I. TUJUAN

1. Mahasiswa memahami prinsip pemisahan dengan metode

elektroforesis

2. Mahasiswa dapat melaksanakan pemisahan dengan metode

elektroforesis

II. DASAR TEORI

Molekul dalam larutan sering berupa partikel bermuatan. Apabila

medan listrik diberikan pada larutan tersebut maka setiap ion bergerak

menuju elektroda yang berlawanan muatannya. Ini yang mendasari konsep

dasar elektroforesis (Hendayana, 2006).

Elektroforesis adalah metode pemisahan, didasari atas kemampuan

sampel yang bermuatan untuk melewati medium konduktor didalam

larutan penyangga. sampel yang bermuatan positif menuju katoda dan

sampel yang bermuatan negatif menuju anoda.

Kecepatan sampel menuju katoda/anoda dipengaruhi oleh muatan

yang dimiliki sampel dan ukuran sampel. Sampel yang memiliki muatan

yang besar dan memiliki ukuran yang kecil akan berpindah menuju

katoda/anoda lebih cepat (Harvey, 2000).

Media tempat pemisahan yang digunakan masing-masing ujungnya

tercelup dalam larutan buffer. sampel diteteskan pada bagian tengah media

tersebut. Salah satu larutan buffer dihubungkan melalui elektroda negatif

arus searah dan larutan buffer lainnya dihubungkan melalui elektroda

positif arus searah. Hasil ditunjukkan dengan adanya noda berwarna di

media pemisah. (Hendayana, 2006).

Perpindahan sampel di media tergantung tanda dan besarnya muatan

pada zat terlarut, permukaan, muatan, tegangan yang digunakan,

konsentrasi elektrolit, kuat ion, pH, temperatur, viskositas, adsorptivitas

zat terlarut. Lintasan yang ditempuh partikel bermuatan sesuai dengan:

1

d=U . t .eq .k

=U t .V

L

Keterangan :

V = Tegangan

L = Panjang saluran

K = Konduktivitas

I = Arus listrik

U = Mobilitas ion pada saat t

Q = Luas penampang

d = Lintas yang ditempuh

Elektroforesis mudah dilakukan namun hasil pemisahan sering

tidak memuaskan, noda sering tumpang tindih sehingga susah dibedakan,

tidak dapat mendeteksi konsentrasi cuplikan yang rendah dan waktu yang

dibutuhkan untuk melakukan satu analisis terlalu lama. Untuk

mempercepat dapat dilakukan dengan menambah tegangan listrik arus

searah namun hasilnya tetap kurang efisien. Hal ini disebabkan tegangan

listrik yang tinggi dapat menimbulkan panas sehingga menurunkan

efisiensi pemisahan

Sifat aliran pada elektroforesis ada 2. Aliran elektroforetik yaitu,

sifat alamiah ion-ion selalu bergerak menuju kutub listrik yang

berlawanan. Aliran elektroosmotik yaitu terjadi apabila arus listrik searah

bertegangan tinggi dialirkan diantara ujung-ujung pipa kapiler sehingga

anion yang melapisi permukaan pipa kapiler tersebut akan bergerak

menuju anaoda (Hendayana, 2006).

DNA yang telah dipisahkan diwarnai dengan ethidium bromida.

Larutan ini mengandung planar yang dapat meresap pada setiap DNA

sehingga DNA dapat berwarna merah-orange jika diamati dengan UV254

(Sambrook, 1990).

2

III. ALAT DAN BAHAN

1. Alat :

- Elektroforesis set

- Pipet mikro 200 µl dan 20 µl

- Chamber

- Mikrowave

- Tips (kuning dan kristal)

- Magnetic Stirer

- Stirer Bar

- UV transluminator

- Cetakan

- Comb

- Shaker

2. Bahan :

- Agarose 1,2 %

- TAE (Trisacetic Edta)

- Marker DNA Leader 100-

1500 bp

- Loading buffer

- Sampel DNA

- EtBr

- Aquades

IV. PROSEDUR KERJA

a. Pembuatan Gel :

Agarose gel dipanaskan dengan mikrowave sampai cair.

Diletakkan pada magnetic stirer hingga mencapai suhu sekitar 50oC

Agarose yang telah cair dituang ke dalam cetakan yang telah berisi comb.

Didiamkan hingga dingin dan memadat.

Ditambahkan TAE.

Comb diangkat sehingga terbentuk sumur pada gel.

3

Gel dipindahkan ke elektroforesis set.

b. Elektroforesis

Gel dicuci dengan pipet 200 µl.

Dibuat campuran sampel yang terdiri dari 1 µl loading buffer dan 5 µl

sampel DNA.

Sampel dimasukkan ke dalam sumur gel dengan pipet 20 µl.

Run selama 30 menit (110 volt).

Dimasukkan pada larutan EtBr 10 L/100 mL aquadest kemudian dihaker

selama 25 menit

Dicuci di aquades.

Divisualisasi pada UV transluminator.

Hasil elektroforesis difoto.

