FERMENTASI KARBOHIDRAT

(UJI GULA GULA)

Kemampuan memfermentasikan karbohidrat dan produk fermentasi yang di hasilkan merupakan ciri yang sangat berguna dalam identifikasi mikroorganisme. Biasanya bila dalam proses fermentasi karbohidrat menggunakan glukosa dalam media cair, maka hasil proses fermentasi bersifat asam dalam fermentasi ini terjadi reaksi kimia yaitu :

1. Fermentasi AlkoholC6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + 2NADH + 2 ATPGlukosa etanol

2. Fermentasi Asam LaktatC6H12O6 2 C2H5OCOOH + 2 ATP

Glukosa Asam Laktat

3. Fermentasi Asam Cuka

C6H12O6 2C2H5OH 2CH3COOH + H2O + 10 ATP

Glukosa Etanol Cuka

Dalam menguji fermentasi karbohidrat digunakan Glocose Agar, Sucrose Agar, dan Lactosa Agar dan

mannitol. indikator yang sering di gunakan adalah phenol red atau BCP.

Hasil (+)

UJI INDOL

Untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam memecah asam amino triptofan. Asam amino

triptofan merupakan asam amino esensial yang biasanya terdapat dalam protein, dan merupakan

sumber nitrogen bagi bakteri.

PRINSIP :

Untuk uji indol ini digunakan biakan E.coli dan E.aerogenes berumur 24 jam sampai 48 jam pada

medium TSB, di gunakan media Pepton dan Reagen Kovac’s

Pertama siapkan media pepton dan beri label. secara aseptik inokulaskan bakteri pada tiap-tiap

tabung biakan. Kemudian inkubasi pada suhu 37oC selama 24 sampai 48 jam, setelah itu teteskan

reagen Kovac’s pada tabung media yang telah di inkubasi, jika hasil (+) maka akan terbentuk

terbentuk cincin merah, karena asam amino dalam media pepton akan terurai dengan reaksi :

Tryptofan Indole + asam piruvat + amonia

Pembentukkan indol dari triptofan oleh mikroorganisme akan terindikasi dengan penambahan

indikator Kovac’s, karena akan bereaksi dengan indol yang menghasilkan senyawa tidak larut dalam

air dan membentuk warna merah pada permukaan media.

UJI METHYL RED

Untuk menentukan mikroorganisme dalam mengoksidasi glukosa dengan menghasilkan

asam dan juga untuk membedakan bakteri usus E.coli dengan E.aerogenes

PRINSIP :

Untuk uji Methyl Red ini digunakan biakan E.coli dan E.aerogenes berumur 24 jam sampai 48 jam

pada medium TSB, dan digunakan media MR-VP.

Pertama siapkan media MR-VP dan beri label. secara aseptik, inokulasikan bakteri pada masing

masing tabung biakan. Kemudian inkubasi pada suhu 37oC selama 24 sampai 48 jam, setelah itu

teteskan reagen Methyl Red pada tabung media yang telah di inkubasi, jika warna media pink(+),

maka pH dalam media sekitar kisaran 4,0, karena indikator methyl red akan berwarna merah pada

pH 4,0 dan jika media berwarna kuning(-) maka pH dalam media sekitar 5,6, karena indikator MR

berwarna kuning pada pH tersebut.

Media dapat berwarna merah atau kuning , karena bakteri E. Coli dan E.aerogenes dapat

memfermentasi glukosa dengan reaksi :

1. E.coli

C6H12O6 asam laktat + asam cuka + asam format + CO2 + H2O (pH =4,0)

2. E.aerogenes

C6H12O6 asam laktal + asam cuka ethanol dan asetilmetilkarbinol (pH = 6,5)

warna media merah, maka di dalam media (+) E.coli.

warna media kuning, maka di dalam media (+) E.aerogenes

UJI VOGES PROSKAUER

Untuk membedakan bakteri usus seperti ( E.coli, E.aerogenes dan Klebsiella pneumonia)

dalam menghasilkan hasil akhir berupa produk bukan asam (asetoin) dengan substrat glukosa.

