierik 1987). George dan Sherington (1984) menyatakan bahwa keberhasilan

perbanyakan tanaman dengan metode kultur jaringan dipengaruhi banyak faktor

antara lain: sifat genetika tanaman, pemilihan bagian tanaman yang digunakan

sebagai sumber eksplan, umur eksplan, komposisi media tumbuh, zat pengatur

tumbuh, dan lingkungan kultur (Watimena 1992).

Terbatasnya informasi tentang regenerasi langsung atau organogenesis

tanaman cabai merah merupakan salah satu indikasi sulitnya tanaman ini untuk

diregenerasikan secara in vitro. Informasi yang ada umumnya merupakan hasil

penelitian terhadap cabai manis atau paperika (sweet papper), sehingga penelitian

yang dilakukan terhadap cabai merah banyak mengacu kepada hasil penelitian

regenerasi tanaman cabai manis.

Kultur in vitro pada cabai dapat digunakan untuk aplikasi bioteknologi

yang berbeda seperti misalnya propagasi klonal, produksi tanaman bebas virus.

Pada penelitian ini dapat diamati bahwa semua varietas dan galur cabai yang

digunakan mempunyai kemampuan untuk membentuk kalus pada media induksi

kalus (Tabel 6 dan Gambar 6), kalus yang terbentuk tidak semuanya yang

organogenik. Di sini terdapat adanya perbedaan yang nyata di dalam kemampuan

regenerasi di antara 13 genotipe cabai yang digunakan, yang ditandai dengan

adanya perbedaan dalam jumlah eksplan yang membentuk primordia tunas,

eksplan yang beregenerasi membentuk tunas dan jumlah tunas per eksplan.

Kalus-kalus yang organogenik akan mengalami beberapa fase

perkembangan sampai menghasilkan tunas. Fase tersebut dimulai dari kondisi

kalus dalam bentuk globular, kemudian heart, torpedo, sampai pada fase akhir

kotiledonary dan akhirnya baru membentuk tunas (Gambar 10). Sementara kalus-

kalus yang bukan organogenik akan selalu dalam fase globular.

Waktu yang diperlukan untuk membentuk kalus untuk semua varietas

hampir sama dalam jangka 7 sampai 12 hari setelah induksi (Gambar 7). Waktu

bukan faktor yang menentukan dalam pembentukan kalus, tapi faktor yang sangat

menentukan dalam permbentukan kalus adalah genotipe, tipe eksplan dan

komposisi media, seperti yang telah dilaporkan sebelumnya, bahwa paling tidak

ada tiga faktor penting yang sangat berpengaruh di dalam sistem regenerasi

tanaman secara in vitro. Faktor-faktor tersebut adalah genotipe, tipe eksplan dan

komposisi media (Moghaieb et al, 1999; Gubis et al. 2003).

Kalus-kalus yang terbentuk tidak semuanya berkembang membentuk

tunas, karena tanggapan masing-masing genetik tanaman tidak sama terhadap

media yang sama untuk membentuk tunas. Hal ini sama seperti yang dilaporkan

sebelumnya bahwa eksplan daun muda dan hipokotil mempunyai potensi yang

sama dalam kapasitasnya untuk membentuk tunas secara in vitro. Perbedaan

respon terutama disebabkan oleh perbedaan genotip tanaman (Mahmood et al.,

1996).

Respon dari genotipe cabai untuk beregenerasi ditandai dengan

kemampuan eksplan dari genotipe tersebut untuk membentuk tunas dengan bagian

daun dan batang. Ada dua jenis tunas yang dapat diamati pada media regenerasi,

yaitu (1) tunas yang mempunyai daun dan batang, dan (2) tunas yang hanya punya

daun saja tanpa batang (rosset daun). Tunas yang dapat dipindahkan ke media

perakaran adalah tunas yang mempunyai bagian daun dan batang sedangkan

tunas yang abnormal dimana tunas tersebut bagian batangnya tidak berkembang

dengan baik tidak bisa dipindahkan ke media perakaran, sebab bila dipindahkan

ke media perakaran akan sulit membentuk akar (Gambar 11).

Genotipe Tit Super yang digunakan sebagai kontrol pada penelitian ini

menunjukkan respon yang paling tinggi. Dengan demikian, untuk tujuan rekayasa

genetika atau transformasi genetika cabai dimana salah satunya untuk merakit

tanaman cabai transgenik tahan kekeringan, maka Tit Super dapat digunakan

untuk tujuan tersebut.

SIMPULAN

Dari tiga belas genotipe cabai yang beradaptasi di Indonesia, Tit Super

mempunyai respon yang terbaik di dalam regenerasi tanaman cabai secara in vitro

bila dibandingkan dengan genotipe lanilla.

Untuk tujuan rekayasa genetika, Tit Super dapat digunakan sebagai

materi/eksplan untuk transformasi genetika cabai dengan menggunakan daun

mudanya.

V INTRODUKSI GEN P5CS KE DALAM GENOM CABAI DENGAN BANTUAN AGROBACTERIUM DAN

EKSPRESINYA TERHADAP CEKAMAN AKIBAT PEMBERIAN PEG

Abstrak

Tujuan penelitian ini adalah: (1) meregenerasikan cabai cv. Tit Super transgenik yang mengintegrasikan gen kimera P5CS dengan bantuan Agrobacterium, (2) menganalisis integrasi gen kimera P5CS pada genom cabai Tit Super transgenik P5CS menggunakan teknik total nucleic acid PCR, (3) menganalisis akumulasi prolina pada daun cabai transgenik P5CS. Hasil percobaan menunjukkan, transformasi genetika dengan bantuan Agrobacterium berhasil mengintroduksikan gen kimera P5CS ke dalam genom cabai. Transformasi dengan bantuan Agrobacterium berhasil meregenerasi-kan 67 nomor calon cabai transgenik P5CS generasi R0 yang resisten terhadap antibiotika kanamisin. Pengujian ekspresi gen P5CS pada cabai transgenik Tit Super dengan perendaman dalam larutan PEG 15% menunjukkan peningkatan prolina total daun yang tinggi di bandingkan dengan tanaman kontrol.

Kata kunci: Transformasi dengan Agrobacterium, total nucleic acid PCR,

akumulasi prolina, polyethylene glycol (PEG)

V INTRODUCTION OF P5CS GENE BY AGROBACTERIUM AND TOLERANCE OF TRANSGENIC HOT CHILI

EXPRESSING P5CS GENE AGAINST STRESS DUE TO POLYETHYLENE GLYKOL (PEG)

Abstract

The objectives of this experiment were to (1) regenerate of transgenic chilli cv. Tit Super constitutively expressing P5CS transgene through Agrobacterium, (2) analyze integration of P5CS transgene in the genome of transgenic chilli by total nucleic acid PCR, (3) analyze proline accumulation in leaf tissues of the transgenic chilli. There were 67 transgenic line but only 5 transgenic line were positive based on total nucleic acid PCR testing. The transgenic line also accumulate higher proline than control plant under drought stress which induced by Poly Ethylene Glicol (PEG) 15%. Keyword: Transgenic, Agrobacterium-mediated transformation, P5CS transgene,

proline content, Polyethylene Glycol

PENDAHULUAN

Rekayasa genetika tanaman cabai merah (Capsicum annuum L.) sampai

sekarang masih relatif sulit dilakukan. Hal ini terbukti dari sedikitnya publikasi

tentang rekayasa genetika tanaman cabai merah (Hot pepper) di berbagai jurnal.

Hal ini berkorelasi dengan belum tersedianya metode yang efisien untuk

regenerasi tunas secara in vitro, dan sulitnya meregenerasikan eksplan hasil

inokulasi Agrobacterium.

Rekayasa genetika merupakan salah satu alternatif metode untuk

perbaikan genetika tanaman. Pemanfaatan rekayasa genetika untuk perbaikan

beberapa sifat tertentu telah dilakukan hingga tahapan komersialisasi dan

produknya dinyatakan aman terhadap lingkungan dan aman sebagai bahan pangan

(Conner 1997).

Salah satu program pemuliaan cabai adalah mendapatkan tanaman cabai

toleran kekeringan. Rekayasa genetika cabai untuk sifat tahan terhadap

kekeringan dapat dilakukan dengan menstransfer gen P5CS melalui

Agrobacterium tumefaciens. Kavi Kishor et al. (1995) melaporkan bahwa gen

yang diperoleh dari tanaman Vigna aconitifolia, terbukti dapat meningkatkan

ekspresi ketahanan terhadap kekeringan dan salinitas tinggi pada tanaman

tembakau.

Penggunaan seleksi in vitro untuk mendapatkan plasma nutfah cabai yang

toleran cekaman kekeringan memerlukan tersedianya teknik kutur jaringan yang

efektif untuk menghasilkan tanaman dalam jumlah banyak. Selain itu, selective

agent yang dapat menapis sel/jaringan dengan sifat toleran diantara sel/jaringan

yang peka cekaman perlu tersedia. Manitol, sorbitol, garam, dan polietilena glikol

(PEG) telah digunakan sebagai bahan penyeleksi dalam seleksi in vitro untuk

toleransi terhadap cekaman kekeringan (Dami dan Huges 1997).

Senyawa PEG merupakan senyawa yang dapat menurunkan potensial

osmotik larutan melalui aktivitas matrik sub-unit etilena oksida yang mampu

mengikat molekul air dengan ikatan hidrogen. Penyiraman larutan PEG ke dalam

media tanam diharapkan dapat menciptakan kondisi cekaman karena ketersediaan

air bagi tanaman menjadi berkurang.

Kekeringan mengakibatkan cekaman osmotik pada tanaman yaitu

mengurangi aktivitas air dan menyebabkan hilangnya turgor sel. Tanaman

mempertahankan turgor sel dengan menjaga keseimbangan antara besaran laju

transpirasi oleh daun dan penyerapan air oleh akar. Pada kondisi stres kekeringan,

laju transpirasi lebih besar dari laju penyerapan air sehingga terjadi defisit

kandungan air pada jaringan tanaman. Hal tersebut dapat memicu berbagai

respon fisiologi dan biokimia untuk mengatasi stres (Yamaguchi-Shinozaki dan

Shinozaki 1994).

Stres kekeringan pada tanaman mempengaruhi mekanisme biokimia dan

fisiologi antara lain menurunkan kecepatan fiksasi dan akumulasi N (Masyudi dan

Peterson 1991), transfortasi fotosintat dan transpirasi (Pookpadi et al. 1990; Vieira

et al. 1992), dan kecepatan fotosintesis (Loggini et al. 1999). Sebelumnya

Yancey et al. (1982) menyatakan bahwa terjadinya peningkatan akumulasi

senyawa organik yang mudah larut dalam air (senyawa osmolit atau

osmoprotektan) merupakan salah satu bentuk respons fisiologi tanaman akibat

stres kekeringan. Akumulasi senyawa yang berfungsi sebagai osmoprotektan

dalam kondisi stres kekeringan melindungi berbagai proses fisiologi dan struktur

seluler melalui mekanisme osmotic adjustment (pengaturan tekanan osmotik)

yang berfungsi menstabilkan struktur makromolekul dan mekanisme

osmoprotektan (perlindungan osmotik) yang berfungsi menjaga integritas

membran sel dalam kondisi stres kekeringan (Yancey et al. 1982; Crowe et al.

1987; Potts 1994). Senyawa prolina merupakan salah satu senyawa asam amino

yang berfungsi dalam mekanisme osmotic adjustment (Yancey et al. 1982;

Mc.Cue dan Hanson 1990).

Prolina yang terakumulasi di dalam sitoplasma berperan memelihara

keseimbangan air antara vakuola, sitoplasma dengan lingkungannya (Yang dan

Kao 1999). Sebelumnya Levitt (1980) menyatakan peranan prolina tidak hanya

terbatas pada penyesuaian osmotik yang terkait dengan status air, tetapi juga

mempunyai peranan lain seperti menetralisir pengaruh toksik NH3 hasil hidrolisis

protein, sebagai sumber energi dan sumber N bagi pemulihan proses fisiologis

tanaman pasca stres kekeringan.

Pada tanaman tingkat tinggi, prolina disintesis melalui lintasan asam

glutamin dan ornitin. Lintasan dari glutamin merupakan rute primer untuk

biosintesis prolina dalam kondisi stres kekeringan (Madan et al. 1995; Yoshiba et

al. 1997). Prolina disintesis dari glutamin melalui dua senyawa intermediet yaitu

glutamin semialdehyde (GSA) dan Pyrroline-5-carboxylate (P5C). Ada dua

enzim yang berperan dalam biosintesis prolina yaitu P5C synthetase (P5CS) pada

step awal dan P5C reductase (P5CR) pada step kedua.

Biosentesis prolina melalui jalur glutamat pada tanaman dikatalisis oleh

enzim penentu P5CS. Analisis fungsional ekspresi gen P5CS dan evaluasi

akumulasi prolina pada jaringan tanaman dapat dilakukan dengan

mengintegrasikan gen P5CS ke dalam genom tanaman dan meregenerasikan

tanaman transgenik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tembakau transgenik

yang mengintegrasikan dan mengekspresikan gen kimera P5CS (terdiri dari

promoter konstitutif yang berasal dari gen CaMV 35S serta unit transkripsi dan

terminator yang berasal dari gen P5CS meningkatkan akumulasi prolina pada

jaringannya (Kavi Kishor et al. 1995).

Secara umum, percobaan ini bertujuan untuk meregenerasikan cabai

transgenik yang mengintegrasikan gen kimera P5CS dan menguji ekspresi

transgene dengan mengevaluasi peningkatan kandungan prolina daun. Secara

khusus, tujuan penelitian ini adalah: (1) meregenerasikan cabai varietas Tit Super

transgenik yang mengintegrasikan gen kimera P5CS dengan bantuan

Agrobacterium, (2) menganalisis integrasi gen kimera P5CS pada genom cabai Tit

Super transgenik menggunakan teknik total nuclei acid PCR, (3) menganalisis

akumulasi prolina pada daun cabai transgenik.

BAHAN DAN METODE

Berdasarkan pada penelitian sebelumnya yaitu studi regenerasi beberapa

varietas cabai secara in vitro, maka ditetapkan varietas cabai Tit Super yang

digunakan untuk penelitian introduksi gen P5CS ke dalam genom cabai guna

mendapatkan calon tanaman transgenik yang tahan untuk kondisi cekaman

kekeringan.

Penyiapan kultur Agrobacterium dan eksplan cabai. Keberadaan

plasmid pBI-P5CS dalam sel Agrobacterium dianalisis dengan polymerase chain

reaction (PCR). Plasmid pBI-P5CS diisolasi dari sel Agrobacterium

menggunakan metode yang dikembangkan oleh Hoykaas (1988). Plasmid pBI-

P5CS yang didapat juga digunakan sebagai templat untuk PCR menggunakan

sepasang primer spesifik P5CS (primer forward: 5’-cgggggttcatgaaggacg-3’ dan

primer reverse: 5’-gaatcgttaaacattgtggacc-3’). Komponen reagensia untuk reaksi

PCR terdiri atas 2.5 μl bufer PCR 10x, 0.5 μl dNTP 10 mM, 1 μl masing-masing

pasangan primer forward dan reverse 50 ng/μl, 0.2 μl ensim Taq polimerase 2

U/μl, dan 9.8 μl ddH2O. Reaksi PCR dilakukan selama 35 siklus dan masing-

masing siklus dengan tahapan sebagai berikut: denaturasi DNA pada suhu 94oC

selama 1 menit, primer annealing pada suhu 55oC selama 1 menit, dan ekstensi

primer pada suhu 72oC selama 3 menit. Hasil PCR dipisahkan menggunakan

elektroforesis gel agarosa dalam 0.5x larutan penyangga tris-EDTA (TBE) dan

tegangan 50V selama 1 jam. Setelah diwarnai dengan etidum bromida, gel agarosa

difoto dan didokumentasikan.

Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 yang telah terbukti positif

membawa plasmid biner pBI-P5CS disegarkan dalam medium Luria Broth (LB)

dengan penambahan antibiotika kanamisin 100 mg/l, rifampicin 20 mg/l, dan

agar-agar 8 g/l. Kultur bakteri ditumbuhkan dalam ruang tumbuh bersuhu 28oC

selama dua hari. Koloni tunggal yang didapat selanjutnya diinokulasikan ke dalam

medium LB cair (100 ml) dengan penambahan antibiotika kanamisin 100 mg/l

dan rifampicin 20 mg/l, dikocok menggunakan shaker berkecepatan 100 rpm

selama 24 jam, dan suspensi bakteri dipanen dengan sentrifugasi. Endapan bakteri

dicuci dua kali dengan medium MS (Murashige dan Skoog, 1962) tanpa

penambahan agar-agar (MS cair) dan diresuspensikan dalam medium MS cair

dengan penambahan antibiotika rifampicin 20 mg/l. Kerapatan bakteri di ukur

dengan spektrofotometer dan kerapatan yang diinginkan diperoleh dengan

pengenceran suspensi stok hingga mencapai nilai OD=1 (setara dengan kerapatan

bakteri 109 sel/ml) menggunakan medium MS0 cair.

Gambar 12 Peta konstruksi plasmid biner pBI-P5CS yang membawa gen kimera P5CS, gen marker NPTII, dan gen marker GUS pada struktur T-DNA. Lokasi situs pemotongan oleh ensim restriksi pada T-DNA ditunjukkan dengan angka dan identitas ensimnya (Kavi Kishor et al. 1995).

