Proses hidrolisis secara enzimatis biasanya berlangsung pada kondisi yang ringan (pH

sekitar 4,8 dan suhu 45–50°C) dan tidak menimbulkan masalah korosi. Kelemahannya adalah

harga enzim cukup mahal. Komponen biaya enzim dapat mencapai 53–65% dari biaya bahan

kimia, dan biaya bahan kimia sekitar 30% dari biaya total. Enzim selulase biasanya merupakan

campuran dari beberapa enzim, Sedikitnya ada tiga kelompok enzim yang terlibat dalam proses

hidrolisis selulosa, yaitu 1) endoglukanase yang bekerja pada wilayah serat selulosa yang

mempunyai kristalinitas rendah untuk memecah selulosa secara acak dan membentuk ujung

rantai yang bebas, 2) eksoglukanase atau selobiohidrolase yang mendegradasi lebih lanjut

molekul tersebut dengan memindahkan unit-unit selobiosa dari ujungujung rantai yang bebas,

dan 3) β-glukosidase yang menghidrolisis selobiosa menjadi glukosa. Jumlah enzim yang

diperlukan untuk hidrolisis selulosa berbeda-beda, bergantung pada kadar padatan tidak larut air

(water insoluble solids) pada bahan yang akan dihidrolisis. Sampai tahap tertentu, semakin

banyak selulase yang digunakan, semakin tinggi rendemen dan kecepatan hidrolisis, namun juga

meningkatkan biaya proses. Hidrolisis selulosa juga dapat dilakukan dengan menggunakan

mikrob yang menghasilkan enzim selulase, seperti Trichoderma reesei, Trichoderma viride, dan

Aspergillus niger.

Fermentasi adalah teknik konversi biologis dari substrat kompleks menjadi senyawa

sederhana oleh berbagai mikroorganisme. Telah banyak digunakan secara luas untuk produksi

selulase dalam industri. Terdapat dua teknik fermentasi yang sering digunakan yaitu Submerged

Fermentation (SMF) dan Solid State Fermentation (SSF).

a. Solid State Fermentation (SSF)

SSF menggunakan substrat padat, seperti dedak, ampas tebu, jerami padi, limbah pertanian

lainnya dan pulp kertas (Subramaniyam dan Vimala, 2012). Keuntungan utama

menggunakan substrat ini adalah bahwa bahan limbah kaya nutrisi dapat dengan mudah

didaur ulang sebagai substrat yang lebih murah. SSF paling cocok untuk teknik fermentasi

yang melibatkan jamur dan mikroorganisme yang membutuhkan kadar air sedikit. Namun,

tidak dapat digunakan dalam proses fermentasi yang melibatkan organisme yang

membutuhkan air yang tinggi aktivitas, seperti bakteri (Babu dan Satyanarayana, 1996).

b. Submerged Fermentation (SmF)

SmF menggunakan substrat cair, seperti molase dan kaldu (Subramaniyam dan Vimala,

2012). Teknik fermentasi ini paling cocok untuk mikroorganisme seperti bakteri yang

memerlukan kadar air tinggi. Keuntungan tambahan dari teknik ini adalah bahwa pemurnian

produk lebih mudah.

Mikroba selulolitik merupakan pendegradasi utama selulosa tetapi umumnya tidak

memanfaatkan lipid atau protein sebagai sumber energi. Jamur dapat tumbuh dan memanfaatkan

residu agro-industri yang lebih baik daripada mikroba lain karena sangat mirip dengan habitat

alami mereka. Jamur filamen dikenal sebagai sumber daya yang efektif untuk industri selulase.

Beberapa jamur telah banyak digunakan untuk produksi komersial selulase tergantung pada

aplikasi utama mereka (Singhania, 2009). Sebagian besar selulase komersial yang diproduksi

oleh Trichoderma ressei dan β-D-glucosidase dihasilkan dari Aspergillus niger.