4

V. PEMBAHASAN

Elektroforesis Gel adalah metode analisis berdasarkan kemampuan

pergerakan protein di dalam medan listrik. Pergerakan tersebut dipengaruhi

oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari protein. Pergerakan

dapat dimulai setelah protein yang sudah diletakan didalam penyangga dan

diiisi dengan buffer di aliri arus listrik (Pratiwi, 2001).

Adapun tahapan yang harus dikerjakan dalam praktikum elektroforesi

gel adalah penyiapan gel, Penyiapan sampel, dan Elektroforesis. Tahap

pertama yang dilakukan adalah penyiapan gel, gel yang digunakan yaitu

agarosa. Agarosa dipilih karena rentang bp yang mampu dipisahkan cukup

besar yaitu dari 50 bp – 50 kbp (Sudjadi, 2008). Konsentrasi agarosa yang

digunakan sebesesar 1,2 %. Besarnya konsentrasi yang digunakan

tergantung ukuran fragmen DNA yang akan dipisahkan dimana semakin

kecil fragmen yang akan dipisahkan maka konsentrasi agarose yang

digunakan ditingkatkan agar agarosa semakin pekat dan kompak (David G.

Watson, 2007). Sedangkan buffer yang digunakan adalah TAE. TAE

digunakan karena memiliki pH 8,0, pH ini sesuai untuk mengionkan sampel

disamping itu harganya lebih murah dibandingkan TBE (Tris-borate-EDTA)

dan TPE (Tris-phosphate-EDTA) (Kumar and Garg, 2005). Karena larutan

agarosa sudah disiapkan, maka kali ini agarosa hanya perlu di panaskan

didalam oven dengan suhu 100oC sebanyak dua kali. Pemanasan ini

bertujuan untuk melelehkan agarosa yang sudah memadat. Agarosa yang

sudah meleleh diambil dari oven untuk di aduk dengan menggunakan

magnetic stirer. Tujuan pengadukan ini agar komponen yang berada dalam

larutan agarosa dapat bercampur merata. Setelah diaduk kemudian larutan

agarosa dituangkan ke dalam cetakan, setelah dituangkan di dalam cetakan

pada atas cetakan diletakkan comb yang berfungsi untuk membentuk tempat

5

sampel yang akan dielektroforesis atau sering disebut dengan sumur atau

well. Setelah agarosa mengeras maka comb diangkat perlahan dengan

memegang kedua ujungnya sambil sedikit ditekan kedalam. Selanjutnya

tempat cetakan diangkat dari wadah dengan memegang kedua sisinya

dimana bagian bawah cetakan dibersihkan dengan cara digesekkan pada

wadah karena dapat mempengaruhi proses pemisahan. Agarosa yang sudah

bersih dimasukan ke chamber elektroforesis yang berisi buffer TAE. Kutub

yang paling dekat dengan sumur adalah kutub negatif. Sumur didekatkan

dengan kutub negatif karena sampel yang digunakan bermuatan negatif dan

untuk bermigrasi maka sampel perlu dijauhi dari kutub positif (Yuwono,

2008).

Tahap selanjutnya adalah penyiapan sampel, sebelum sampel

disiapkan sumur dicuci terlebih dahulu. Pencucian dilakukan dengan cara

menyedot cairan di atas permukaan sumur dengan perlahan menggunakan

pipet mikro 200 µl. Tujuan pencucian ini untuk membersihkan sumur dari

sisa-sisa agarosa yang masuk ke dalam sumur akibat pengangkatan comb.

Pencucian dilakukan perlahan agar tidak merusak agarosa. Selanjutnya

sampel dimasukkan ke dalam sumur. Sampel yang digunakan sudah

dicampur dengan loading buffer. Loading buffer yang digunakan berfungsi

untuk menambah bobot dari sampel agar sampel tidak hanyut ke larutan

running buffer TAE. kemudian sampel di spin agar sampel dapat terkumpul

di dasar wadah sehingga sampel yang akan diambil memiliki konsentrasi

yang sama. Sampel yang sudah di spin dan DNA-marker kemudian

ditempatkan di dalam sumur. Penempatan sampel harus dilakukan dengan

hati-hati agar dasar sumur tidak lubang. Lubang dari dasar sumur dapat

mengakibatkan hanyutnya sampel kedalam running buffer TAE sehingga

proses elektroforesis tidak dapat dilaksanakan. Sampel 1 ditempatkan di

sumur 1, sampel 2 ditempatkan di sumur 2, DNA Marker ditempatkan di

sumur 3, sampel 3 ditempatkan di sumur 4 dan sampel 4 ditempatkan di

sumur 5. Penempatan diatur seperti ini agar praktikan mudah untuk

menentukan bp dari setiap sampel.