Eksplan daun cabai disiapkan secara in vitro dengan mengecambahkan

benih cabai var.Tit Super yang telah disterilkan tiga kali berturut-turut dalam

Clorox (20% v/v) selama 10 menit dan dibilas tiga kali dengan air steril untuk

menghilangkan larutan sterilan. Benih steril direndam dalam air steril selama 12

jam. Bibit cabai ditumbuhkan dalam medium MS0 selama 21 hari dan daun muda

yang telah membuka sempurna digunakan sebagai sumber eksplan.

pBI-P5CS

T-DNA

Ori

Vir region

Media dasar yang digunakan untuk mengkulturkan eksplan tersusun dari

garam makro, mikro dan senyawa organik sesuai dengan media MS, vitamin L2 (1

mg/l), glukosa (3%), agar-agar (8 g/l). Media diatur pH-nya sehingga mencapai

5.8 dan disterilkan dalam otoklaf dengan pemanasan 121 °C dan tekanan 121 psi

selama 18 menit.

Untuk media regenerasi I (media MSR-I), ke dalam media dasar

ditambahkan BAP (4 mg/l) dan IAA (0.25 mg/l). Media MSR-I digunakan dalam

perlakuan pre-kultur, kokultivasi, dan dalam proses induksi pembentukan tunas

dari eksplan. Jika telah terinduksi membentuk tunas pada media MSR-I,

selanjutnya eksplan disubkultur dalam media pemanjangan tunas (MSR-II) yang

tersusun dari media dasar dengan penambahan BAP (1 mg/l), GA3 (2 mg/l),

AgNO3 (5 mg/l), dan kalsium pantotenat (2 mg/l).

Kokultivasi dan Pemeliharaan Kultur. Eksplan daun muda diperoleh

dengan memotong kedua ujungnya (dibuang), dan lembaran daun kemudian

dipotong dua secara transversal. Pada percobaan pre-kultur eksplan daun muda

ditanam dalam media MSR-I selama sembilan hari.

Introduksi gen kimera P5CS ke dalam genom cabai Tit Super dilakukan

dengan cara merendam eksplan di dalam suspensi Agrobacterium selama 15

menit. Kemudian eksplan dikokultivasi dengan cara menanam eksplan dan

bakterinya tanpa antibiotik selama 24 jam. Selanjutnya eksplan dicuci dengan

aqua steril dan dibilas dengan MSO cair yang diberi antibiotik cefotaxime [500

mg/l]. Eksplan ditiriskan di atas tisue steril, kemudian ditanam dalam media

MSR-I yang telah ditambahkan antibiotik cefotaxime sampai tunas berukuran 1

cm. Selanjutnya eksplan disubkultur ke dalam media seleksi (media MSR-II

dengan penambahan antibiotik kanamycin [50 mg/l] dan cefotaxime [500 mg/l].

Antibiotik kanamaycin ditambahkan untuk menekan pertumbuhan sel tanaman

asal sehingga sel transgenik dapat tumbuh dan dibedakan dari sel yang lain.

Dalam hal ini sel tanaman asal akan mati (peka terhadap kanamaycin = KanS),

sedangkan sel transgenik akan tetap hidup (tahan kanamyacin = KanR ).

Antibiotik cefotaxime ditambahkan untuk membunuh isolat Agrobacterium.

Eksplan disubkultur ke dalam media seleksi yang masih segar setiap 14 hari

sekali. Setiap eksplan yang berhasil membentuk tunas dalam media MSR-II

kemudian dipindahkan ke dalam media perkaran yang terdiri dari MSO ditambah

IAA 0.1 mg/l.

Semua kultur in vitro diinkubasi dalam ruang kultur dengan intensitas

penyinaran 1000-1500 lux selama 24 jam. Suhu ruangan diatur sehingga berkisar

antara 20-28°C.

Analisis total nucleic acid PCR untuk gen P5CS. Keberadaan gen P5CS

pada genom masing-masing calon cabai transgenik R0 hasil transformasi genetika

dianalisis menggunakan total nucleic acid PCR dengan primer spesifik untuk gen

nptII. Total genom tanaman cabai diisolasi dari daun menggunakan metode CTAB

yang dikembangkan oleh Graham et al. (1994) dan digunakan sebagai templat

untuk PCR. Komponen reagensia dan tahapan PCR yang dilakukan sebagaimana

yang telah disebutkan sebelumnya. Amplifikasi PCR dengan primer spesifik nptII

menghasilkan produk amplifikasi berupa potongan DNA berukuran 250 bp.

Reaksi PCR menggunakan plasmid pBI-P5CS digunakan sebagai kontrol (+),

sedangkan reaksi PCR dengan genom tanaman non-transgenik sebagai templat

dan reaksi PCR tanpa templat DNA masing-masing digunakan sebagai dua

kontrol (-). Hasil total nucleic acid PCR dipisahkan menggunakan elektroforesis

gel agarosa sebagaimana dijelaskan di bagian sebelumnya.

Toleransi cabai transgenik yang mengekspresikan gen P5CS terhadap

cekaman kekeringan dengan pemberian PEG. Planlet cabai transgenik yang

telah lulus seleksi media yang mengandung kanamisin dan yang menunjukkan

hasil positif dari hasil analisis PCR dengan gen nptII serta tanaman kontrol,

ditanam dalam media MS cair dengan penambahan BAP (1 mg/l), GA3 (2 mg/l),

AgNO3 (5 mg/l), dan kalsium pantotenat (2 mg/l) serta PEG 0 dan 15% setara

dengan potensil osmotik 0 dan -0.41 MPa (Michel dan Kaufmann 1973). Setelah

10 hari perlakuan perendaman dalam larutan PEG tersebut kemudian dilakukan

pengukuran kandungan prolina total daun. Kandungan prolina daun dianalisis

berdasarkan metode Bates et al. (1973); Sudarsono et al. (2006) Daun (0.2g)

digerus dan dihomogenasi dengan 10 ml asam sulfosalisilat (3% b/v). Setelah

disentrigugasi dengan kecepatan 5000xg selama 15 menit menggunakan

Eppendorf table top centrifuge, 2 ml supernatan yang didapat direaksikan dengan

2 ml larutan asam ninhidrin 0.14 M (dengan komposisi ninhidrin 1.25 g, asam

asetat glacial serta dipanaskan di atas penangas air hingga suhu 100°C selama 60

menit. Reaksi diakhiri dengan mendinginkan larutan dalam es selama 5 menit.

Hasil reaksi diekstraksi dengan 4 ml toluene (99.5%) sehingga terbentuk

kromoform dan absorbansi kromoformnya diukur dengan spektrofotometer pada

panjang gelombang 520 nm. Sebagai standar digunakan DL-Proline (Sigma)

yang dilarutkan dalam asam sulfosalisilat (3% b/v).

HASIL

Transformasi gen P5CS dan regenerasi tanaman cabai transgenik.

Introduksi gen P5CS ke genom cabai melalui transformasi genetika dengan

bantuan Agrobacteriun terpilih telah dilakukan tiga kali. Dua dari tiga kali

transformasi genetika yang dilakukan tidak menghasilkan tunas yang KanR.

Tunas tersebut gagal membentuk planlet karena kontaminasi atau mati pada media

seleksi Kanamaycin [100 mg/l]. Transformasi genetika yang ke-3 (Tabel 8)

berhasil diperoleh 145 tunas yang KanR. Dari 145 tunas yang didapat berhasil

diperoleh 67 planlet. A. tumefaciens yang digunakan dalam transformasi genetika

telah diuji positif membawa plasmid pBI-P5CS berdasarkan hasil PCR.

Amplifikasi bagian dari gen kimera P5CS dengan teknik PCR menggunakan

primer spesifik untuk gen nptII menghasilkan potongan DNA hasil amplifikasi

dengan ukuran 250 bp (Gambar 13)

Gambar 13 Hasil total nucleic acid PCR untuk mendeteksi integrasi gen P5CS: dalam genom cabai transgenik dengan marker nptII Keterangan: 1 = cv. Tit Super kontrol, 2 sampai 30 = cv.Tit Super transforman. Tabel 8 Perkembangan jaringan daun cabai var. Tit Super dalam berbagai

tahapan transformasi genetika dengan bantuan Agrobacterium hingga menjadi tanaman transgenik. Transformasi genetika untuk mengintroduksikan gen P5CS dengan bantuan Agrobacterium dilakukan sebanyak empat eksperimen.

Hasil transformasi dengan Agrobacterium: No. exp. Jumlah

eksplan Tunas Planlet Tanaman Tanaman

berbiji 1. 200 - - *) - - 2. 300 - - - - 3. 250 145 67 - -

Total 750

P** - 58% 26.8% - - Keterangan: *[-] Terkontaminasi dan tidak lolos seleksi kanamaycin [100mg/l)

sehingga tidak dapat diperoleh tunas dan planlet. **P adalah persentase terhadap total jumlah eksplan, dihitung dengan rumus P=(jumlah respons/jumlah eksplan)x100%.

Produk PCR NptII 250 bp

Produk PCR NptII 250 bp

Gambar 14 Perkembangan eksplan daun muda cabai var Tit Super dalam tahapan transformasi dengan bantuan Agrobacterium (A1) Prekultur eksplan daun muda cabai var Tit Super dalam media MSR-I, (A2) Kokultivasi eksplan daun muda cabai var Tit Super dalam mdia MSR-I, (B1dan B2) Respon tunas cabai var Tit Super yang resisten dan sensitif terhadap kanamaycin dalam media MSR-II, (C1 dan C2) Planlet cabai var. Tit Super transgenik dalam media perakaran.

A1 A2

B1 B2

C1 C2

Ekspresi gen P5CS pada planlet cabai. Ekspresi gen P5CS pada

tanaman cabai transgenik diketahui berdasarkan analisa kandungan prolina total

daun. Kandungan prolina total daun cabai baik kontrol maupun cabai transgenik

setelah perendaman dengan larutan PEG 15% selama 10 hari dapat dilihat seperti

yang terdapat pada Gambar 15 dan Tabel 9, terlihat bahwa tanaman cabai

transgenik yang diduga mengandung gen P5CS setelah perendaman dengan PEG

selama 10 hari menunjukkan peningkatan kandungan prolina total daun yang

sangat tinggi dibandingkan dengan tanaman kontrol. Tanaman kontrol yang

direndam dalam PEG 15% selama 10 hari menyebabkan organ daunnya mati

hampir seluruh sel-sel pada lamina (helaian daunnya) mati, sehingga kandungan

prolina daunnya mengalami penurunan dibandingan dengan kandungan prolina

dengan perendaman PEG 0%, sedangkan daun tanaman cabai transgenik yang

direndam dalam larutan PEG 15% selama 10 hari masih tetap hijau dan segar,

jaringan daun cuma mengalami kematian sel-selnya di pangkal petiolus saja

(Gambar 15). Cabai transgenik P5CS dapat bertahan hidup pada kondisi cekaman

kekeringan dengan adanya over produksi prolina yang merupakan salah satu

senyawa yang bersifat osmopektan yang berguna untuk mejaga turgor sel tetap

dalam keadaan yang normal, sedangkan tanaman cabai yang non transgenic

daunnya mengalami kematian dalam kondisi cekaman kekeringan yang diberi

perlakuan PEG, karena senyawa prolina yang dimilikinya secara alami tidak bisa

menjaga turgor selnya akibat cekaman kekeringan tersebut, sehingga

menyebabkan air akan tertarik ke luar dari sel daun, akhirnya sel-sel daun akan

mati.

Gambar 15 Penampilan daun regeneran cabai cv Tit Super yang direndam dalam larutan PEG 15% selama 10 hari secara in vitro (A) Kontrol dan (B) Transgenik P5CS

A B

02000400060008000

1000012000140001600018000

K (PEG0%)

TS 32(PEG0%)

TS 11(PEG0%)

TS 29(PEG0%)

K(PEG15%)

TS 29(PEG15%)

TS 20(PEG15%)

TS 11(PEG15%)

TS 9(PEG15%)

GENOTIPE CABAI

PRO

LINA

DA

UN

Gambar 16 Pengaruh perendaman PEG 0 dan 15% selama periode 10 hari secara in vitro terhadap kandungan prolina total daun tanaman cabai kontrol dan transgenik R0. Keterangan : K = tanaman cabai Tit Super non transgenic, TS = tanaman cabai Tit Super transgenik

0

500

1000

1500

2000

2500

K ( PEG 0%) TS 32 (PEG0%)

TS 11 (PEG0%)

TS 29 (PEG0%)

GENOTIPE CABAI

PRO

LINA D

AUN

02000400060008000

1000012000140001600018000

K (PEG15%)

TS 29 (PEG15%)

TS 20 (PEG15%)

TS 11 (PEG15%)

TS 9 (PEG15%)

GENOTIPE CABAI

PR

OLI

NA

DA

UN

Gambar 17 (A) Distribusi kandungan prolina total daun cabai transgenik R0 dan

non transgenik dalam kondisi optimum, (B) Distribuís kandungan prolina total daun cabai transgenik R0 dan non tansgenik dalam kondisi cekaman dengan perendaman PEG 15% selama 10 hari. Keterangan : K = tanaman cabai Tit Super non transgenic, TS = tanaman cabai Tit Super transgenik

Kontrol

PEG 15%

A

B

02000400060008000

1000012000140001600018000

K TS 11 TS 29

GENOTIPE CABAI

PR

OLI

NA

DA

UN

OPT PEG 15%

Gambar 18 Distribusi kandungan prolina total daun cabai transgenik R0 dan non transgenik dalam kondisi optimum dan dalam kondisi cekaman dengan perendaman PEG 15% selama 10 hari pada genotype yang sama

Tabel 9 Kandungan prolina daun cabai transgenik dan non transgenik pada

kondisi optimum dan dengan perendaman dalam larutan PEG 15% selama 10 hari

Prolina (ug/g daun)

Genotipe Cabai Optimum Cekaman Kekeringan

Persentase Peningkatan

/Penurunan Prolina (%)*

Kontrol 2169,28 280,70 -87 Trasgenik No 11 440,69 10991,92 2394 Transgenik No 29 384,58 16598,49 4215

*Penurunan=[ (OPT-CEKAMAN)/OPT] x 100%. OPT=tanaman dalam kondisi optimum, dan CEKAMAN=tanaman dalam kondisi cekaman kekeringan.

PEMBAHASAN

Berdasarkan hasil penelitian eksplan daun muda tanaman cabai sangat

peka terhadap infeksi Agrobacterium. Hal ini dapat dilihat dari banyaknya

eksplan yang mati setelah dilakukan proses kokultivasi. Cara seleksi sel

transforman juga dapat mempengaruhi regenerasi tunas transgenik. Gen neomycin

phosphotransferase (nptII) atau gen marker selektif lainnya yang ditransfer ke sel

tanaman agar dapat menseleksi sel yang ditransformasi dengan menambahkan

antibiotik kanamisin pada medium kultur. Jaringan yang tidak ditansformasi akan

memucat dan mati, dan hanya sel yang mengekspresikan gen nptII yang tetap

hidup. Walaupun sel mengekspresikan neomysin phosphotansferase, kanamisin

seringkali dilaporkan menghambat regenerasi tunas transforman (Everett et al.

1987; Graham dan McNicol et al. 1990). Hal ini disebabkan matinya sel-sel pada

jaringan yang mengelilingi sel transforman.

Penundaan penambahan kanamisin pada medium dapat meningkatkan

regenerasi sel transforman. Sel lain itu sel akan membelah sehingga dapat

menghasilkan sejumlah neomysin phosphotransferase yang cukup (Chabaud et al.

1988; Boulter et al. 1990). Beberapa peneliti melaporkan bahwa penggunaan

agen selektif lainnya, seperti hygromysin memberikan hasil yang lebih baik

dibandingkan seleksi dengan kanamisin (Lusdorf et al. 1991; Puonti-Kaerlas et al.

1990). Namun hasil yang berlawan juga dijumpai, seperti yang dilaporkan oleh

D’Halluin et al. (1990).

Setelah inokulasi kalus cabai dengan Agrobacterium dan dikulturkan

pada media seleksi yang mengandung kanamisin 50 mg/l, terjadi inisiasi kalus

baru dan terus berkembang sampai umur empat minggu. Kalus yang terseleksi

dan membentuk tunas kemudian dipindahkan ke dalam media perpanjang tunas

yang mengandung antibiotik kanamisin 50 mg/l sampai tinggi shootlet 5 cm.

Kemudian shootlet-shootlet yang terbentuk dipindahkan ke media perakaran.

Kalus maupun tunas yang dapat tumbuh di dalam media seleksi yang mengandung

kanamisin tersebut dapat dipastikan telah memiliki gen ketahanan terhadap

kanamisin (nptII). Sehingga bisa dipastikan bahwa proses transformasi

Agrobacterium yang membawa plasmid pBI-P5CS telah berhasil.

Regeneran yang diduga membawa gen P5CS menunjukkan morfologi

daun yang lebih besar dibandingkan dengan tunas tanaman kontrol. Hal ini

diduga karena gen P5CS akan mendorong terbentuknya senyawa prolina yang

merupakan salah satu senyawa osmolit yang berfungsi menjaga homeostasi

osmotik agar sel tetap turgor. Homeostasi atau keseimbangan ionik bertujuan

juga untuk mempertahankan konsentrasi ion di tingkat seluler, jaringan dan organ

tanaman.