Aspergillus niger mempunyai bagian yang khas yaitu hifanya yang berseptat, spora yang

bersifat aseksual dan tumbuh memanjang diatas stigma, mempunyai sifat aerobik, sehingga

dalam pertumbuhannya memerlukan oksigen dalam jumlah yang cukup. Aspergillus niger dapat

tumbuh pada suhu 350C-370C (optimum), 60C-80C (minimum), 450C-470C (maksimum). Kisaran

pH yang dibutuhkan 2,8-8,8 dengan kelembaban 80-90%. Habitat Aspergillus niger kosmopolit

di daerah tropis dan subtropis, mudah didapatkan dan di isolasi dari udara, tanah dan air (Fardiaz,

1989). Enzim ekstraseluler yang dihasilkan Aspergillus niger diantaranya, enzim selulase, enzim

kitinase, α-amilase, β-amilase, glukoamilase, katalase, pektinase, lipase, laktase, invertase, asam

protease (Rat ledge, 1994).

Faktor-faktor yang mempengaruhi proses pertumbuhan fungi:

a. Kebutuhan Air

Kebanyakan jamur membutuhkan air minimal untuk pertumbuhannya lebih rendah

dibandingkan khamir dan bakteri (Srikandi.F, 1989).

b. Suhu Pertumbuhan

Kebanyakan jamur bersifar mesofilik, yaitu tumbuh baik pada suhu kamar. Suhu optimum

pertumbuhan untuk kebanyakan jamur adalah sekitar 250C300C, tetapi beberapa dapat

tumbuh pada suhu 350C-370C atau lebih tinggi, misalnya Aspergillus. Beberapa jamur

bersifat psikotropik yaitu dapat tumbuh baik pada suhu lemari es dan beberapa biakan masih

dapat tumbuh lambat pada suhu dibawah suhu pembekuan, misalnya pada suhu - 50C sampai

– 100C. Beberapa jamur yang bersifat termofilik yaitu dapat tumbuh pada suhu tinggi

(Srikandi.F, 1989).

c. Kebutuhan Oksigen dan pH

Semua jamur bersifat aerobik yaitu membutuhkan oksigen untuk pertumbuhannya.

Kebanyakan jamur dapat tumbuh pada kisaran pH yang luas yaitu pH 2-8,5 tetapi biasanya

pertumbuhannya akan lebih baik pada kondisi asam atau pH rendah (Srikandi.F, 1989).

d. Substrat atau Media

Pada umumnya jamur dapat menggunakan berbagai komponen makanan dari yang

sederhana sampai kompleks. Kebanyakan jamur memproduksi enzim hidrolitik misalnya

amylase, pektinase, proteinase, dan lipase. Oleh karena itu dapat tumbuh pada makanan

yang mengandung pati, protein, pectin, dan lipid (Srikandi.F, 1989).

e. Komponen Penghambat

Beberapa jamur mengeluarkan komponen yang dapat menghambar organisme lainnya.

Komponen ini disebut antibiotik. Beberapa komponen lain bersifat mikostatik yaitu

penghambat pertumbuhan jamur atau fungisidal yang membunuh jamur. Pertumbuhan jamur

biasanya berjalan lambat bila dibandingkan dengan pertumbuhan bakteri dan khamir. Jika

kondisi pertumbuhan memungkinkan semua mikroorganisme untuk tumbuh, jamur biasanya

kalah dalam kompetisi dengan khamir dan bakteri. Tetapi sesekali jamur dapat mulai

tumbuh, pertumbuhan yang ditandai dengan pertumbuhan miselium dapat berlangsung

dengan cepat (Srikandi.F, 1989).