PRINSIP :

Untuk uji Voges Proskauer ini digunakan biakan E.coli, E.aerogenes dan Klebsiella pneumonia

berumur 24 jam sampai 48 jam pada medium TSB, dan digunakan media MR-VP.

Pertama siapkan media MR-VP dan beri label. secara aseptik inokulaskan bakteri pada tiap-tiap

tabung biakan. Kemudian inkubasi pada suhu 37oC selama 24 sampai 48 jam, setelah itu teteskan

reagen KOH 40 % dan alfa – naftol 1 : 1 pada tabung media yang telah di inkubasi, jika pada media

terbentuk Cincin merah muda pada permukaan tabung, maka (+) memfermentasi glukosa menjadi

senyawa 2,3 butanadiol (senyawa netral ) dengan reaksi :

Glukosa asam asetat asetylmethylkarbinol 2,3 butanadiol + CO 2 + H2O

(pH > 6,0)

Senyawa 2,3 butanadiol atau asetoin akan bereaksi dengan reagen KOH yang di tambahkan akan

membentuk warna merah muda dan penambahan alfa-naftol untuk memperjelas perubahan warna.

Perubahan warna biakan terlihat jelas pada permukaan tabung, karena sebagian 2,3 butanadiol akan

dioksidasi kembali menjadi asetoin sehingga memperjelas hasil reaksi, berdasarkan hal tersebut,

maka tabung biakan di kocok hingga berbuih.

UJI PENGGUNAAN SITRAT

Untuk membedakan bakteri usus berdasarkan kemampuan untuk memfermentasikan sitrat.

PRINSIP :

Untuk uji Penggunaan Sitrat ini digunakan biakan E.coli, E.aerogenes dan Klebsiella pneumonia

berumur 24 jam sampai 48 jam pada medium TSB, dan digunakan media Agar Simmon’s Sitrat.

Pertama siapkan media Agar Simmon’s Sitrat dan beri label. secara aseptik inokulaskan bakteri pada

tiap-tiap tabung biakan. Kemudian inkubasi pada suhu 37oC selama 24 sampai 48 jam, setelah itu

teteskan reagen BTB, jika warna media menjadi biru maka (+) memfermentasikan sitrat.

Kemampuan bakteri memfermentasikan sitrat dengan reaksi :

Sitrat oxsaloasetat asam piruvat + CO2 + Na

Senyawa natrium dan CO2 yang dihasilkan akan bergabung dengan air dalam media membentuk

senyawa Na2CO3 yang bersifat basa. Senyawa natrium karbonat ini akan mengubah indikator BTB

dalam perbenihan dari hijau menjadi biru.

UJI TRIPLE SUGAR IRON AGAR (UJI H2S)

Untuk mengidentifikasi bakteri gram negatif kelompok enterobacteriaceae dalam memfermentasi 3

jenis gula dan uji pembentukan H2S.

PRINSIP :

Dalam TSIA ini digunakan biakan E.coli, Salmonella typphimurium, Shigella dysentriae, Proteus

vulgaris dan A.faecalis berumur 24 jam pada TSB dan digunakan media TSIA.

Pertama siapkan media agar TSIA dan beri label. secara aseptik, inokulasikan bakteri pada masing-

masing tabung biakan dengan teknik Stab and Streak,tutup tabung biakan jangan terlalu

dikencangkan. Kemudian inkubasi pada suhu 37oC selama 24 sampai 48 jam, setelah itu teteskan

reagen phenol red untuk uji fermentasi 3 jenis gula dan FeSO4 untuk uji H2S. Reaksi dibaca setelah

kurun waktu 24 – 48 jam.

Aktivitas fermentasi karbohidrat dapat dilihat sebagai berikut :

1. Lereng Merah dan dasar kuning = hanya glukosa yang di fermentasi

2. Lereng kuning dan dasar kuning = laktosa dan atau sukrosa yang di fermentasi

3. Lereng Merah dan dasar merah = ketiga jenis gula tidak difermentasi

Untuk pembentukkan H2S, maka akan terbentuk endapan hitam pada dasar tabung, karena reagen

FeSO4 yang di tambahkan akan beraksi dengan H2S membentuk FeS yang berwarna hitam dengan

reaksi :

Sistein asam piruvat + H2S

H2S + FeSO4 FeS + H2SO4

UJI REDUKSI NITRAT

Untuk menentukan kemampuan beberapa mikroorganisme dalam mereduksi nitrat menjadi nitrit

atau di luar bentuk nitrit sebagai aseptor elektron terakhir.