Gambar 19 Penampilan daun regeneran cabai cv Tit Super secara in vitro (A) Kontrol dan (B) Transgenik

Hasil PCR menunjukkan adanya pita pada ukuran 250 bp baik pada

plasmid maupun pada sel tanaman cabai yang tahan terhadap kanamisin (Gambar

13). Tampak bahwa gen nptII telah positif berada dalam genom tanaman cabai.

Gen nptII yang merupakan gen ketahanan terhadap antibiotik kanamisin

diamplifikasi menggunakan primer spesifik nptII.

Ekspresi gen P5CS pada tanaman cabai transgenik bisa diketahui

berdasarkan kandungan prolinanya. Prolina akan terakumulasi di dalam jaringan

tanaman apabila tanaman tersebut mengalami cekaman kekeringan atau pada

keadaan cekaman salinitas tinggi. Widyasari dan Sugiyarta (1997) menyatakan

dalam keadaan normal, prolina yang dihasilkan bersifat umpan balik dan karena

kehadiran air, prolina akan dioksidasi kembali menjadi asam glutamat (Gambar

20). Oleh karena itu dalam kondisi normal konsentrasi prolina akan selalu rendah.

Pada kondisi cekaman kekeringan oksidasi prolina akan dihambat sehingga

produksi prolina akan bertambah dan dengan adanya gen P5CS produksi prolina

semakin meningkat karena enzim P5CS memicu katalisis glutamat menjadi

prolina. Oleh karena itu adanya akumulasi prolina dapat menjadi indikator

tanaman yang toleran terhadap kekeringan.

Hasil analisis kandungan prolina pada cabai transgenik dan non transgenik

menunjukkan adanya variasi yang cukup tinggi (Gambar 17). Kadar prolina yang

bervariasi ini kemungkinan disebabkan masuknya transgen P5CS ke dalam genom

A B

tanaman terjadi pada intensitas dan posisi yang berbeda. Hal ini menyebabkan

ekspresi transgen P5CS dari masing-masing planlet cabai transgenik berbeda pula.

Gambar 20 Rangkaian reaksi oksidasi prolina

SIMPULAN

Introduksi gen P5CS telah berhasil dilakukan pada genom cabai cv. Tit

Super, dibuktikan dengan didapatkannya 67 planlet yang tahan kanamisin dan

diperkuat dengan hasil PCR. Morfologi tunas yang diduga mengandung gen

P5CS lebih besar dibandingkan dengan morfologi daun tanaman cabai kontrol.

Ekspresi gen P5CS pada genom tanaman cabai terbukti dapat meningkat

kandungan prolina total daun yang mengalami cekaman kekeringan akibat

perendaman dengan PEG.

VI TOLERANSI TEMBAKAU TRANSGENIK GENERASI R2 YANG MENGEKSPRESIKAN GEN P5CS TERHADAP CEKAMAN KEKERINGAN AKIBAT PENGURANGAN

PEMBERIAN AIR

ABSTRAK

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui apakah pada kondisi cekaman kekeringan dari umur 15 – 78 HST akibat pengurangan pemberian air pada tembakau transgenik R2 terjadi ekspresi gen P5CS, apakah umur/developmental tanaman berpengaruh pada over ekspresi gen P5CS tersebut. Toleransi kekeringan dari tanaman tembakau tansgenik di analisa melalui pengukuran kandungan prolina daun. Tanaman tembakau transgenik R2 dari generasi R2 nomor GS1, GS2, GS3, GS4, dan GS5 serta tembakau GS non-transgenik dipelihara dalam kondisi kapasitas lapang hingga 14 HST, kemudian diberi perlakuan cekamans kekeringan dari umur 15 HST hingga umur 35 HST, 55 HST dan 78 HST. Hasil penelitian menunjukkan bahwa terjadi penurunan pertumbuhan pada tembakau akibat pengurangan pemberian air baik pada tanaman tembakau non transgenik maupun tembakau transgenik, namun penurunan pertumbuhan pada tanaman tembakau non transgenik lebih besar dibandingkan dengan tembakau transgenik. Umur tanaman mempengaruhi jumlah prolina yang dihasilkan.

Kata kunci: Akumulasi prolina, fase pertumbuhan

VI TOLERANCE OF TRANSGENIC TOBACCO EXPRESSING GENE P5CS OF R2 GENERATION

AGAINST DROUGHT STRESS DUE TO REDUCTION OF GIVING WATER

Abstract

The objectives of this experiment were (i) to determine the effects of

drought stress during the period of 15 – 78 days after planting (DAP) on growth of R2 plants derived from transgenic GS tobacco carrying P5CS transgene, (ii) to evaluate their tolerance against drought stress, and (iii) to determine their leaf proline content. One group of the evaluated plants were grown in plastic pots and subjected to stress condition during the period of 15 – 78 DAP. The other group was grown optimally in plastic pot up to harvest period. All tobacco plants were harvested at 78 DAP. Leaf proline content was determined at 35 and 78 DAP (after six periods of stress). The results indicated that drought stress reduced plant height, shoot diameter, leaf number, leaf dry weight and leaf area of all tobacco plants. Higher leaf proline content under drought stress was observed in all R2 plants derived from P5CS transgenic tobacco than that of non-transgenic GS tobacco. Increased in leaf proline content due to over-expression of P5CS gene under drought stress correlated with drought tolerance phenotype in transgenic GS tobacco.

Keywords: Proline biosynthesis, proline accumulation, cekamans, biomass yield

PENDAHULUAN

Ketersediaan air yang terbatas atau kekeringan merupakan faktor pembatas

utama terhadap produksi tanaman. Hasil panen di lahan kering relatif rendah

akibat cekaman kekeringan yang dapat terjadi pada setiap tahap perkembangan

tanaman, khususnya tahap pembungaan sampai terbentuknya biji (Mitra 2001).

Pertumbuhan vegetatif tanaman dan hasil polong kacang tanah diamati pada

kondisi optimum dan kondisi cekaman kekeringan. Hasil analisis keragaman

menunjukkan bahwa cekaman kekeringan nyata menurunkan pertumbuhan

vegetatif tanaman dan hasil polong.

Kemampuan atau strategi yang dilakukan tanaman dalam merespons

cekaman kekeringan sangat menentukan kamampuan tanaman untuk menghindari

kondisi kekeringan tersebut. Tanaman yang toleran/tahan terhadap kekeringan

secara fisiologis mempunyai kemampuan menjaga keseimbangan osmotik dalam

sel-selnya dengan meningkatkan penyerapan air dan menurunkan kehilangan air.

Kemampuan meningkatkan penyerapan air ditunjukkan oleh adanya perakaran

yang besar atau adanya osmolit yang menurunkan potensial air dalam sel

(Mundree 2002). Dalam proses pertumbuhan tanaman, penyerapan air oleh akar

sangat ditentukan oleh besarnya gradien osmotik (Steudle dan Frensch 1996).

Penyerapan air dilakukan melalui jalur simplastik. Perkiraan ini didukung dengan

ditemukannya protein integral membran (aquaporin) yang berperan senagai

channel spesifik air (Chrispeel dan Maurel 1994; Magio dan Joly 1995).

Pertumbuhan akar yang ekstensif akan menguntungkan dalam pemeliharaan

potensial air yang tinggi di bawah kondisi cekaman kekeringan.

Beberapa penelitian menunjukkan bahwa ketahanan tanaman terhadap

cekaman kekeringan berhubungan dengan peningkatan kandungan prolina yang

berperan sebagai osmotic adjustment maupun osmoprotektan (Irigoyen et al.

1992). Akumulasi prolina pada tanaman yang mengalami cekaman kekeringan

disebabkan oleh aktivitas biosintesis prolina dan inaktivasi degradasi prolina.

Pada tanaman tingkat tinggi, prolina disentesis melalui lintasan asam glutamin dan

ornitin. Lintasan dari glutamin merupakan rute primer untuk biosintesis prolina

dalam kondisi cekaman kekeringan (Madan et al. 1995; Yoshiba et al. 1997).

Transformasi gen P5CS (phyrroline-5-carboxylate synthetase) yang merupakan

penyandi enzim dalam biosintesis prolina ke tanaman tembakau di bawah kendali

promoter kontitutif CaMV 35S, secara nyata terbukti meningkatkan produksi

prolina dan meningkatkan pula toleransi tanaman transgenik tersebut terhadap

cekaman kekeringan (Kavi Kishor et al. 1995).

Percobaan ini secara umum bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh

cekaman kekeringan melalui pengurangan air terhadap pertumbuhan tanaman R2

zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R2. Secara khusus, percobaan

bertujuan untuk: (1) menguji pengaruh pengurangan air terhadap pertumbuhan

dan hasil tanaman, (2) menganalisis akumulasi prolina daun tanaman R2 zuriat

dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R2 kondisi cekaman dan non-

cekaman, serta (3) menganalisis hubungan antara akumulasi prolina daun pada

kondisi cekaman kekeringan dengan pertumbuhan dan hasil tanaman.

BAHAN DAN METODE

Bibit tembakau transgenik. Benih R2 dari tanaman tembakau tembakau

cv. Gombel Shili (GS) transgenik R1 (tembakau transgenik R2 no GS-1, GS-2,

GS-3, GS-4, GS-5) ditanam dalam medium MS (Murashige dan Skoog 1962)

dengan penambahan kanamisin 100 mg/l. Jumlah bibit yang mampu tumbuh dari

benih dan yang mati dalam medium dengan penambahan kanamisin diamati dan

digunakan untuk menentukan jumlah transgen yang terintegrasi dalam genom

masing-masing tanaman transgenik R2. Hanya bibit tembakau yang tumbuh

dalam medium yang mengandung kanamisin yang digunakan dalam percobaan.

Penyiapan bibit tembakau. Bibit R2 zuriat dari tembaku GS transgenik

P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik ditanam dalam pot plastik

(250 ml) berisi medium campuran tanah:pasir:pupuk kandang (2:1:1) dan

diaklimatisasi dalam ruangan yang terkontrol kelembabannya (100%) dan

penyinaran (1000 lux) selama 2 minggu. Setelah periode aklimatisasi, tanaman

tembakau dipindah ke dalam pot plastik (30x30x30 cm3) yang berisi medium

campuran tanah:pasir: pupuk kandang (2:1:1) dan dipelihara di rumah kaca

sampai umur 2 minggu (14 hari). Pemeliharaan dilakukan meliputi penyiraman

hingga kapasitas lapang setiap pagi dan sore.

Pengaruh cekaman kekeringan terhadap pertumbuhan dan hasil.

Setelah berumur 15 HST, bibit tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik

P5CS generasi R1 yang resisten terhadap kanamisin sebagian dipelihara dengan

penyiraman setiap hari hingga mencapai kondisi lapang hingga 78 HST dan

digunakan sebagai perlakuan non-cekaman. Sedangkan kelompok tanaman yang

lain, diberi perlakuan cekaman kekeringan dari umur 15 HST hingga panen (78

HST) dengan membiarkan tanaman tidak disiram sampai menunjukkan gejala

layu 70% dari seluruh jumlah daun pertanaman, kemudian disiram kembali dan

setelah itu diberi perlakuan cekaman kekeringan kembali dan seterusnya.

Unit percobaan terdiri dari 5 bibit tembaku R2 untuk setiap perlakuan

diulang 3 kali. Percobaan dilakukan menggunakan rancangan perlakuan faktorial

dan rancangan lingkungan acak kelompok. Pengamatan dilakukan terhadap tinggi

tanaman, jumlah dan luas daun, diamater batang, dan bobot daun kering.

Analisis Kandungan prolina. Bibit tanaman R2 dari tembakau GS

transgenik P5CS generasi R1 yang ditanam dalam pot plastik dengan perlakuan

cekaman dan non-cekaman dipanen contoh daunnya pada umur 35 dan 78 HST

dan dianalisis kandungan prolinanya. Analisis kandungan prolina daun dilakukan

dengan menggunakan metode yang dikembangkan oleh Bates et al. (1973);

Sudarsono et al. (2006) Kandungan prolina contoh daun tanaman tembakau GS

non-transgenik yang ditanam dengan perlakuan cekaman dan non-cekaman

digunakan sebagai kontrol.

Indeks sensitifitas terhadap cekaman. Indeks sensitivitas terhadap

cekaman (S) dihitung dengan rumus yang dikembangkan oleh Fischer dan

Maurer (1978), yaitu : S = (1-[Y/Yp])/(1[X/Xp]); Y dan Yp: masing-masing

adalah nilai rataan pengamatan untuk satu genotipe tertentu pada kondisi cekaman

kekeringan dan dalam kondisi non cekaman, sedangkan X dan Xp adalah nilai

rataan pengamatan untuk semua genotipe dalam kondisi cekaman kekeringan dan

kondisi non-cekaman. Indeks S dihitung dengan menggunakan semua peubah

pengamatan yang dikumpulkan. Berdasarkan indesk S yang di dapat, tanaman

tembakau transgenik yang diuji dikategorikan sebagai toleran jika S < 0.5,

medium toleran jika 0.5 < S < 1, dan peka jika S > 1.

HASIL

Pengaruh cekaman kekeringan terhadap pertumbuhan dan hasil.

Cekaman kekeringan pada umumnya dapat menurunkan pertumbuhan

tanaman tembakau, baik tanaman non-transgenik maupun transgenik P5CS.

Perlakuan cekaman kekeringan nyata menurunkan tinggi tanaman, panjang buku,

diameter batang, bobot daun kering, jumlah dan luas daun pada semua tanaman

tembakau yang diuji (Tabel 11, Tabel 12, Tabel 13, Tabel 14 dan Tabel 15), tetapi

terjadi pengecualian (Tabel 10) dimana pada pengamatan panjang akar tanaman

tembakau transgenik GS-1 dan GS-4 terjadi penambahan panjang akar pada

kondisi cekaman, begitu pula untuk berat akar tembakau transgenik GS-4 pada

kondisi cekaman kekeringan berat kering akarnya bertambah.

Penurunan pertumbuhan tanaman tembakau GS non-transgenik akibat

cekaman kekeringan cenderung lebih besar dibandingkan tanaman R2 zuriat dari

tembakau GS transgenik P5CS generasi R1.

Gambar 21 Tanaman tembakau transgenik R2 dalam media kanamisin (A dan B), tembakau R2 kontrol (non transgenik (C) , K(S) = kanamisin sensitif, K(R) = kanamisin resisten

A B C

K ® K ®

K (s) K (s)

Tabel 10 Pengaruh cekaman kekeringan pada periode 35 hari sesudah tanam (HST) terhadap tinggi tanaman, panjang buku dan diameter batang tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik.

Lingkungan Peubah dan Geno-

tipe Tembakau Non-cekaman Cekaman Persentase Penurunan

Tinggi tanaman (cm) Non-transgenik GS-0 29.7 a 10.8 b 63.8Transgenik GS-1 20.3 a 10.3 b 49.6Transgenik GS-2 32.7 a 14.8 b 54.8Transgenik GS-3 32.3 a 15.2 b 53.1Transgenik GS-4 23.3 a 12.2 b 47.9Transgenik GS-5 31.0 a 17.7 b 43.0

Panjang Akar (cm) Non-transgenik GS-0 50.7 a 46.0 a 9.2Transgenik GS-1 37.0 a 40.0 a -8.1Transgenik GS-2 54.3 a 42.0 a 22.7Transgenik GS-3 59.0 a 49.7 a 15.8Transgenik GS-4 34.3 a 48.0 a -39.8Transgenik GS-5 51.7 a 51.0 a 1.3

Berat Kering Akar (g) Non-transgenik GS-0 0.8 a 0.8 b 6.3Transgenik GS-1 0.6 a 0.6 b 5.2Transgenik GS-2 1.8 a 0.9 b 50.9Transgenik GS-3 1.6 a 1.2 b 25.5Transgenik GS-4 0.6 a 0.8 b -31.6Transgenik GS-5 1.3 a 1.1 b 12.9

Diameter batang (cm) Non-transgenik GS-0 1.0 a 0.9 b 15Transgenik GS-1 0.9 a 0.9 b 8.9Transgenik GS-2 1.1 a 0.9 b 15.6Transgenik GS-3 0.9 a 0.9 b 3.5Transgenik GS-4 0.8 a 0.7 b 12.5Transgenik GS-5 0.9 a 0.9 b 10.3

Keterangan: Data rataan pada baris dengan huruf kecil yang sama, tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan pada α =0.05.

Tabel 11 Pengaruh cekaman kekeringan pada periode 35 hari sesudah tanaman (HST) terhadap berat kering daun, luas daun dan jumlah daun tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik.