Fermentasi yang digunakan adalah fermentasi padat. Mikroorganisme yang tumbuh

melalui sistem fermentasi padat berada pada kondisi pertumbuhan di bawah habitat alaminya,

mikroorganisme tersebut dapat menghasilkan enzim dan metabolisme yang lebih efisien

dibandingkan dengan sistem fermentasi cair. Sistem fermentasi padat memiliki lebih banyak

manfaat dibandingkan dengan sistem fermentasi cair, diantaranya tingkat produktivitasnya

tinggi, tekniknya sederhana, biaya investasi rendah, kebutuhan energi rendah, jumlah air yang

dibuang sedikit, recovery produknya lebih baik, dan busa yang terbentuk sedikit. Sistem

fermentasi padat ini dilaporkan lebih cocok digunakan di negara-negara berkembang. Manfaat

lain dari sistem fermentasi padat adalah murah dan substratnya mudah didapat, seperti produk

pertanian dan industri makanan (Tanyildizi dkk, 2007).

Enzim yang dihasilkan melalui proses sistem fermentasi padat baik yang belum

dimurnikan atau yang dimurnikan secara parsial dapat diaplikasikan di industri (seperti pektinase

digunakan untuk klarifikasi jus buah, alpha amilase untuk sakarifikasi pati). Murahnya harga

residu pertanian dan agro-industri merupakan salah satu sumber yang kaya akan energi yang

dapat digunakan sebagai substrat dalam sistem fermentasi padat. Fakta menunjukkan bahwa

residu ini merupakan salah satu reservoir campuran karbon terbaik yang ada di alam. Dalam

sistem fermentasi padat, substrat padat tidak hanya menyediakan nutrien bagi kultur tetapi juga

sebagai tempat penyimpanan air untuk sel mikroba (Tanyildizi dkk, 2007).

Untuk memproduksi enzim selulase menggunakan Aspergillus niger dengan substrat jerami

melalui proses sistem fermentasi padat dilakukan beberapa tahapan sebagai berikut:

a. Penyiapan bahan baku

Sebelum digunakan sebagai medium fermentasi ampas tebu dicacah agar mendapat ukuran yang

homogen.

b. Penumbuhan

Inokulasi dilakukan dengan menumbuhkan organisme dalam Potato Dextrose Agar dan

diinkubasi dalam suhu ruang selama 5 hari (Harini dan Kumaresan, 2014).

c. Media penanaman

Ke dalam erlenmeyer ditambah larutan nutrisi (NaH2PO4 4,7%, CaCl2 0,1%, KH2PO4 1,02%,

MgCl2 0,02% dan urea 0,3% (b/v)). Kemudian dilakukan pengaturan pH menjadi pH 4.

Erlemeyer ditutup dengan kapas steril dan kertas, dilapisi dengan aluminium foil. Media

kemudian disterilkan menggunakan autoclave selama 15 menit pada suhu 121°C (Harini dan

Kumaresan, 2014 dengan modifikasi).

d. Produksi enzim

Media hasil sterilisasi didinginkan terlebih dahulu kemudian biakan Aspergillus niger

diambil dari media PDA (Potato Dextrose Agar) dengan menggunakan kawat ose dan

disuspensikan ke dalam medium fermentasi. Medium kemudian disebar secara merata pada

substrat bagasse tebu yang telah dicacah, selanjutnya dilakukan fermentasi selama 5 hari

pada suhu 30oC (Harini dan Kumaresan, 2014 dengan modifikasi substrat).

e. Pemanenan enzim

Pemanenan enzim dilakukan pada akhir fermentasi. Hasil fermentasi disaring dan filtrat

kemudian disentrifugasi pada 6000 rpm selama 20 menit, dan supernatannya digunakan

sebagai sumber enzim ekstraseluler (Harini dan Kumaresan, 2014).

f. Analisa protein

Konsentrasi protein dalam ekstrak ekstraseluler ditentukan dengan metode Lowry. Perbedaan

konsentrasi BSA (Bovine Serum Albumin) sebagai protein standar, direaksikan dengan

reagen Lowry dan absorbansi pada panjang gelombang 660 nm. Sebuah grafik standar diplot

antara konsentrasi protein di dan absorbansi pada 660 nm. Ekstrak direaksikan dengan reagen

Lowry dan absorbansi pada panjang gelombang 660 nm. Absorbansi ini dibandingkan

dengan grafik standar untuk mendapatkan konsentrasi protein dalam ekstrak ekstraseluler

(Protocol, 1994 dalam Harini dan Kumaresan, 2014).

g. Hidrolisis enzimatik

Ampas tebu dari hasil pretreatment ditimbang dan dimasukkan ke dalam beaker glass.