PRINSIP :

Untuk uji reduksi nitrat ini digunakan biakan E.coli, A.faecalis dan P.aeruginosa berumur 24 jam

sampai 48 jam pada medium TSB, di gunakan media kaldu nutrien KNO3 0,5%

Pertama siapkan media kaldu nutrien KNO3 0,5% dan beri label. secara aseptik inokulaskan bakteri

pada tiap-tiap tabung biakan dan gunakan tabung durham untuk melihat pembentukkan gas N2,

kemudian inkubasi 37oC selama 24 – 48 jam. Kemudian tambahkan reagen asam sulfanilat dan alfa-

naftilamin 1 mL, jika media bewarna merah atau merah muda maka, (+) mereduksi nitrat menjadi

nitrit, karena nitrit akan bereaksi dengan asam sulfanilat dan alfa-naftilamin membentuk warna

merah dengan reaksi :

Asam sulfanilat + alfa-naftilamin + nitrit sulfobenzena azo-alfa naftilamin (merah)

Apabila jika pada tabung tidak terjadi perubahan warna, maka tambahkan bubuk Zn untuk melihat

reduksi nitrat menjadi nitrit. Maka akan segera media berubah warna menjadi merah, karena nitrit

hasil reduksi nitrat oleh Zn akan bereaksi dengan reagen.

UJI OKSIDASE

Untuk menentukan kemampuan bakteri dalam aktivitas sitokrom oksidase

PRINSIP :

Pada uji ini, digunakan Media perbenihan Agar plat dan reagen tetramethyl-p-phenylenediamine

dihydrocloride. Pertama buat media, kemudian dengan teknik aseptik inokulasi tiap-tiap bakteri

dengan teknik single line streak inoculation, kemudian inkubasi pada suhu 37oC selama 24-48 jam.

Reagen reagen tetramethyl-p-phenylenediamine diteteskan pada kertas saring. Kemudian secara

aseptik, satu ose penuh koloni bakteri dioleskan diatas tetesan reagen. Jika koloni berubah warna

menjadi merah marun menunjukan tes (+) dan jika tidak terjadi perubahan warna (-).

UJI KATALASE

Untuk menentukan kemampuan bakteri dalam menguraikan Hidrogen peroksida dengan enzim

katalase

PRINSIP :

Dalam uji ini digunakan biakan S.aureus dan Strep.lactis yang berumur 24-48 jam dalam TSB,

menggunakan media biakan agar plat dan reagen H2O2 3%. Pertama siapkan agar plate untuk

inokulasi tiap-tiap bakteri, kemudian inokulasikan bakteri dengan teknik aseptik, inkubasi pada suhu

37oC selama 24-48 jam. koloni bakteri diambil satu ose penuh secara aseptis dan diinokulasikan pada

Object glass. Kemudian dipipet dengan pipet tetes, 3% H2O2 diteteskan pada Object glass

secukupnya. Setelah itu diamati, jika hasil (+) terbentuk gelembung. Hal ini dikarenakan H2O2 akan

diuraikan oleh enzim katalase yang dihasilkan oleh bakteri menjadi air dan oksigen dengan reaksi :

2H2O2 catalase 2H2O + O2

UJI UREASE

Untuk menentukan kemampuan bakteri dalam menguraikan urea oleh enzim urease.

PRINSIP :

Dalam uji ini digunakan media agar miring urea dan indikator Phenol red. Pertama siapkan agar miring urea untuk di inokulasikan masing-masing bakteri dan beri label. Kemudian inokulasikan bakteri dengan ose secara aseptik, inkubasi pada suhu 37oC selama 24-48 jam. Teteskan reagen phenol red, jika terjadi perubahan warna menjadi merah (+) menguraikan urea. Hal ini disebabkan karena urea di uraikan menjadi ammonia dengan reaksi :

Urea CO2 + H2O + 2NH3

sehingga pH media menjadi basa yang akan merubah indikator phenol red menjadi merah.