Berat daun kering (g) Non-transgenik GS-0 4.4 a 1.8 b 59.9Transgenik GS-1 2.3 a 1.3 b 43.5Transgenik GS-2 4.3 a 1.8 b 58.9Transgenik GS-3 3.9 a 2.1 b 47.4Transgenik GS-4 2.3 a 1.4 b 36.8Transgenik GS-5 4.2 a 2.2 b 47.2

Luas daun (cm2) Non-transgenik GS-0 303.7 a 166.5 b 45.2Transgenik GS-1 232.7 a 139.0 b 40.3Transgenik GS-2 372.0 a 199.5 b 46.4Transgenik GS-3 364.2 a 214.2 b 41.2Transgenik GS-4 243.3 a 133.3 b 45.2Transgenik GS-5 371.2 a 184.8 b 50.2

Jumlah daun (lembar) Non-transgenik GS-0 13.0 a 10.5 b 19.4Transgenik GS-1 9.0 a 9.0 b 11.1Transgenik GS-2 11.3 a 8.5 b 13.9Transgenik GS-3 11.7 a 8.3 b 17.6Transgenik GS-4 9.7 a 7.3 b 13.3Transgenik GS-5 11.7 a 8.3 b 22.2





Tinggi tanaman (cm) Non-transgenik GS-0 49.0 a 34.0 b 30.6Transgenik GS-1 58.0 a 42.0 b 27.6Transgenik GS-2 62.0 a 43.5 b 29.8Transgenik GS-3 60.0 a 47.0 b 21.7Transgenik GS-4 48.5 a 28.5 b 41.2Transgenik GS-5 61.0 a 43.0 b 29.5

Diameter batang (mm) Non-transgenik GS-0 1.1 a 0.9 b 13.6Transgenik GS-1 1.1 a 0.8 b 27.3Transgenik GS-2 1.2 a 0.9 b 21.8Transgenik GS-3 1.1 a 1.0 b 9.1Transgenik GS-4 1.1 a 0.8 b 23.8Transgenik GS-5 1.1 a 1.0 b 9.1

Panjang Akar (cm) Non-transgenik GS-0 63.50 a 53.5 b 15.7Transgenik GS-1 61.00 a 54.0 b 11.5Transgenik GS-2 73.50 a 48.5 b 34.0Transgenik GS-3 60.00 a 47.0 b 21.7Transgenik GS-4 75.50 a 41.0 b 45.7Transgenik GS-5 67.00 a 61.0 b 8.9

Berat Kering Akar (g) Non-transgenik GS-0 14.45 a 9.05 b 37.4Transgenik GS-1 12.70 a 8.40 b 33.9Transgenik GS-2 16.60 a 9.90 b 40.4Transgenik GS-3 12,90 a 13.20 b 99.8Transgenik GS-4 13.60 a 5.50 b 59.6Transgenik GS-5 20.50 a 11.40 b 44.4





Bobot daun kering (g) Non-transgenik GS-0 7.7 a 5.0 b 35.1Transgenik GS-1 6.6 a 3.5 b 46.9Transgenik GS-2 9.1 a 4.1 b 54.6Transgenik GS-3 4.7 a 7.4 b -57.4Transgenik GS-4 6.2 a 2.4 b 61.3Transgenik GS-5 9.6 a 5.9 b 38.5

Luas daun (cm2) Non-transgenik GS-0 452.5 a 274.5 b 39.3Transgenik GS-1 427.0 a 377.0 b 11.7Transgenik GS-2 467.8 a 394.9 b 15.6Transgenik GS-3 411.8 a 254.4 b 38.2Transgenik GS-4 359.0 b 409.0 a -13.9Transgenik GS-5 544.0 a 351.0 b 35.5






Tinggi tanaman (cm) Non-transgenik GS-0 185.0 a 85.0 b 54.1 Transgenik GS-1 191.7 a 88.3 b 53.9 Transgenik GS-2 173.0 a 103.3 b 40.3 Transgenik GS-3 183.3 a 111.7 b 39.1 Transgenik GS-4 88.7 a 90.0 b -1.5 Transgenik GS-5 175.0 a 118.3 b 32.4

Panjang buku (cm) Non-transgenik GS-0 4.4 a 2.8 b 35.7 Transgenik GS-1 4.5 a 2.6 b 43.3 Transgenik GS-2 5.3 a 2.9 b 45.6 Transgenik GS-3 4.9 a 2.7 b 45.6 Transgenik GS-4 3.5 a 2.5 b 28.6 Transgenik GS-5 4.5 a 3.2 b 28.2

Diameter batang (cm) Non-transgenik GS-0 1.4 a 1.1 b 19.5 Transgenik GS-1 1.5 a 1.3 b 17.4 Transgenik GS-2 1.6 a 1.2 b 25 Transgenik GS-3 1.6 a 1.1 b 29.2 Transgenik GS-4 1.5 a 1.2 b 23.3 Transgenik GS-5 1.6 a 1.2 b 23.4





Bobot daun kering (g) Non-transgenik GS-0 20.0 a 12.0 b 40.0Transgenik GS-1 20.0 a 13.3 b 33.4Transgenik GS-2 18.7 a 11.3 b 39.3Transgenik GS-3 19.3 a 12.0 b 37.9Transgenik GS-4 5.0 a 12.0 b -140.0Transgenik GS-5 20.7 a 12.0 b 41.9

Luas daun (cm2) Non-transgenik GS-0 440.3 a 263.0 b 40.3Transgenik GS-1 426.2 a 343.6 b 19.4Transgenik GS-2 415.8 a 347.6 b 16.4Transgenik GS-3 397.3 a 338.9 b 14.7Transgenik GS-4 296.7 a 290.0 b 2.3Transgenik GS-5 517.0 a 340.4 b 34.2



A1 B1 A2 B2 A3 B3

A4 B4 A5 B5 A6 B6 Gambar 22 Tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1

dan tembakau GS non-transgenik pada kondisi optimum dan cekaman kekeringan, A1 = Tanaman tembakau non transgenik yang mendapat perlakuan cekaman kekeringan, B1= Tanaman tembakau non transgenik yang tidak mendapat perlakuan cekaman kekeringan, A2= Tanaman tembakau transgenik GS-1 yang tidak mendapat perlakuan cekaman, B2= Tanaman tembakau transgenik GS-1 yang mendapat perlakuan cekaman, A3= Tanaman tembakau transgenik GS-2 yang tidak mendapat perlakuan cekaman,B3= Tanaman tembakau transgenik GS-1 yang mendapat perlakuan cekaman, A4= Tanaman tembakau transgenik GS-3 yang tidak mendapat perlakuan cekaman, B4= Tanaman tembakau transgenik GS-3 yang mendapat perlakuan cekaman, A5= Tanaman tembakau transgenik GS-4 yang tidak mendapat perlakuan cekaman,B5=Tanaman tembakau transgenik GS-4 yang mendapat perlakuan cekaman,A6= Tanaman tembakau transgenik GS-5 yang tidak mendapat perlakuan cekaman,B6= Tanaman tembakau transgenik GS-5 yang mendapat perlakuan cekaman

0100200300400500600700800900

T0S0 T1S0 T2S1 T3S1 T4S1 T5S1

Galur Tembakau

Pro

lina

u g/

g B

B D

aun

35 HST Stres78 HST Stres

Gambar 23 Kandungan prolina beberapa galur tembakau pada kondisi cekaman

kekeringan umur 35 dan 78 HST

0

100

200

300

400

500

600

700

800

T0S0 T1S0 T2S1 T3S1 T4S1 T5S1

Galur Tembakau

Pro

lina

u g/

g B

B D

aun

35 Normal78 Normal

Gambar 24 Kandungan prolina beberapa galur tembakau pada kondisi optimum umur 35 dan 78 HST

Tabel 16 Pengaruh perlakuan cekaman kekeringan pada periode 15-78 hari sesudah tanam (HST) terhadap kandungan prolina daun tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik. Contoh daun diambil 78 HST

Prolina daun (ug/g bobot basah) Genotipe tembakau

Non-cekaman Cekaman Persentase

Peningkatan Non-transgenik GS-0 404.1 a 790.6 b 95.6

Transgenik GS-1 175.3 a 764.8 b 336.3Transgenik GS-2 692.3 a 778.1 b 12.4Transgenik GS-3 182.9 a 794.9 b 334.6Transgenik GS-4 257.9 a 436.1 b 69.1Transgenik GS-5 580.9 a 782.9 b 34.8


y = 0.1823x - 42.509R2 = 0.1266

0

20

40

60

80

100

120

140

160

700.00 750.00 800.00 850.00 900.00Prolina daun (ug/g BB)

Ting

gi ta

nam

an (c

m)

y = 0.0103x + 4.0548R2 = 0.0477

0

2

4

68

10

12

14

16

720.00 740.00 760.00 780.00 800.00 820.00 840.00 860.00

Prolina daun (ug/g BB)

Ber

at K

erin

g D

aun

(g)

Gambar 25 Regresi antara kandungan prolina daun dari tembakau GS non-

transgenik dan tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik R 1, dengan tinggi tanaman dan bobot kering daun per tanaman Kandungan prolina daun ditentukan umur 78 hari sesudah tanam (hst) sedangkan tinggi tanaman dan berat kering daun ditentukan 110 hari setelah tanam (hst). (Δ) tembakau GS-non transgenik, (♦) tembakau GS transgenik P5CS

Analisis regresi antara kandungan prolina dengan tinggi tanaman dan bobot

kering daun per tanaman mengindikasikan adanya kecenderungan meningkatnya

tinggi tanaman dan bobot kering daun sejalan dengan meningkatnya kandungan

prolina daun (Gambar 24). Nilai R2 dari hasil analisis regresi yang dilakukan

sebesar R2 = 0.1266 untuk regresi antara kandungan prolina daun dan tinggi

tanaman serta R2 = 0.048 untuk regresi antara kandungan prolina daun dan bobot

daun kering per tanaman (Gambar 24). Akumulasi prolina dalam jumlah banyak

pada jaringan tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS di duga dapat

membuat penyerapan unsur hara dan air oleh akar menjadi lebih efektif sehingga

menyebabkan peningkatan pertumbuhan tanaman R2 yang dievaluasi. Hasil

penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa peningkatan kandungan prolina

sangat berperan dalam osmotic adjustment untuk menjaga agar potensial osmotic

(PO) akar selalu dalam kondisi lebih negatife dari PO air tanah, sehingga air atau

unsur hara tetap dapat mengalir kearah jaringan akar dan tanaman (Bao et al.

1991; Jerez et al. 1991; Martinez dan Moreno 1992; Patil dan Patil 1993; Serraj

dan Sinclair 2002, Riduan et al. 2007)

Indeks sensitivitas terhadap cekaman. Indeks sensitivitas (S) yang

dihitung berdasarkan tinggi tanaman tembakau menunjukkan bahwa tanaman

tembakau non-transgenik di katagorikan peka, sedangkan tanaman R2 zuriat dari

tembakau transgenik P5CS generasi R1 bersegregasi untuk kategori peka, medium

dan toleran Gambar 25, indeks sensitivitas yang dihitung berdasarkan panjang

akar, tanaman tembakau non transgenik termasuk ke dalam kategori medium,

sedangkan tanaman tembakau tansgenik P5CS tergolong ke dalam kelompok

medium dan peka terhadap cekaman kekeringan.

Dari keterkaitan antara nilai indeks sensitivitas dengan tinggi tanaman

tembakau, terlihat bahwa semakin rendah nilai indeks sensitivitas tanaman atau

semakin toleran tanaman terhadap cekaman kekeringan maka semakin tinggi

tanaman yang dimiliki (Gambar 25). Begitu juga dengan panjang akar semakin

rendah indeks sensitivitas tanaman tembakau, semakin toleran tanaman tembakau

terhadap cekaman kekering dan semakin panjang akar yang dimiliki oleh

tembakau, baik tembakau non-transgenik maupun tanaman tembakau transgenic

P5CS.

y = -15.313x + 115.31R2 = 0.1907

0

20

40

60

80

100

120

140

160

-0.5 0 0.5 1 1.5 2

Indeks sensitivitas terhadap stres kekeringan

Ting

gi ta

nam

an (c

m)

y = -16.719x + 62.418R2 = 0.5351

0

10

20

30

40

50

60

70

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

Indeks sensitivitas terhadap cekaman kekeringan

Pan

jang

aka

r (cm

)

Gambar 26 Keterkaitan antara indeks sensitivitas terhadap cekaman kekeringan

yang dihitung menggunakan data tinggi tanaman dan panjang akar dari tembakau GS non-transgenik (♦) dan transgenic (Ο,♦■). Nilai indeks sensitivitas ≤ 0.5 dikategorikan toleran, diantara 0,5 dan 1 dikategorikan medium, dan >1 dikategorikan peka.

PEMBAHASAN

Pengujian ekspresi gen P5CS sebagai penyandi enzim kunci biosintesis

prolina serta fungsinya dalam mengatasi cekaman kekeringan telah dilakukan

pada tanaman tembakau transgenik yang mengandung gen P5CS generasi kedua.

Hasil pengamatan menunjukkan bahwa cekaman kekeringan yang diberikan pada

periode 15 sampai 78 HST dapat menghambat pertumbuhan semua tanaman yang

diuji. Perlakuan cekaman kekeringan dapat dikategorikan cekaman berat, karena

tanaman dibiarkan tidak didisiram sampai menunjukkan gejala layu hampir 70%

dari setiap populasi tanaman.

Tanaman yang mengalami cekaman kekeringan secara umum mengalami

penurunan bobot kering akar dan tajuk. Keadaan ini mencerminkan adanya

hambatan pertumbuhan akibat cekaman kekeringan. Tanaman yang menghadapi

cekaman kekeringan diduga akan mengecilkan ukuran lubang stomata untuk

mengurangi hilangnya air melalui evaporasi. Akan tetapi, mengecilnya lubang

stomata diduga juga mengurangi masuknya karbon dioksida dan menurunkan

produksi fotosintat sehingga memperlambat pertumbuhan tanaman.

Respon tanaman terhadap cekaman kekeringan juga dengan meningkatkan

kandungan osmolit dalam sel, antara lain dengan mengakumulasi senyawa prolina

(Mundree et al. 2002). Enam kultivar kacang tanah Indonesia yang diuji juga

menunjukkan peningkatan akumulasi senyawa prolina sebagai respon terhadap

cekaman kekeringan (Sudarsono et al. 2004).

Hasil analisa kandungan prolina daun menunjukkan bahwa kandungan

prolina daun tanaman tembakau semakin meningkat dengan semakin

bertambahnya umur tanaman tanaman, baik itu tanaman tembakau transgenik

maupun non transgenik. Kandungan prolina daun tembakau umur 35 HST jauh

lebih rendah dibandingkan tembakau umur 78 HST. Ini menunjukkan bahwa

ekspresi dari pada gen P5CS dipengaruhi juga umur dari tanaman. Kandungan

prolinanya hampir dua kali lebih banyak jika dibandingkan pada umur 35 dan 78

HST.

Hasil pengamatan terhadap kandungan prolina daun tembakau transgenik

generasi R2 ini menunjukkan tingkat perbedaan yang bervariasi antara tanaman

transgenik yang satu dengan yang lainnya, diduga disebabkan oleh segregasi

genetik dari gen P5CS di dalam genom tembakau dan juga konstitusi genetik

dalam kondisi heterozigot atau homozigot serta adanya interaksi dengan faktor

lingkungan sehingga menimbulkan perbedaan tingkat akumulasi prolinanya.

Dari hasil analisis kandungan prolina daun tembakau tanaman R2 zuriat

adanya tanaman tembakau transgenik yang kandungan prolina daunnya lebih

rendah dari tembakau transgenik pada kondisi lingkungan tercekam hal ini diduga

karena adanya feedback inhibition pada gen P5CS dari sel tanaman tembakau

transgenik yaitu terjadinya penghambatan aktivitas enzim P5CS penyandi

biosintesis prolina oleh produk prolina itu sendiri, untuk mengatur akumulasi

prolina di dalam tanaman agar tetap dalam level tertentu. Menurut Hong et al.

(2000), sintesis prolina pada tanaman dalam kondisi cekaman tidak hanya diatur

oleh aktivitas transkripsi gen P5CS, tetapi juga oleh regulasi feedback melalui

produk akhirnya (prolina). Dari hasil penelitian Zhang (1989), menunjukkan

bahwa hasil uji kinetik pada enzim P5CS Vigna aconotifolia di dapat adanya

penghambatan aktivitas P5CS oleh 6 mM Prolina.

Berdasarkan hasil yang diperoleh, kemampuan tanaman tembakau

transgenik P5CS R2 zuriat dalam mengatasi cekaman kekeringan, diduga masih

sangat berhubungan dengan peningkatan kandungan prolina akibat over-ekspresi

dari gen P5CS penyandi enzim kunci biosintesis prolina.

Pendugaan peranan prolina terhadap peningkatan biomasa tanaman

tembakau transgenik P5CS diperkuat dengan adanya kecenderungan peningkatan

tinggi tanaman dan bobot kering daun dengan meningkatnya kandungan prolina

daun. Hal ini membuktikan bahwa over-ekspresi gen P5CS dalam meningkatkan

kandungan prolina daun, mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman tembakau

melalui peningkatan pertumbuhan akar dan biomasa tanaman.

SIMPULAN

Dari hasil percobaan yang dilakukan dapat ditarik simpulan, bahwa

cekaman kekeringan dapat meningkatkan kandungan prolina daun baik pada

tanaman tembakau transgenik P5CS R2 zuriat maupun non transgenik, tetapi

peningkatan pada tanaman transgenik jauh lebih tinggi dibandingkan tanaman

tembakau non transgenik. Umur tanaman mempengaruhi kandungan prolina daun

semakin bertambah umur tanaman maka kandungan prolina daunnya juga

semakin meningkat.