6

Tahap terakhir adalah elektroforesis. Setelah seluruh sampel dan

DNA-marker di masukan kedalam sumur maka elekroforesis dapat

dijalankan dengan mengaliri listrik pada sistem elektroforesis. Pada

praktikum ini digunakan listrik sebesar 100 volt dalam 30 menit. Setelah

dinyalakan maka sampel dan DNA marker akan bergerak dari kutub negatif

ke kutub positif. Arah pergerakan menuju kutub positif karena sampel dan

DNA-marker yang digunakan memiliki muatan negatif. Selama listrik

dijalankan maka sampel dan DNA marker akan terus bergerak dengan jarak

tempuh yang berbeda-beda pada setiap fragmennya. fragmen yang lebih

besar akan bergerak lebih lambat karena terjadi gesekan yang lebih besar

dengan medium penyangga (David G. Watson, 2007). Setelah 30 menit

elektroforesis dihentikan lalu agarosa dikeluarkan dari chamber

elektroforesis. Selanjutnya agarosa diwarnai dengan EtBr (ethidium

bromida) untuk memvisualisasi fragmen DNA yang terbentuk. EtBr dapat

berikatan dengan asam nukleat dengan cara menyelip diantara basa

nukleotida sehingga fragmen dapat berfluoresensi pada sinar UV. EtBr

bersifat karsinogen maka harus diperlakukan dengan hati-hati (Sudjadi,

2008). Untuk mewarnai fragmen DNA dengan EtBr digunakan alat shaker

dengan kecepatan 35 rpm dalam 15 menit. Selanjutnya sampel divisualisasi

dengan UV transluminator.

Hasil pengamatan di UV transluminator ditemukan pita-pita berwarna

merah muda. Pada sumur tempat dimasukannya DNA-marker diperoleh

pita-pita dengan jarak tertentu dimana setiap pita memiliki fragmen dengan

bp antara 100 – 1500, Frgamen dari DNA marker yang paling mendekati

kutub positif memiliki bp 100 dan fragmen dari DNA marker yang paling

mendekati kutub negatif memiliki bp 1500, Fragmen DNA marker akan

bertambah 100 bp mulai dari fragmen yang paling mendekati kutub positif.

sehingga jika membandingkan pita sampel dengan pita DNA-marker maka

dapat ditentukan bp dari setiap sampel.

7

Gambar 1. Hasil Elektroforesis Gel

Gambar 2. Perbesaran pada Hasi Elektroforesis

8

arah elusi

Hasil dari pengamatan

elektroforesis gel yaitu pada sumur 1 tidak ada pita.

Ketidak adaan pita ini disebabkan karena tidak ada sampel yang

bermigrasi. Tidak adanya sampel yang bermigrasi diakibatkan oleh

robeknya dasar sumur pada saat penempatan sampel sehingga sampel

hanyut terbawa running buffer. Pada sumur 2, 3 dan 4 masing-masing

berisi pita. Dapat dilihat di gambar 2, pita yang dihasilkan pada setiap

sumur sampel dapat ditentukan banyak pasang basanya dengan cara

membuat titik tengah pada setiap pita kemudian membandingkannya

dengan DNA-marker. Dengan cara demikian didapat hasil berikut: pada

sumur 2 terdapat 2 pita dimana pita yang terjauh migrasinya memiliki 200

bp sedangkan yang terdekat migrasinya memiliki 800 bp, pada sumur 3

dan 4 terdapat 4 pita dimana 2 pita yang migrasinya terjauh memiliki

kurang dari 100 bp sedangkan pita yang terdekat migrasinya 300 bp dan

yang migrasinya kedua terdekat memiliki 200 bp. Terbukti bahwa salah

satu faktor yang mempengaruhi migrasi sampel adalah ukuran sampel atau

besar kecilnya pasang basa fragmen sampel. Sampel yang memiliki pasang

basa paling rendah selalu bermigrasi lebih jauh dan sebaliknya. Faktor ini

juga yang akan digunakan sebagai bahan untuk mengidentifikasi sampel.

9

VI. KESIMPULAN

1. Elektroforesis adalah metode analisis kimia yang berdasarkan

pergerakan fragmen di dalam medan listrik, dimana protein akan

bergerak didalam medium penyangga dari elektroda negatif menuju

elektroda positif sampai jarak tertentu. Besarnya Jarak tempuh

ditentukan oleh berbagai faktor salah satunya adalah bp setiap fragmen.

Semakin kecil bp maka semakin jauh jarak yang ditempuh oleh protein,

sebaliknya semakin besar bp maka semakin sedikit jarak yang ditempuh

protein.

2. Elektroforesis dikerjakan dengan memasukan sampel pada sumur gel

agarosa yang telah diberi buffer, kemudian diberi arus listrik untuk

memisahkan setiap fragmen. Hasil yang didapat dari elektroforesi gel

adalah Pada sampel 2 berisi protein dengan fragmen 200 bp dan 800 bp.

Pada sampel 3 dan 4 berisi sampel dengan fragmen yang sama dimana

terdapat 4 pita yaitu 2 pita yang migrasinya terjauh memiliki bp kurang

dari 100, sedangkan pita yang migrasinya terdekat memiliki bp 300 dan

yang migrasinya kedua terdekat memiliki bp 200.

10