Selanjutnya ditambahkan larutan buffer sitrat pH 4.8 dan enzim. Selanjutnya, dimasukkan ke

dalam waterbath shaker selama 48 jam dengan suhu 50°C dan kecepatan pengadukan 75 rpm

(El-Zaher dkk., 2010). Sampel diambil setiap 6 jam selama 48 jam. Pada setiap pengambilan

sampel, pengadukan dihentikan untuk mengendapkan bubuk ampas tebu.

h. Pengukuran kadar glukosa

Analisis kadar glukosa dilakukan dengan metode DNS (Dinitrosalicylic acid) yaitu sampel

hasil hidrolisis enzimatik dimasukkan ke dalam tabung reaksi, selanjutnya ditambahkan

akuades dan reagen DNS. Tabung reaksi dipanaskan pada air mendidih selama 5 menit agar

terjadi reaksi antara glukosa dalam sampel dengan DNS. Tabung didinginkan hingga

mencapai suhu ruang, selanjutnya absorbansi sampel diukur pada panjang gelombang 540

nm dengan spektrofotometer (Harini dan Kumaresan, 2014).

Pada tahap sakarifikasi, selulosa diubah menjadi selobiosa dan selanjutnya menjadi gula-

gula sederhana seperti glukosa. Hidrolisis selulosa dapat dilakukan menggunakan larutan asam

atau secara enzimatis. Proses hidrolisis selulosa menggunakan asam encer dilakukan pada suhu

dan tekanan tinggi dalam waktu yang singkat, beberapa detik sampai beberapa menit, sehingga

memungkinkan untuk dilakukan secara kontinu. Proses hidrolisis selulosa menggunakan asam

pekat dilakukan pada suhu yang relatif rendah dan tekanan yang diperlukan hanyalah untuk

memompa bahan dari satu alat ke alat lain (Demirbas 2005).

Molekul selulosa ditandai dengan ikatan β-1,4-glukosida antara unit glukosa berurutan.

Ada tiga kelompok hidroksil reaktif di setiap unit glukosa. Asam dapat menyerang ikatan β-1,4-

glukosida selulosa dan menyebabkan degradasi. Reaksi berlangsung dalam tiga langkah.

Pertama, protonasi cepat dari atom oksigen glukosida, kedua, transfer muatan positif ke karbon

nomor satu menghasilkan kation karbonium siklik dan pembelahan hubungan glukosida, dan

akhirnya, penambahan air ke ion karbonium (Kräaaig, 1993). Menggunakan asam encer, selulosa

dapat terdegradasi menjadi glukosa, tapi hasil yang rendah karena encer asam tidak menembus

daerah kristalin selulosa.

Setelah ekstraksi lignin, fraksi padat yang tersisa dihidrolisis menggunakan HCl 0,5%

pada 100oC selama 5 jam dengan laju agitasi 60 rpm. (Aguilar et al., 2002). Kemudian hidrolisat

dipisahkan melalui filtrasi. Kemudian penentuan konsentrasi gula menggunakan HPLC. Efisiensi

katalis HCl dalam menghidrolisis bagase tebu dihitung menggunakan persamaan (modifikasi

Rodriguez-Chong et al., 2004):

E= Ƹs1+Ƹ 1

Dimana Ƹs merupakan total konsentrasi gula pada hidrolisat dan Ƹ1 merupakan total konsentrasi

inhibitor pada hidrolisat.

A. Fermentasi