VII TOLERANSI TEMBAKAU TRANSGENIK GENERASI R2 YANG MENGEKSPRESIKAN GEN P5CS TERHADAP

CEKAMAN AKIBAT PENYIRAMAN POLIETILEN GLIKOL (PEG)

Abstrak

Percobaan yang dilakukan bertujuan untuk (i) menentukan pengaruh penyiraman polietilena glikol (PEG) selama fase pertumbuhan vegetatif (15-60 hari sesudah tanam [hst]) terhadap pertumbuhan tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS, (ii) mengevaluasi toleransi lima tembakau GS transgenik terhadap cekaman akibat perlakuan PEG, dan (iii) menentukan kandungan prolina daun lima tembakau GS transgenik dalam kondisi non-cekaman dan cekaman dengan penyiraman larutan PEG dan hubungan antara akumulasi prolina dengan respons tembakau transgenik terhadap cekaman PEG. Bibit tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R0 ditumbuhkan dalam pot plastik (500 ml) yang berisi medium campuran arang sekam:coco pit (1:1). Setelah 15 hari sesudah tanam (HST), bibit diberi perlakuan cekaman dengan penyiraman larutan PEG 6000 pada konsentrasi 0%, 2.5%, 5%, 7.5%, 10%, 12.5% dan 15% selama periode antara 15 - 60 HST dan tanaman dipanen umur 55 dan 65 HST. Contoh daun untuk analisis kandungan prolina dipanen pada umur 78 HST. Hasil penelitian menunjukkan cekaman dengan penyiraman larutan PEG, dapat menurunkan tinggi tanaman, jumlah daun, luas daun, bobot kering daun, tajuk, biomasa dan akar tembakau GS non-transgenik maupun tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R0. Kata kunci : Cekaman kekeringan, biosintesis dan akumulasi prolina, indeks

sensitivitas terhadap cekaman PEG

VII TOLERANCE OF TRANSGENIC TOBACCO EXPRESSING GENE P5CS OF R2 GENERATION AGAINST

STRESS DUE TO POLYETHYLENE GLYCOL (PEG)

Abstract

The objectives of this experiment were (i) to determine the effects of sress due to polyethylene glycol (PEG) treatment during the period of 15 - 78 days after planting (DAP) on growth of R2 plants derived from transgenic GS tobacco carrying P5CS transgene, (ii) to evaluate tolerance of R2 plants derived from five line of transgenic GS tobacco against drought stress, and (iii) to determine their leaf proline content under optimum and under PEG induced stress conditions and their correlation to stress responses. The R2 seedlings derived from five transgenic GS tobacco P5CS were grown individually in plastic pot (500 ml) containing a mixture of rice hull: coco pit medium (1:1). After 15 DAP, seedlings were subjected to stress conditions by drenching them with solution of PEG 6000 at 0%, 2.5%,5%, 7.5%, 10%, 12.5% or 15% concentration for the period of 15 - 78 DAP. The plants were harvested at 78 DAP. Leaf samples for proline content analysis were collected at 78 DAP. Results of the experiment indicated stress due to PEG treatment reduced plant height, leaf number, total leaf width, leaf, shoot, biomass, and root dry weight of all tobacco plants. The R2 plants derived from P5CS transgenic GS tobacco showed better growth and higher plant height, leaf, biomass and root dry weight than that of non-transgenic under stress or non-stress condition. Increased leaf proline content after drought stress was observed in all tobacco transgenic, while less was observed in tobacco non-transgenic.

Keywords: Dehydration cekamans, Proline biosynthesis and accumulation,

sensitivity index against PEG induced stres

PENDAHULUAN

Ketersediaan air merupakan faktor pembatas utama dalam budi daya

tanaman. Pada genotipe tanaman yang toleran terhadap cekaman kekeringan,

penurunan daya hasil akibat cekaman tidak sebesar yang terjadi pada genotipe

peka sehingga penggunaan genotipe yang toleran mempunyai arti penting dalam

budidaya tanaman di lahan kering.

Kondisi cekaman kekeringan dengan potensial air jaringan tanaman

rendah mempengaruhi pertumbuhan tanaman terutama pada kenampakan

morfologi dan perkembangan tanaman, perkembangan sel, fisiologi dan biokimia

(Yoshiba et al. 1997). Pengurangan pemberian air menyebabkan perubahan pola

perkembangan daun bunga matahari. Pada keadaan defisit air menyebabkan luas

daun berkurang dibanding kondisi optimum. Pengurangan luas daun ini

dipengaruhi oleh pengurangan kecepatan pembelahan dan luas areal sel sampai 40

% dibanding tanaman kontrol. Cekaman air menyebabkan pengurangan biomasa

daun dan polong kering kacang tanah (Collino et al. 2000) dan penurunan bobot

kering polong diduga disebabkan oleh proses terhambatnya inisiasi dan

pemanjangan ginofor (Chapman et al. 1993). Pada tanaman kedelai, defisit air

menurunkan luas area dan kandungan klorofil daun (Shimada et al. 1992),

menurunkan ukuran polong, biji, dan bobot kering polong (Pookpadi et al. 1990),

dan menurunkan kualitas biji (Franca-Neto et al. 1993). Cekaman kekeringan

mempengaruhi pula sistem reproduksi tanaman. Herrero dan Johnson (1981)

mempelajari pengaruh cekaman kekeringan pada sistem reproduksi tanaman

jagung. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemanjangan rambut jagung (silk)

terhenti pertumbuhan pada potensial air daun kira-kira -9 bar. Gejala morfologi

yang biasa nampak pada tanaman kekurangan air adalah tanaman layu, daun

menggulung, dan kerdil.

Karakter toleransi / ketahanan terhadap kekeringan pada prinsipnya berkait

dengan upaya tanaman untuk menjaga keseimbangan osmotik dengan

meningkatkan penyerapan air dan menurunkan kehilangan air. Penurunan luas

daun merupakan salah satu cara adaptasi tanaman untuk menekan kehilangan air

melalui proses transpirasi (White dan Singh, 1993) dan merupakan salah satu

bentuk respons tanaman menghadapi cekaman kekeringan. Penurunan luas daun

dapat berpengaruh negatif terhadap area fotosintesis sehingga tidak

menguntungkan tanaman. Lebih lanjut, cekaman kekeringan dapat menyebabkan

menurunnya bobot daun segar hingga 12% (Popova et al. 1996).

Pengembangan ketahanan potensial osmotik sel daun dan akar serta

penurunan densitas stomata per luasan permukaan daun merupakan adaptasi

terhadap cekaman kekeringan yang paling menguntungkan (Blum 2004). Dengan

membatasi kehilangan air melalui transpirasi dan menjaga tekanan turgor sel

melalui pengaturan potensial osmotik jaringan, tanaman tetap mampu menyerap

air dalam kondisi cekaman kekeringan dan mampu menjaga pertumbuhan dan

perkembangannya (Gupta 1997).

Cekaman kekeringan menyebabkan respons biokimia atau metabolik pada

tanaman. Karakter metabolik berupa akumulasi prolin pada jaringan tanaman

merupakan karakter untuk toleransi tanaman terhadap cekaman kekeringan.

Peningkatan kandungan prolina yang berfungsi sebagai solut dalam osmotic

adjustment dilaporkan mempunyai peranan penting dalam respons tanaman

terhadap cekaman kekeringan (Slee et al. 1990; Bao et al. 1991). Dengan osmotic

adjustment, tanaman dapat menjaga potensial air daun dan akar yang lebih rendah

dan mempertahankan turgor sel dalam kondisi cekaman kekeringan. Kedua

kemampuan tersebut merupakan indikator sifat tanaman yang toleran terhadap

cekaman kekeringan (Cellier et al. 1998). Berdasarkan hal tersebut, peningkatan

kandungan prolina daun dalam kondisi cekaman kekeringan dapat digunakan

sebagai penduga toleransi tanaman terhadap cekaman kekeringan (Gupta 1997).

Senyawa polietilena glikol (PEG) merupakan senyawa yang dapat

menurunkan potensial osmotik larutan melalui aktivitas matriks sub-unit etilena

oksida yang mampu mengikat molekul air dengan ikatan hidrogen. Penyiraman

larutan PEG ke dalam media tanam diharapkan dapat menciptakan kondisi

cekaman karena ketersediaan air bagi tanaman menjadi berkurang.

Senyawa osmotikum polietilena glikol (PEG) dapat menurunkan potensial

air medium dan penyiraman PEG dalam medium tanam dapat mensimulasikan

kondisi cekaman kekeringan (Saint-Clair 1976). Penggunaan PEG dilaporkan

efektif untuk menapis respons plasma nutfah tanaman terhadap cekaman

kekeringan (Asay dan Johnson 1983). PEG juga telah digunakan untuk menapis

respon tanaman anggur, kacang tanah, kedelai, kubis-kubisan, padi dan sorghum

terhadap cekaman kekeringan (Duncan et al. 1995; Adkins et al. 1995; Dami dan

Hughes 1995; Sunaryo et al. 2002; Adisyahputra 2006). Hasil penelitian

menunjukkan adanya korelasi positif antara toleransi tanaman terhadap cekaman

akibat perlakuan PEG dengan toleransi terhadap cekaman kekeringan (Sunaryo et

al. 2002; Adisyahputra 2006).

Percobaan ini secara umum bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh

cekaman kekeringan terhadap pertumbuhan dan perkembangan tanaman R2 zuriat

dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1. Secara khusus, percobaan ini

bertujuan untuk: (1) menguji pengaruh penyiraman PEG terhadap pertumbuhan

dan hasil tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1, (2)

menganalisis akumulasi prolina dalam daun tanaman R2 zuriat dari tembakau GS

transgenik P5CS generasi R1 pada kondisi cekaman dengan penyiraman larutan

PEG 6000, dan (3) menganalisis hubungan antara akumulasi prolina daun dengan

pertumbuhan dan hasil tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS

generasi R1.

BAHAN DAN METODE

Bibit tembakau transgenik. Benih dari lima nomor tembakau transgenik

P5CS generasi R1 dipanen dari masing-masing nomor tembakau transgenik P5CS

generasi R0 (GS-1, GS-2, GS-3, GS-4, dan GS-5) ditanam dalam medium MS

(Murashige dan Skoog, 1962) dengan penambahan kanamisin 100 mg/l. Jumlah

bibit yang mampu tumbuh dari benih dan yang mati dalam medium dengan

penambahan kanamisin diamati dan digunakan untuk menentukan jumlah

transgen yang terintegrasi dalam genom masing-masing tanaman transgenik R0.

Hanya bibit tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1

yang tumbuh dalam medium yang mengandung kanamisin yang digunakan dalam

percobaan.

Penyiapan bibit tembakau. Bibit tanaman R2 zuriat dari tembakau GS

transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik ditanam dalam pot

plastik (250 ml) berisi medium campuran tanah:pasir:pupuk kandang (2:1:1) dan

diaklimatisasi dalam ruangan yang terkontrol kelembaban (100%) dan

penyinarannya (1000 lux) selama satu minggu. Setelah periode aklimatisasi,

tanaman tembakau dipindah kedalam pot plastik (500 ml) yang berisi medium

campuran arang sekam:coco peat (1:1) dan dipelihara di rumah kaca sampai umur

2 minggu (14 hari). Pemeliharaan yang dilakukan meliputi penyiraman hingga

jenuh setiap pagi dan sore hari.

Pengaruh cekaman PEG terhadap pertumbuhan dan hasil. Setelah

bibit tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 yang

resisten terhadap kanamisin dan bibit tembakau GS non-transgenik disiram

dengan larutan PEG 2.5%,5%, 7.5%, 10%, 12,5% atau 15% hingga 60 HST.

Larutan PEG disiramkan setiap dua hari sekali sebanyak 20 ml per tanaman.

Sebagian tanaman transgenik R2 yang lain disiram setiap hari dengan air (PEG

0%) hingga saat panen dan dijadikan sebagai kontrol.

Unit percobaan terdiri atas 5 bibit tembakau dan untuk setiap perlakuan

diulang 3 kali. Percobaan dilakukan menggunakan rancangan perlakuan faktorial

dan rancangan lingkungan acak kelompok. Pengamatan dilakukan terhadap tinggi

tanaman, jumlah dan luas daun, rataan panjang buku, bobot daun, bobot tajuk,

bobot akar, dan bobot biomasa kering, serta panjang akar.

Analisis kandungan prolina. Bibit tanaman R2 zuriat dari tembakau GS

transgenik P5CS generasi R1 dengan atau tanpa penyiraman PEG dipanen

daunnya pada umur 78 HST dan dianalisis kandungan prolinanya. Analisis

kandungan prolina daun dilakukan dengan menggunakan metode yang

dikembangkan oleh Bates et al, (1973). Kandungan prolina daun tanaman

tembakau GS non-transgenik dengan atau tanpa penyiraman PEG digunakan

sebagai kontrol.

HASIL

Bibit tembakau transgenik. Populasi tanaman R2 yang diuji dalam

percobaan ini dikecambahkan dari benih R1 yang dipanen dari tanaman

transgenik R0 setelah ditumbuhkan pada medium selektif MS0 yang mengandung

antibiotik kanamisin 100 mg/l. Setelah ditumbuhkan pada medium MS0 selektif

selama 3 minggu, hanya bibit tembakau yang tahan terhadap antibiotik kanamisin

yang digunakan dalam percobaan ini. Hasil analisis segregasi antara bibit yang

resisten dan rentan terhadap kanamisin mengindikasikan bahwa tanaman

transgenik R0 yang didapat mengintrograsikan paling tidak satu lokus nptII

fungsional didalam genomnya (Tabel 17).

Pengaruh cekaman PEG terhadap pertumbuhan dan hasil. Semua

tanaman tembakau yang diuji mampu tumbuh normal pada media coco piet dan

arang sekam. Terdapat beberapa tanaman yang mati, namun kematian tanaman ini

bukan disebabkan oleh kondisi media tumbuh maupun perlakuan PEG, tetapi

lebih disebabkan proses adaptasi tanaman yang kurang maksimal pada tahapan

aklimatisasi dari ruang kultur ke kondisi iklim rumah kaca.

Hasil pengamatan menunjukkan bahwa penyiraman larutan PEG pada

konsentrasi 2.5%,5%, 7.5%. 10%, 12.5% atau 15% sudah memberikan kondisi

cekaman pada tanaman tembakau yang diuji. Penyiraman PEG 2.5%,5%, 7.5%.

10%, 12.5% atau 15% secara umum menurunkan pertumbuhan tanaman tembakau

non-transgenik maupun tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS.

Tabel 17 Segregasi fenotipe bibit R2 yang ditanam dalam medium MS selektif dengan penambahan antibiotika kanamisin 100 mg/l, hasil analisis χ2, dan pendugaan jumlah lokus nptII fungsional yang terintegrasi dalam genom tembakau transgenik.

Segregasi fenotipe bibit R2 dalam MS selektif:

Probabilitas χ2, untuk model segregasi: Nomor genotipe

KanR KanS 3 : 1 13 : 3

Lokus nptII

Transgenik GS-1 128 30 3.376 0.001 1 Transgenik GS-2 119 27 3.653 0.034 1 Transgenik GS-3 136 49 0.146 6.769 1 Transgenik GS-4 96 40 1.186 9.46 1 Transgenik GS-5 91 43 3.223 14.788 1

Keterangan: Penghitungan χ2, dilakukan dengan menggunakan koreksi Yates dan pada α = 0.05.

020406080

100120140160

2.5 7.5 15

% PEG

Kan

dung

an P

rolin

a

AkarDaun

Gambar 27 Menunjukkan bahwa ekspresi pembentukan senyawa prolina lebih banyak di daun daripada di akar tanamn.

Tabel 18 Pengaruh penyiraman polietilena glikol (PEG) dengan konsentrasi 0%,2.5%, 5%,7.5%, 10%,12.5% dan 15% pada umur 35 HST terhadap tinggi tanaman,bobot akar kering, bobot kering daun,dan panjang akar dari tanaman R1 zuriat tembakau GS transgenik P5CS generasi R2 dan tembakau GS non-transgenik.

Nilai peubah pada konsentrasi penyiraman PEG: Peubah dan genotipe

yang diuji 0% 2.5% 5% 7.5% 10% 12.5% 15% Tinggi Tanaman (cm):

Nontransgenik GS-0 9.83 A 3.00 ED 2.16DEF 2.33 EF 2.20DEF 2.33DEF Transgenik GS-1 8.33 B 2.16DEF 2.06DEF 1.90DEF 1.33DEF 1.80 EF 1.93 EF Transgenik GS-2 8.00ABC 1.63 EF 1.86DEF 1.46DEF 1.73DEF 1.83 EF 1.85 EF Transgenik GS-3 7.33BC 2.33DEF 1.13 EF 1.73DEF 1.50DEF 1.16DEF 1.100DEF Transgenik GS-4 6.33 C 1.06DEF 1.16 EF 0.66 F 0.60 F - 0.85 EF Transgenik GS-5 3.16D 1.83 EF 1.83DEF 1.73DEF 1.16DEF - 1.750DEF

Bobot akar kering (g): Nontransgenik GS-0 0.43ABCDE 0.30ABCDE 0.10E 0.20BCDE 0.15DE 0.15DE 0.15DE Transgenik GS-1 0.46ABCD 0.20BCDE 0.08 E 0.10 E 0.10 E 0.08 E 0.08 E Transgenik GS-2 0.43ABCDE 0.12 E 0.10 E 0.05 E 0.05 E Transgenik GS-3 0.43ABCDE 0.70 ABCD 0.72

ABC 0.06 E 0.41ABCD

E 0.12 E 0.06 E

Transgenik GS-4 0.33 ABCDE 0.21 BCDE 0.81 A 0.09 E 0.49ABCDE 0.06 E

Transgenik GS-5 0.20BCDE 0.05 E 0.18 CDE

0.13 E 0.23BCDE 0.02E

Bobot kering daun (g): Nontransgenik GS-0 0.60 BC 0.43 BC 0.08 C 0.02 C 0.05 C 0.04C 0.08 C Transgenik GS-1 0.50 BC 0.27 C 0.06 C 0.01 C 0.05 C 0.07C 0.10 C Transgenik GS-2 0.50 BC 0.58 BC 0.06C 3.01A 0.08 C 0.09C 0.72 BC Transgenik GS-3 0.40 BC 0.08 C 0.03 C 0.008C 0.05 C 0.03C 0.08 C Transgenik GS-4 0.37 BC 0.09 C 0.013 C 0.001 C 0.001 C 2.00AB 0.705 BC Transgenik GS-5 0.400 BC 0.103 C 0.107 C 0.009 C 0.034 C 0.062 C

Panjang akar (cm): Nontransgenik GS-0 21.667

ABCD 22.667 ABCD

27.333 AB

23.000 ABCD

22.000 ABCD

25.833 AB

18.33 ABCD

Transgenik GS-1 21.333 ABCD

27.667 AB

23.667 ABCD

26.333 AB

15.333 ABCD

26.000 AB

20.00 ABCD

Transgenik GS-2 26.000 AB

19.333 ABCD

24.33 ABC

21.33 ABCD

24.0 ABC

28.0AB 16.33 ABCD


20.670 ABCD

15.000 ABCDE

18.000 ABCD

26.330 AB

22.000 ABCD

9.250 CDE


16.000 ABCD

13.330 BCE

8.333 DE

20.330 ABCD

1.000 E

16.670 ABCD


22.670 ABCD

29.67A 19.33ABD

14.33ABCDE 16.000 ABCD

Keterangan: Data rataan pada kolom dengan huruf kapital yang sama, tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan pada α =0.05.

Tabel 19 Pengaruh penyiraman polietilena glikol (PEG) dengan konsentrasi 0%,2.5%, 5%,7.5%, 10%,12.5% dan 15% pada umur 55 HST terhadap tinggi tanaman, bobot akar kering, jumlah daun, berat kering daun,dan panjang akar dari tanaman R2 zuriat tembakau GS transgenik P5CS R2 dan tembakau GS non-transgenik.

Nilai peubah pada konsentrasi penyiraman PEG: Peubah dan genotipe

yang diuji 0% 2.5% 5% 7.5% 10% 12.5% 15% Tinggi Tanaman (cm):

Nontransgenik GS-0 12.16 B 1.73 C 2.90 C 3.00 C 2.66 C 1.73 C 2.23 C Transgenik GS-1 13.33 AB 1.60 C 1.50 C 1.50 C 2.27 C 2.17 C 2.50 C Transgenik GS-2 15.50 A 2.13 C 1.63 C 2.50 C 1.63 C 1.70 C 2.03 C Transgenik GS-3 13.33 AB 2.83 C 1.33 C 1.07 C 1.73 C 1.00 C 1.07 C Transgenik GS-4 13.50 AB 1.10 C 1.53 C 1.10 C 1.23 C 1.20 C 1.10 C Transgenik GS-5 14.75 AB 3.50 C 2.13 C 2.00 C 1.90 C 1.77 C

Bobot akar kering (g): Nontransgenik GS-0 0.60 BC 0.04 E 0.12 DE 0.09 DE 0.06DE 0.08 DE 0.12 DE Transgenik GS-1 1.07 A 0.04 E 0.05 DE 0.06 DE 0.05DE 0.10 DE 0.01 E Transgenik GS-2 0.83 AB 0.09 DE 0.06 DE 0.03 E 0.03E 0.04 E 0.12 DE Transgenik GS-3 0.80 AB 0.03 E 0.03 E 0.03 E 0.08DE 0.06 D 0.06 DE Transgenik GS-4 0.40 CD 0.03 E 0.02 E 0.02 E 0.04E 0.02 E Transgenik GS-5 0.65 BC 0.15 DE 0.11 DE 0.08 DE 0.07DE 0.08 DE

Jumlah Daun (lembar): Nontransgenik GS-0 10.66 ABC 8.00DEF 7.00DEF 7.66 DEF 7.33DEF 7.66DEF 7.00EF Transgenik GS-1 10.00 AB 8.33CDE 8.33CDE 7.33 DEF 7.33DEF 8.33CDE 7.00DEF Transgenik GS-2 11.67 A 7.67DEF 7.67DEF 7.33 DEF 7.33DEF 8.00CDEF 7.00DEF Transgenik GS-3 10.67 ABC 7.33DEF 7.00DEF 7.00 DEF 7.33DEF 7.33DEF 7.67DEF Transgenik GS-4 6.67 DEF 5.17F 6.33DEF 7.17 DEF 6.00EF 12.50A 6.33DEF Transgenik GS-5 11.00 AB 9.00BCD 7.33DEF 8.00CDEF 6.67DEF 7.67DEF

Berat Kering Daun (g): Nontransgenik GS-0 1.96 BC 0.16EF 0.300EF 0.23 EF 0.13 EF 0.26EF 0.26EF Transgenik GS-1 2.47 AB 0.13EF 0.133EF 0.17 EF 0.10 EF 0.27EF 0.10EF Transgenik GS-2 3.00 A 0.27EF 0.133EF 0.10 EF 0.17 EF 0.13EF 0.23EF Transgenik GS-3 2.07 BC 0.13EF 0.100EF 0.10 EF 0.20 EF 0.13EF 0.10F Transgenik GS-4 1.33 CD 1.07DE 0.100F 0.43 EF 0.13 EF 2.00BC 0.10F Transgenik GS-5 1.95 BC 0.35EF 0.300EF 0.25 EF 0.20 EF 0.20EF

Panjang Akar cm): Nontransgenik GS-0 26.00

ABCDE 19.00 ABCDEF

26.67 ABCD

24.33 ABCDEF

20.33 ABCDEF1

28.33 ABCD

34.33AB

Transgenik GS-1 31.667 ABC

22.33 ABCDEF

21.00 ABCDEF

20.67 ABCDEF

19.83 ABCDEF

24.00 ABCDEF

17.67 ABCDEF

Transgenik GS-2 33.000 AB

24.00 ABCDEF

16.667 BCDEFG

24.33 ABCDEF

36.67 CDEFG

16.667 BCDEFG

27.67 ABCD

Transgenik GS-3 30.667 ABC

24.67 ABCDEF

20.333 ABCDEF

20.00 ABCDEF

32.00 ABC

21.000 ABCDEF

19.67 ABCDEF

Transgenik GS-4 21.333 ABCDEF

65.00 FG

81.67EFG 10.00 DEFG

10.33 DEFG

10.00G 20.33 ABCDEF

Transgenik GS-5 36.500 A 29.00ABC

36.67CD EFG

22.50 ABCDEF

28.33 ABCD

31.67 ABC

Keterangan: Data rataan pada kolom dengan huruf kapital yang sama, tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan pada α =0.05.

PEMBAHASAN

Adanya perbedaan respon terhadap penyiraman PEG antara tanaman

tembakau transgenik P5CS R2 zuriat dengan tanaman tembakau non transgenik.

Tanaman tembakau transgenik P5CS cenderung menunjukkan pertumbuhan yang

lebih tinggi dibandingkan dengan tanaman tembakau non transgenik akibat

perlakuan penyiraman PEG.

Kemampuan untuk menjaga pertumbuhan vegetatif dalam kondisi

cekaman kekeringan juga dikaitkan dengan kemampuan tanaman untuk menjaga

turgor pucuk selama terjadinya cekaman melalui akumulasi senyawa osmolit

tertentu seperti prolina.

Terdapat tanaman tembakau transgenik yang pertumbuhannya lebih

terhambat dibandingkan dengan tanaman tembakau non transgenik akibat

penyiraman dengan PEG, hal ini diduga karena adanya feedback inhibition pada

gen P5CS dari sel tanaman tembakau transgenik.

Perlakuan cekaman kekeringan secara terkontrol pada tanaman dapat

dilakukan dengan penyiraman PEG, karena di dalam air, PEG dapat larut dan

dapat menyebabkan penurunan potensial air secara homogen sehingga dapat

menimbulkan cekaman kekeringan bagi tanaman.

Salah satu respon tanaman terhadap cekaman kekeringan adalah

meningkatkan kandungan osmolit dalam sel, antara lain dengan mengakumulasi

senyawa prolina (Mundree et al. 2002). Ekspresi pembentukan prolina antara

masing-masing organ tanaman berbeda-beda. Hasil pengamatan menunjukkan

bahwa ekspresi pembentukan prolina pertama terjadi di akar, dimana konsentrasi

prolina yang terbentuk di akar lebih tinggi dibandingkan di daun akibat

penyiraman PEG 2.5%, dengan semakin meningkatnya konsentrasi PEG yang

diberikan sampai 15% terjadi ekspresi pembentukan prolina yang lebih tinggi

pada daun ( Gambar 27). Hal ini di duga sampai pemberian PEG 7.5% akar masih

mampu menjaga agar potensial osmotik jaringan tetap berada pada batas-batas

optimum, dengan memproduksi senyawa prolina yang lebih tinggi di bandingkan

prolina yang terbentuk di daun. Kondisi ini menunjukkan bahwa untuk menjaga

keseimbangan osmotik dalam jangka panjang maka tanaman harus mampu

menurunkan laju transpirasi dengan mereduksi biomassa tajuk dan

memakasimalkan penyerapan air melalui peningkatan pertumbuhan akar (Blum

et al. 1997).

Akumulasi prolina bersama senyawa osmolit yang lain dalam sel tanaman

dilaporkan dapat menurunkan potensial osmotik sel ketika tanaman mengalami

cekaman kekeringan (Blum 1996). Dengan demikian tanaman dapat tetap

mempertahankan tekanan turgor sel, penyerapan air dan kelangsungan berbagai

proses fisiologis dalam sel. Akumulasi senyawa osmolit dilaporkan merupakan

respon adaptif terhadap cekaman kekeringan pada berbagai jenis tanaman dan

diyakini berperan dalam proses adaptasi pada lingkungan yang tercekam

kekeringan (Serraj dan Sinclair 2002).

Tanaman tembakau transgenik lebih mampu mempertahankan

pertumbuhannya pada kondisi cekaman kekeringan sampai umur 55 HST, juga

berhubungan dengan panjang akar.

SIMPULAN

Dari hasil pengamatan dan uraian di atas dapat ditarik simpulannya

sebagai berikut:

1. Cekaman kekeringan yang diberikan dengan penyiraman larutan PEG

dapat menghambat pertumbuhan tanaman R2 zuriat dari tembakau GS

transgenik P5CS maupun tembakau non transgenik.

2. Pembentukan senyawa prolina yang tertinggi terjadi di organ daun

tanaman tembakau

VIII PEMBAHASAN UMUM

Perlakuan cekaman kekeringan pada tanaman cabai dan tembakau,

dilakukan dengan cara pengurangan air yaitu dengan membiarkan tanaman tidak

disiram dalam kurun waktu tertentu sampai menunjukkan gejala layu sementara

70% dari populasi tanaman atau daun/tanaman yang diuji. Dengan munculnya

gejala layu pada daun, maka tanaman tersebut dianggap telah mengalami cekaman

kekeringan dan diharapkan akan mengekspresikan semua kemampuannya secara

genetik untuk mengatasi dampak negatif dari cekaman kekeringan yang terjadi.

Tanaman yang mengalami cekaman kekeringan akan memberikan respon

yang berbeda dalam mengurangi dampak negatif yang ditimbulkan melalui

mekanisme pertahanan yang dimiliki oleh tanaman itu sendiri. Menurut Jones dan

Corlett (1992) mekanisme ketahanan tanaman terhadap cekaman kekeringan

adalah (1) penghindaran terhadap defisit air yang meliputi: a) melepaskan diri dari

cekaman misalnya dengan memperpendek siklus pertumbuhan dan

memperpanjang periode dorman, b) konservasi air pada tanaman yang

diwujudkan dalam bentuk ukuran daun yang kecil, penutupan stomata dan

penyerapan radiasi matahari yang terbatas, c) penyerapan air yang efektif,

diwujudkan dalam bentuk morfologi akar yang memanjang dan tebal, (2) toleran

terhadap defisit air yaitu dengan cara : a) memelihara tekanan turgor, b)

mengaktifkan larutan-larutan pelindung untuk aktivasi enzim-enzim yang toleran

kekeringan, dan (3) mekanisme efisiensi yaitu penggunaan air yang tersedia

secara efisien dan memaksimalkan indeks panen.

Umumnya, respon morfologis tanaman cabai terhadap cekaman

kekeringan yaitu dengan menurunkan BK tajuk, meningkatkan panjang akar dan

mempertahankan BK akar, sedangkan respon fisiologis yaitu dengan

meningkatkan kandungan prolina. Peranan prolina dalam mengatasi dampak

cekaman kekeringan pada cabai, terlihat jelas dengan adanya akumulasi prolina

yang jauh lebih tinggi pada varietas-varietas cabai yang lebih toleran.

Dari percobaan cekaman kekeringan pada fase vegetatif pada lima varietas

unggul nasional cabai (BAB III), cabai var. Tit Super dan Hot Chili digolongkan

ke dalam kelompok peka terhadap cekaman kekeringan memiliki peningkatan

kandungan prolina 646.31 dan 436.28%, sedangkan var. Prabu, Laris dan Jati

Laba yang dikategorikan ke dalam kelompok toleran, hanya memiliki peningkatan

kandungan prolina 305.06, 53.89 dan 12.62% akibat cekaman kekeringan.

Cekaman kekeringan pada fase vegetatif dan generatif pada lima varietas

cabai yang diuji (var.Tit Super, Hot Chili, Prabu. Laris, dan Jati Laba), tidak

didapat satupun varietas yang toleran terhadap kekeringan jika dihitung

berdasarkan indeks sensitivitas berdasarkan bobot dan jumlah buah. Sehingga

program pemuliaan tanaman dalam merakit tanaman cabai yang toleran cekaman

kekeringan terutama pada varietas unggul nasional masih perlu dijadikan

perioritas dalam kegiatan pemuliaan tanaman cabai.

Sifat toleransi tanaman terhadap cekaman kekeringan pada umumnya

dikendalikan secara genetik dengan melibatkan banyak gen (bersifat kuantitatif),

karena tanaman akan menginduksi beberapa gen yang berhubungan dengan

cekaman kekeringan untuk mengantisipasi dampak yang ditimbulkan akibat

cekaman tersebut. Toleransi tanaman terhadap kekeringan, telah terbukti sangat

erat hubungannya dengan peningkatan kandungan asam amino prolina. Gen

tunggal P5CS - penyandi ensim kunci biosintesis prolina sudah dapat diisolasi dan

digunakan pada tanaman contohnya: tanaman tembakau (sebagai tanaman model)

(Kavi Kishor et al., 1995). Melalui rekayasa genetika, gen tunggal P5CS

dimungkinkan dapat ditransformasi ke genom tanaman menggunakan

Agrobacterium.




dengan menggunakan vektor agrobacterium akan berhasil dan bermanfaat apabila



tunas dan akar dan kompetensi untuk ditransformasi merupakan dua kunci penting

penentu keberhasilan program transformasi genetik tanaman.



program perbaikan tanaman. Beberapa usaha yang dilakukan untuk mencapai

sistem regerasi yang efisien adalah dengan menentukan parameter penting yang


transformasi genetik untuk memperoleh tanaman cabai yang tahan terhadap


Pada BAB IV telah dilakukan studi regenerasi beberapa genotipe cabai

secara in vitro. Dari tiga belas genotipe cabai yang diregenerasikan secara in vitro,

genotipe yang paling respon untuk perbanyakan secara in vitro adalah Tit Super.

Eksplan daun muda dan hipokotil mempunyai potensi yang sama dalam

kapasitasnya untuk membentuk tunas secara in vitro. Perbedaan respon terutama

disebabkan oleh perbedaan genotipe tanaman (Mahmood et al. 1996). Menurut

hasil penelitiannya, Christopher dan Rajam (1996) melaporkan bahwa eksplan

daun lebih konsisten untuk membentuk tunas dibandingkan dengan eksplan

hipokotil dan kotiledon. Efisiensi tunas tergantung kepada eksplan yang

digunakan (Fari dan Zcako 1980; Zhu et al. 1998).

Di dalam sistem regenerasi tanaman secara in vitro paling tidak tiga faktor

penting yang sangat berpengaruh. Faktor-faktor tersebut adalah genotipe, tipe

eksplan dan komposisi media (Moghaieb 1999; Gubis et al. 2003). Media dasar

yang paling banyak digunakan adalah media dasar MS (Murashige dan Skoog

1962).

Berdasarkan hasil penelitian pada BAB IV, kemudian genotipe cabai yang

respon perbanyakan secara in vitro digunakan sebagai sumber eksplan untuk

introduksi gen P5CS ke dalam genom cabai guna mendapatkan galur cabai yang

tahan terhadap cekaman kekeringan.

Introduksi gen P5CS ke genom tanaman cabai, telah berhasil dilakukan

dan diperoleh 67 (enam puluh tujuh) nomor tanaman transgenik P5CS generasi

T0. Hasil PCR menunjukkan adanya pita pada ukuran 250 KB baik pada plasmid

maupun pada sel tanaman cabai yang tahan terhadap kanamisin. Tampak bahwa

gen nptII telah positif berada dalam genom tanaman cabai. Gen nptII yang

merupakan gen ketahanan terhadap antibiotik kanamisin diamplifikasi

menggunakan primer spesifik nptII.

Regeneran yang diperoleh setelah introduksi gen P5CS ke dalam genom

cabai cv. Tit Super memperlihatkan morfologi daun yang lebih besar

dibandingkan dengan daun dari tanaman cabai kontrol, ini diduga karena gen

P5CS merupakan enzim kunci dalam pembentukan senyawa prolina, diketahui

bahwa senyawa prolina merupakan salah satu senyawa yang bersifat osmolit di

dalam sel, dimana salah satu fungsinya sebagai homeostasi atau keseimbangan

ionik yang bertujuan untuk mempertahankan konsentrasi ion di tingkat seluler,

jaringan dan organ tanaman.

Ekspresi gen P5CS pada tanaman cabai transgenik diketahui dapat

meningkatkan kandungan prolinanya. Prolina akan terakumulasi di dalam

jaringan tanaman apabila tanaman tersebut mengalami cekaman kekeringan atau

pada keadaan cekaman salinitas tinggi. Widyasari dan Sugiyarta (1997)

menyatakan dalam keadaan normal, prolina yang dihasilkan bersifat umpan balik

dan karena kehadiran air, prolin akan dioksidasi kembali menjadi asam glutamat.

Oleh karena itu dalam kondisi normal konsentrasi prolina akan selalu rendah.

Pada kondisi cekaman kekeringan oksidasi prolina akan dihambat sehingga

produksi prolina akan bertambah dan dengan adanya gen P5CS produksi prolina

semakin meningkat karena enzim P5CS memicu katalisis glutamat menjadi

prolina. Oleh karena itu adanya akumulasi prolina dapat menjadi indikator

tanaman yang toleran terhadap kekeringan ..

Hasil analisis kandungan prolina pada cabai transgenik dan non transgenik

menunjukkan adanya variasi yang cukup tinggi. Kadar prolina yang bervariasi ini

kemungkinan disebabkan masuknya transgen P5CS ke dalam genom tanaman

terjadi pada intensitas dan posisi yang berbeda. Hal ini menyebabkan ekspresi

transgen P5CS dari masing-masing planlet cabai transgenik berbeda pula.

Dari hasil percobaan terhadap pengamatan pertumbuhan dalam kondisi

media tumbuh non-cekaman (BAB V), tembakau GS transgenik P5CS

menunjukkan pertumbuhan yang lebih baik dibandingkan tanaman tembakau GS

non-transgenik. Ini membuktikan bahwa over-ekspresi gen P5CS mampu

meningkatkan pertumbuhan tanaman melalui peningkatan kandungan prolina

yang berperan sebagai osmoregulasi dan osmoprotektan. Prolina dapat berperan

dalam menjaga potensial osmotik (PO) akar agar tetap dalam kondisi yang lebih

negatif dari PO media tumbuh, sehingga diduga kondisi ini dapat meningkatkan

daya serap akar terhadap molekul air maupun unsur hara dan menyebabkan

peningkatan produksi biomasa tanaman.

Perlakuan cekaman kekeringan pada tanaman R2 zuriat dari tembakau GS

transgenik P5CS generasi R1 dengan pengurangan air (BAB V) menunjukkan

bahwa semua tanaman tembakau yang diuji (tembakau transgenik P5CS dan non-

transgenik) mengalami penghambatan pertumbuhan yang nyata akibat cekaman

kekeringan pada periode umur 15 s/d 90 HST. Namun tanaman R1 zuriat dari

tembakau GS transgenik P5CS generasi R0 pada kondisi cekaman kekeringan

tersebut masih menunjukkan keragaan yang lebih baik dibandingkan tembakau

GS non-transgenik. Peningkatan kandungan prolina yang tinggi juga terlihat pada

tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R0, hal ini

membuktikan bahwa peningkatan akumulasi prolina akibat over-ekspresi gen

P5CS mampu mengurangi dampak negatif akibat cekaman kekeringan pada

tanaman. Hasil perhitungan indeks sensitivitas terhadap cekaman kekeringan,

tanaman R2 zuriat dari tembakau transgenik P5CS generasi R1.

Tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 yang

telah diuji cekaman kekeringan dengan cara pengurangan air, perlu diuji kembali

dengan cekaman kekeringan secara lebih terkontrol melalui pemberian berbagai

konsentrasi larutan PEG (BAB VI). Semakin berat tanaman tembakau mengalami

cekaman kekeringan, maka semakin besar pula kandungan prolina yang

terakumulasi pada tanaman.

IX SIMPULAN DAN SARAN UMUM

A. Simpulan Umum

1. Cekaman kekeringan mempengaruhi pertumbuhan tanaman cabai, baik

vegetatif maupun generatif.

2. Penurunan produksi cabai akibat perlakuan cekaman kekeringan ( cv.Tit Super 25.33%, Jati Laba 47.72%, Hot Chili 25.74%, Laris 52.63% dan Prabu 50.83%)

3. Varietas cabai Tit Super adalah varietas yang respon untuk perbanyakan

secara in vitro, dengan didapatkan varietas cabai yang respon perbanyakan secara in vitro ini dimungkinkan dilakukan rekayasa genetika untuk cabai.

4. Introduksikan gen P5CS dengan bantuan Agrobacteriun telah berhasil

dilakukan ke dalam genom cabai, dibuktikan dengan hasil PCR primer spesifik nptII 250 bp.

5 Pengujian tanaman model tembakau yang telah mengandung gen P5CS

terhadap cekaman kekeringan di rumah kaca menunjukkan bahwa tanaman transgenik lebih tahan terhadap cekaman kekeringan dengan mengakumulasikan pembentukan prolina yang lebih tinggi dibandingkan tanaman non transgenik.

6. Umur tanaman yang bertambah juga meningkatkan pembentukan senyawa

prolinanya. 7. Senyawa prolina yang terbentuk di setiap organ tanaman tidak sama,

dimana pembentukannya yang banyak terjadi di daun. B. Saran Umum

1. Rekayasa genetika cabai dapat dilakukan dengan menggunakan cabai cv. Tit Super, karena varietas ini respon untuk perbanyakan secara in vitro, dengan menggunakan eksplan daun muda.

2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk tahap aklimatisasi planlet

cabai.

DAFTAR PUSTAKA

Adisyahputra. 2006. Karakterisasi Dan Pewarisan Sifat Toleransi Terhadap

Cekaman Kekeringan Pada Kacang Tanah (Arachis Hypogaea L.). Disertasi S3. Prog. Studi Agronomi. Fak. Pertanian. IPB. Bogor

Adkins SW, Kunanuvatchaidah. R, dan Godwin. ID. 1995. Somaclonal variation in rice-drought tolerance and other agronomi characters. Aust.J.Bot. 43:201-209

Alberte RS, Thornber JP, Fiscus EL. 1977. Water stress effects on the content and organization of chlorophyl and bundle sheath chloroplast of maize. Plant Physiol. 59:351-352.

Agrawal SN, Chandra, Kotahri DL. 1989. Plant regeneration in tissue cultures of pepper (Capsicum annum L. cv. Mathania). Plant Cell Tissue Organ Culture, 16;47-55

Arroyo R, Reville A. 1991. In vitro plant regeneration from hypocotil and cotyledon segments in two bell pepper cultivars. Plant Cell Rep. 10:414-416

Asay KH, Johnson DA. 1983. Breeding for drought resistance in range grass. Iowa State J. of Research. 57(4) : 441-455

Bates LS, Waldren RP, Teare ID. 1973. Rapid determination of free proline for water stress studies. Plant and Soil 39: 205-207.

Bao JS, Yang CS, Xue JQ, Hao YC. 1991. The effect of water stress during Different growth periods of maize on its physiological characteristics. Acta Agronomica Sinica, 17 (4) : 261-266.

Blum. A. 1996. Crop responses to drought and the interpretation of adaptation Plant Growth Reg. 20:135-148.

Blum A. 2004. Drought stress and its impact. www.fao.org/ag/agp/agpc/doc/services /pbn/pbn

Bennet J. 1993. Genes for crop improvements. Genet. Eng. 16:93-113

Berke TG. 2002a. Hybrid Seed Production in Capsicum Di dalam: Basra AS, editor. Hybrid Seed Production in Vegetable: Rationale and Methods in Selected Crops. New York: Food Products Press. Hlm.49-67

Berke TG. 2002b. The Asian Vegetable Research and Development Center Pepper Project. Di dalam Proceeding of The 16th International Pepper Conference; Tampico, Tamaulipas, 10 – 12 Nov. 2002. www.world-pepper.org/ipc2002/proceedings/the asian research.pdf. [1 Sep. 2005]

Binns AN. 1990. Agrobacterium-mediated gene delivery and biology of host limitations. Physiologia Plantarum. 79:135-139

http://www.fao.org/ag/agp/agpc/doc

http://www.world-pepper.org/ipc2002/proceedings/the asian research.pdf. (21

http://www.world-pepper.org/ipc2002/proceedings/the asian research.pdf. (21

Boulter ME, McDonnel, Wright RC, Carnes, Shirsat MG. 1990. Transformation of Brassica napus L. (oilseed rape) using Agrobacterium tumefaciens and A. rhizogenes; a comparison. Pant Science. 70:91-99

Boslan PW. 1994. Chiles: history, cultivation, and uses. P.347-366. In: G. Charalambous (ed.), Spices, herbs, and edible fungi. Elsevier Publ., New York.

Bosland PW, Votata EJ. 2000. Peppers: vegetables and spice Capsicums. Cabi Publishing. New York.

Bray EA. 1997. Plant responses to water defisit. Trend in Plant Science 2(2):48-54

Cellier FG, Conejero JC, Breitler, Casse F. 1998. Molecular and physiological Responses to water deficit in drought-tolerant and drought-sensitive lines of Sunflower. J. Plant Physiol. 116 : 319-328.

Chabaud, Passiatore M, Canon JE, Buchanan-Wollaston V. 1988. Parameters affecting the frequency of kanamycin resistan alfalfa obtained by Agrobacterium tumafaciens mediated transformation. Plant Cell Report 7:512-516

Chapman SC, Ludlow MM, Blamey FPC, Fischer. KS. 1993. Effect of drought pod filling on utilization of water and growth of cultivars of groundnut (Arachis hypogaea L.). Field Crops Research Vol. 32 (3-4). p. 243-255.

Chrispeels MJ, Maurel C. 1994. Aquaporins: The molecular basis of facilitated water movement through living plant cells. Plant Physiol. 105: 9-13

Christopher T, Rajam MV. 1996. Effect of genotype, explant and medium on in vitro regeneration of red pepper. Plant Cell Tissue Culture. 46:245-250.

Collino DJ, Dardanelli JL, Sereno R, Racca RW. 2000. Physiological responses of argentine peanut varieties to water stress. Water uptake and water use efficiency. Field Crop Res 68:133-142

Conner AJ. 1997. Genetically engineered crops, enviromental dan food safety issue. The Royal Society of New Zealand, Wellington. 34p.

Crowe JJ, Crowe LM, Carpenter JF, Aurell CW. 1987. Stabilization of dry phospholipid bilayers and proteins by sugar.Biochem. J. 242: 1-10.

Dami I, Hughes HG. 1997. Effect of PEG-induced water stress on in vitro hardening of ‘valliant’ grape. Plant Cell Tiss Org Cult 47:97-101.

Day AG, Lichtenstein CP. 1990. Plant Genetic Transformation. In: Fowler MW, Warren GS, Mooyoun M, (eds.). Plants Biotechnology. Pergamon Press. Tokyo. 152-177

Delauney AJ, Verma DPS. 1993. Proline biosynthesis and osmoregulation in plants. Plant J 4:215-233.

Departemen Pertanian, Dirjen Produksi Hortikultura dan Aneka Tanaman. 2000. Informasi Hortikultura dan Aneka Tanaman Indonesia. Jakarta. DEPTAN. Jakarta. 56 hal.

D’Hallluin K, Botterman J, De Greef W. 1990. Engineering of herbicide resistant alfalfa and evaluation under field conditions. Crop Sci. 30:866-871

Dingkuhn M, Cruz RT, O'Toole JC, Turner NC Doerffling K. 1991. Responses of seven diverse rice cultivars to water deficits. Accumulation of abscisic acid and proline in relation to leaf water-potential and osmotic adjustment. Field Crops Res. 27:103-117.

Direktorat Jendral Bina Produksi Hortikultura. 2001. Produksi Tanaman Sayuran, Buah-buahan, Hias, dan Obat di Indonesia Tahun 2000. Dirjen Bina Produksi Hortikultura. Jakarta. 94 hal.

_____________________________________. 2007. Perkembangan luas panen sayuran tahun 1996-2005. [terhubung berkala]. http://www.deptan.go.id. [14 Desember 2007]

Duncan RR, Waskom RM, Nabors MW. 1995. In vitro sreening and field evaluation of tissue-culture-regenerated sorghum (Shorhum bicolor (L.) Moench.) for soil stress tolerance. Euphytica 85:373 – 380.

Duriat AS. 1996. Cabai Merah: Komoditas, Prospek dan Andalan. Di dalam Duriat AS, Hadisoeganda AWW, Soetiassa TA, Prabaningrum L, editor. Teknologi Produksi Cabai Merah. Lembang:Balitsa. Hal. 20-27

Ebida AI, Hu CY. 1983. In vitro morphogenetic responses and plant regeneration from pepper (Capsicum annuum L. cv. Early California Wonder) seedling explanlts. Plant Cell Rep. 13:107-110.

Everett, Robinson NP, Robinson KEP, Mascarenhas D. 1987. Genetic engeneering of sunflower (Helianthus anuus L.). Biotechnology. 5:1201-1204

Fari M, Zcako M. 1981. Relationship between position of morphogenetic response and regeneration of muskmelon plants. Plant Cell Rep. 9:160-164.

Fischer RA, Maurer R. 1978. Drought resistance in spring wheat cultivars: I. Grain yield responses. Aust J Agric Res 29: 897-912.

Franca-Netto JB, Kryzanowsky FC, Henning AA, West SH, Miranda LC. 1993. Soybean seed quality as affected by shriveling due to heat and drought stress. Environ Exp Bot 43:227-237

George EF, Sherington P. 1984. Plant Propagation by Tissue Culture. Exegenic Pub. Ltd. Englan. 709 p.

Gelvin SB. 1990. Crown gall disease and hairy root disease. A. Sledgehammer and A. Tackhammer. Plan Physiol. 92:281-285

Girousse C, Bournoville R, Bonnemain JL. 1996. Water deficit-induced changes in concentrations in proline and some other amino acids in the phloem sap alfafa. Plant Physiol 111: 109-113.

Graham J, McNicol RJ, Kumar A. 1990. Use of the GUSO-gene as seletable marker of Agrobacterium mediated transformation of Rubus. Plant Cell. Rep. 8:274-277

http://www.deptan.go.id/

Greenleaf WH. 1986. Pepper breeding. Di dalam Basset M.J., Editor. Breeding Vegetable Crops. The AVI Publishing Co. Westport, Connecticut: hlm 67-134.

Green SK. 1996. Viruses of pepper other than leaf curl virus. Protocol of Screening Virus Resistance on Pepper. AVRDC. 20 hal.

Greenberg BM, Glick. 1993. The use of recombinant DNA technology to produce genetically modified plants. Pp: 1-10. In D. Gierson (Ed.) Methods in plant molecular biology and biotechnology. CRC Press, Inc. New York.

Gresshoff PM, Doy CH. 1972. Development and differentitation of haploid Lycopersicon esculentum (tomato). Planta 107: 161-170.

Gubis J, Laichova, Farago J, Jurekova S. 2003. Effect of genotype and eksplant type on shoot regeneration in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.). Biologia Bratislava 59/3: 405 - 408

Gunawan LW. 1987. Teknik kultur Jaringan. Lab Kultur jaringan tanaman. PAU Bioteknologi IPB. Bogor. 244 hal.

Gunay AL, Rao PS. 1978. In vitro plant regeneration from hypocotil and cotyledon explants of red pepper (Capsicum). Plant Sci. Lett. 11:365-372

Gupta, US. 1997. Crop Improvement Stress Tolerance.Vol. 2. Science Publisher, Inc. USA.

Handa S, Hamada AK, Hasewaga PM, Bressan RA. 1986. Proline accumulation and adaptation of cultured plant cells to water stress. Plant Physiol. 80:938-945.

Hanson AD, Nelsen CE, Pedersen AR, Everson EH. 1979. Capacity for proline accumulation during water stress in barley and its implications for breeding for drought resistance. Crop Sci 19:489-493.

Herman M. 1996. Rekayasa genetika untuk perbaikan tanaman. Bul. Agrobio 1(1):24-34

Hyde CL, Phillips GC. 1996. Silver nitrate promotes shoot development and plant regeneration of pepper (Capsicum annuum L.) via organogenesis. In Vitro Cell Dev. Bio. 32:172-180

Hooker TS, Thorpe TA. 1997. Effect of water deficit stress on the developmental growth of excised tomato roots cultured in vitro. In vitro Cell. Dev. Biol. Plant 33:245-251.

Hong ZL, Zhang LK, Ming Z, Verma DPS, Hong ZL, Zhang ZM. 2000. Removal of feedback inhibition of delta 1 pyrrolyne 5 carboxylate synthetase results in increased proline accumulation and protection of plants from osmotic stress. Plant Physiol. 122:1129-1136

Hoykaas. PJJ. 1988. Agrobacterium moleculer genetics. Plant Mol.Biol.Manual A4:1-13.

Hu CA, Delauney AJ, Verma DPS. 1992. A bifunctional enzyme (delta1-pyrroline- carboxylate synthetase) catalyzes the first two steps in proline biosynthesis in plants. PNAS 89: 9354-9358

http://t.a.thorpe.1997.effect/

Hu H. 1985. Use of haploid in crop improvement. In Biotechnology in International Agriculture Research. Proceeding of The Inter-Center seminar on International Agriculture Reseacrh Centers (IARCs) and Biotechnology, IRRI, Philippines, 23-27 April 1985. IRRI. Manila Philippines, pp. 75-84.

Hu H, Zeng JZ. 1984. Development of new varietas via anter culture. Dalam: Ammirato PV, Evans DA, Sharp WR, Yamada Y editor. Handbook of plant cell culture. Volume 3. Macmillan Publishing company. New york. P 65-85.

[IISR] India Institute og Spices Research. 2006. Chillipeppers Database Varities. http://www.iisr.org/spices/chilli.php (2 Feb 2006).

Ingram. J, dan Bartels. 1996. The molecular basis of dehydration tolerance in plant. Ann. Rev. Physiol. Mol. Biol. 47.,377-403.

Irigoyen JJ, Emerich DW, Sanchez_Diaz M. 1992. Water stress induced changes in concentrations of praline and total soluble sugars in nodulated alfalfa (Medicago sativa L.) plants. Physiol Plant 84:55-60

Jensen AB, Busk PK, Figueras M, Alba MM, Peraccia G, Messeguer R, Goday A, Pages M. 1996. Drought signal tranduction in plant. Plant Growth Reg. 20: 105–110.

Jerez E, Torres W, Del’Amico J, Morales D. 1991. Physiological and Biochemical indicators in potato crops in response to water stress. Cultivos

Jones HG. 1981. Plants and Microclimate. A Quantitative approach to Enviromental Plant Physiology. Second edition. Cambrige University Press. 265-295.

Jones HG, Corlett JE. 1992. Current topics in drought physiology. J. of Agric. Sci. 49: 291-296

Kato R, Matsumoto M, Shimoda Y, Yamasaki S, Shimamura F. 1996. Effect of culture conditions on in vitro induction of adventitious bud from leaf Agric. Okayama University. 85:39-44

Kavi Kishor. PB, Hong Z, Miao GH, Hu, CA, Verma DPS. 1995. Overexpression of delta- pyrroline-5-carboxylate synthetase increases proline production and confers osmotolerance in transgenic plants. Plant Physiol. 108: 1387-1394

Kim YH, Janick J. 1991. Absisic acid and proline improve desiccation tolerance and increase fatty acid content of cerely somatic embryos. Plant Cell Tiss Org Cult 24: 83-89. Kirkham MB. 1990. Plant responses to water deficits. Pp. 323-342. In B.A.

Stewart and D. R. Nielsen (ed.) Irrigation of Agricultural Crops. Madison, Wisconsin USA.

Kramer PJ. 1983. Water relations of plants. Academic Press, Inc.

Kuznetsov VV, Shevyakova NI. 1997. Stress responses of tobacco cells to hight temperature and salinity. Proline accumulation and phosphorylation of polypeptides. Physiol Plant. 100:320-326.

http://www.iisr.org/spices/chilli.php (2

http://kirkham.m.b.1990.plant/

Levitt. J. 1980. Responses of plants to enviromental stresses: Water, radiation, salt, and other stresses. Vol. II. Academic Press. New York-London-

Toronto-Sydney-San Francisco.

Loggini B, Scartazza A, Brugnoli E, Navari-izzo F. 1999. Antioxidative defense system, pigment composition, and photosynthetic efficiency in two wheat cultivars subjected to drought. Plant Physiol 119:1091-1100.

Lusdorf MM, Rempel H, Jackson JA, Baliski DS, Hobbs SLA. 1991. Optimizing the production of transformed pea (Pisum sativum L.) callus using disarmed Agrobacterium tumefaciens strain. Plant Cell. Rep. 9:479-483

Madan S, Nainawatee HS, Jain RK, Chowdhury JB. 1995. Proline and proline metabolising enzymes in vitro selected NaCl-tolerant Brassica juncea L. under salt stress. Annals of Botany 76: 51-57.

Maestri M, Da Matta FM, Regazzi AJ, Barros RS. 1995. Accumulation of proline and queternary ammonium compounds in mature leaves of water stressed coffee plants (Coffea arabica and C. canephora). J. Hort. Sci. 70(2):229-233.

Mahmood M, Atan Z, Kow CW. 1995. Studies on tissue culture of different chilli cultivar ( Capsicum annuum L.). Asia Pasifik J. Molec. Biol. Biotech. 3:96-105

Mali PC, Mehta SL. 1977. Effect of drought on enzymes and free proline in rice varieties. Phytochemistry 16: 1355-1357.

Martinez CA, Moreno U. 1992. Physiological expressions of drought resistence In potato cultivsars subjected to water stress under field conditions. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, 4 (1) : 33-38.

Masyhudi MF, Petterson RP. 1990. The effect of water stress on nitrogen absorption of soybean. Ind J Crop Sci 42:43-63

Mc Cue KF, Hanson AD. 1990. Drought and salt tolerance: towards understanding and application. Trends Biotechnol. 8: 358-362.

Michel BE, Kaufmann MR. 1973. The osmotic potential of Polyethylene glycol 6000. Plant Physiol. 57 : 914-916.

Mitra J. 2001. Genetics and genetic improvement of drought resistance in crop plants. Current Sci. 80:758-763.

Mullet JE, Whitsitt MS. 1996. Plant celluler responses to water deficit. Plant Growth Reg. 20:119-124.

Mundree SG et al. 2002. Physiolocal and molecular insight into drought tolerance. African J Biotechnol 1(2):28 – 38

Murashige T, Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum. 15:473-497

Murashige, T, Eriksson T. 1998. A revised medium for rapid growth and biossay with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum. 15:473-497.

http://r.s.barros.1995.accumulation/

Messiaen CM. 1992. The Tropical Vegetable Garden. ICTA Macmillan. Hal: 234-245.

Moghaieb REA, Saneoka H, Fujita K. 1999. Plant regeneration from hypocotyls and cotyledon explant of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.). Soil Sci Plant Nutr 45: 639-646

Nambara E, Kawaide H, Kamiya Y, Naito S. 1998. Characterization of Arabidopsis thaliana mutans has a defect in ABA accumulation : ABA-dependent and ABA-independent accumulation of free amino acid during dehydration. Plant Cell Physiol. 39:853–958.

Naiola P, Syarief F. 1996. Analisa tata air pada dua spesies gulma babadotan (Ageratum conyzoydes L.) dan nampong (Clibadium surinamense L.) dalam hubungannya dengan daya adaptasi terhadap stres air dan salinitas. Hlm. 49-54. Dalam Prosiding Konperensi XIII HIGI, 5-7 November 1996, Bandar Lampung.

Nguyen HT, Babu R, Blum A. 1997. Breeding for drought resistance in rice: Physiology and molecular genetics considerations. Crop Sci. 37:1426-1434.

Notle KD, Hanson AD, Gage DA. 1997. Proline accumulation and methylation to proline betaine in citrus: Implication for genetic engineering of stress resistance. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 122(1):8-13.

Ober ES, Sharp RE. 1994, Proline accumulation in mazie (Zea mays L.) primary roots at low water potentials. Plant Physiol 105:981-987.

Ochoa-Alejo N, Garcia BMAR. 1992. Morphogenetic responses in vitro of hypocotyls tissue of chili pepper (Capsicum annuum L.) to growt regulators. Turrialba. 40:311-318

Patil NA, Patil TM. 1993. Physiological responses of groundnut genotypes to water stress. Legume Research, 16 (1-2) : 23-30.

Parrot WA, Bailey MA, Durham RE, Mathews HV. 1992. Tissue culture and genotype independent. Di dalam: Moss JP (Ed.) Biotehnology and Crop Improvement in Asia. International Crops. Research Institute for Semi-Arid Tropics. Patancheru, Andhra Pradesh 502 324, India. hal 115-148

Perez-Molphe-Balch EM et al. 1996. Effects of water stress on plant growth and root proteins in three cultivars of rice (Oryza sativa) with different levels of drought tolerance. Physiol Plant 96: 284–290.

Pierik RLM. 1987. Culture of Higher Plants. Boston. Dordrecht, Lancaster: Martinus Nijhoff Publishers. 344 hal.

Philips GC, Hubstenberger F. 1985. Organogenesis in pepper tissue culture. Plant Cell Tissue Organ Culture. 4:261-269.

Phillips GC, Collin GB. 1979. In vitro tissue culture of selected legumes and plant regeneration from callus cultures of red clover. Crop Sci. 19:59-64

http://d.a.gage.1997.proline/

Pookpadi A, Thiravirojana K, Saeradee I, Chaikaew S. 1992. Response of new soybean accessions to water stress during reproductive phase. Kasetsart J Nat Sci 24:378-387

Potts M. 1994. Desiccation tolerance in prokaryotes. Microbiol. Rev. 58: 755-805.

Popova LP, Tsonev TD, Lazova GN, Stoinova ZG. 1996. Drought and ABA-induced change in photosynthesis of barley plants. Physiologia Plantarum 96 : 623-629.

Puonti-Kaerlas J, Stabel P, Eriksson T. 1989. Transformation of pea (Pisum sativum L.) by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Rep. 8:321-324

Prasad PVD, Potluri SDF. 1996. Influence of proline and hydroxyproline on salt-stresses axillary bud cultures of two varieties of potato (Solanum tuberosum). In Vitro Cell Dev Biol Plant 32: 47 – 50.

Pruvot G, Massimino J, Peltier G, Rey P. 1996. Effect of low temperatur, high salinity and exogenous ABA on the synthesis of two chloroplastic drought-induced protein in Solanum tuberosum L . Physiol. Plantarum 97: 123–131

Riduan A, Sudarsono. 2004. Toleransi kultivar kacang tanah terhadap stres kekeringan pada fase vegetatif serta kandungan prolin dan gula total daun, di dalam: Sudarsono, Aswidinnoor H, Widodo (ed) Rekayasa genetika dan seleksi in vitro untuk mendapatkan plasma nutfah kacang tanah dengan novel characters – toleran stres kekeringan dan resisten penyakit busuk batang Sclerotium. Hlm 190-191.

Riduan A, Santoso J, Utomo SD, Sudarsono. 2007. Hubungan antara ekspresi gen P5CS dengan pertumbuhan dan hasil biomasa tembakau transgenik dalam kondisi non-stres. Agrotropika 12: 1-9

Rubatzky VE, Yamaguchi M. 1997. Word Vegetable, Principles, Production and Nutritive Value. Ed. Ke-2. London: Chapman and Hall.

Rukmana R, 1996. Usaha Tani Cabe Hibrida Sistem Mulsa Plastik. Yogyakarta. Kanisius. 91 hal.

Saint-Clair PM. 1976. Germination of Shorgum bicolor under polyethylene glycol induced stress. Can. J. Plant Sci. 56:21-24.

Sarkar RK. 1993. Effect of water stress on proline accumulation and its association with certain biochemical characters in soybean. Indian Journal of Plant Physiology 36: 184-186.

Savin R, Nicolas ME. 1996. Effect of short periods of drought and high temperature on grain growth and starch accumulation of two malting barley cultivas. Aust. J. Plant Physiol. 23:201-210.

Sharp, RE. 1994. Comparative sensitivity of root and shoot growth and physiology to low water potentials. Monogaph British Soc. Plant Growth Reg. 21:13-27.

Shimada S, Kokobun M, Shibada H, Matsui S. 1992. ffect of water supply and defoliation on photosynthesis, transpiration and yield of soybean. Japanese J Crop Sci 61:264-270

http://m.e.nicolas.1996.effect/

Slee NJD, Bryant JA, Smirnoff N, Smith BG. 1990. The effect of water deficit and ABA on protein synthasis in sunflower (Helianthus annuus) . Monograph British Society for Plant Growth Regulation, 21 : 332-333.

Sloane RJ, Patterson RP, Carter TE. 1990. Field drought tolerance of a soybean plant introduction. Crop Sci. 30: 118-123.

Steudle E, Frensch J. 1996. Water transport in plants: Role of the apoplast. Plant Soil 187: 67-79

Sudarsono, Aswidinnoor H, dan Widodo. 2006. Rekayasa genetika dan seleksi in vitro untuk mendapatkan plasma nutfah kacang tanah dengan novel characters – toleran stres kekeringan dan resisten penyakit busuk batang Sclerotium. Laporan Hibah Pasca Angkatan I. Direktorat Penelitian Dan Pengabdian Pada Masyarakat.Dirjen. Dikti. Departemen Pendidikan Nasional.

Sunaryo W. 2002. Regenerasi dan evaluasi variasi somaklonal kedelai (Glycine max (L) Merr.) hasil kultur jaringan serta seleksi terhadap cekaman kekeringan menggunakan simulasi polyethilene glycol (PEG). [Tesis]. Bogor: Institut Pertanian Bogor.

Setiadi. 2004. Bertanam cabai. Penebar Swadaya. Jakarta. 183 hal

Siregar, EBM. 1999. Transformasi Genetika dan Regenerasi Tanaman Cabai Transgenik (Capsicum annuum L.). Disertasi. Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. 105 hal.

Serraj R, Sinclair TR. 2002. Osmolyte accumulation: can it really help increase crop yield under drought conditions? Plant Cell Environ 25:333-342.

Taychasinpitak T, Taywiya P. 2003. Specific Combining Ability of Ornamental Pepper (Capsicum annuum L.). Kasetsart J 37:123-128.

Valera-Montero LL, Ochoa-Alejo N. 1992. A. Novel aproach for cilli pepper (Capsicum annuum L.) plant regeneration : shoot induction in rooted hypocotyls. Plant Sci. 84:215-219

Vallejo, P.R. dan J.D. Kelly. 1998. Traits related to drought resistance in common bean. Euphytica 99:127-137

Vieira RD, Tekrony DM, Eglia DB. 1992. Effect of drought and defoliation stress in the field on soybean seed germination and vigor. Crop Sci 32:471-475

Walton EF, Podivinsky E, Wu RM, Reynolds PHS, Young LW. 1998. Regulation of proline biosynthesis on kiwifruit buds with and without hydrogen cyanamide treatment. Physiol Plant. 102:171-178.

Wang Z, Quebedeaux B, Stutte GW. 1995. Osmotic adjustment : effect of water stress on carbohidrates in leaves, steams and roots of apple. Aust. J.Plant Physiol. 22:747-754.

Watimena, GA. 1992. Bioteknologi Tanaman. Pusat Antar Universitas. Institut Pertanian Bogor.

http://l.w.young.1998.regulation/

http://l.w.young.1998.regulation/

http://g.w.stutte.1995.osmotic/

White JW, Singh SP. 1993. Breeding to adaptation to drought. In Schoonhover, A.V. dan O.Vogsest (eds), Common Beans :Reseanch for Crops Improvement Centro Intematioanl de Agricultura Tropical Columbia.

Widyasari WB, Sugiyarta E. 1997. Akumulasi prolin dalam jeringan daun t varietas tebu tahan kering. Majalah Penelitian Gula. XXXIII (1), 1-10

Winans SC. 1992. Two-way chemical signaling in Agrobacterium plant interaction. Microbiol. Rev. 56(1):12-13.

Winarso PA. 1992. Evaluasi musim kemarau dan antisipasi musim kemarau 1992 wilayah musim Indonesia. Lokakarya Kiat menghadapi kemungkinan musim kemarau panjang 1992 untuk budidaya perkebunan. AP3I, Perhimpi dan BMG, 19-20 Februari 1992, Bandung.

Yakushiji,H., Morinaga K, Nonami H. 1998. Sugar accumulation and partitioning in Satsuma Mandarin tree tissue and fruit in response to drought stress. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 123(4):719-726.

Yamaguchi-Shinozaki, K. dan K. Shinozaki. 1994. A novel cis-acting element in an arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought, low temprature, or hight salt stress. The Plant Cell, 6 : 251-264.

Yancey PH, Clark ME, Hand SC, Bowlus PD, Somero GN. 1982. Living with water stress – Evolution of osmolyte systems. Science 217: 1214-1217.

Yang CW, Kao CH. 1999. Importance of ornithine-δ-transferase to prolin accumulation coused by water stress in detached rice leaves. Plant Growth Reg. 27: l89-192.

Yoshiba Y, Kiyoue T, Nakashima K, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. 1997. Regulation of levels of proline as an osmolyte in plants under water stress. Plant Cell Physiol 38: 1095-1102.

Xuefeng L. 1999. Evaluation of Sweet and Hot Peppers in Kamphaen Saen. www.acr-avrdc.org/pdf files/Lix)17-N).pdf [1 Des 2005]

Zambryski P, Tempe J, Schell J. 1989. Transfer and function of T-DNA genes from Agrobacterium Ti- and Ri-plasmid in plants. J. Mol. Biol. 56:193-201.

Zhu B, Su Jin M. Chang M,Verma DPS, Fan YL,Wu R. 1998. Overexpression of a Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase gene and analysis of tolerance to water- and salt-stress in transgenic rice. Plant Science 139:41-48.

Zhang ZH. 1989. The practicability of anther culture breeding in rice. In A Mujeeb-Kazi, LA Stich (eds). Review of Advances in Plant Biotechnology, 1985-88. Intternasional Maize and Wheat Improvement Center-International Rice Research Institute. Pp. 31-42

http://www.acr-avrdc.org/pdf

GALUR CABAI TRANSGENIK TOLERAN KEKERINGAN … filePERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI...

Documents

Transcript of GALUR CABAI TRANSGENIK TOLERAN KEKERINGAN … filePERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI...