EKSTRAK BAHAN ALAMI

(Laporan Praktikum Manajemen Kesehatan Ikan)

Oleh

Utami Wijaya

1114111056

JURUSAN BUDIDAYA PERAIRAN

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS LAMPUNG

2013

I. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Kerugian terbesar dalam akuakultur biasanya disebabkan oleh penyakit.

Kemunculan penyakit dalam budidaya disebabkan adanya ketidak seimbangan

antara inang, lingkuangan dan pathogen. Dalam pencegahan maupun pengobatan

biasanya masih mengandalakan penggunaan antibiotik. Sedangkan salah satu

dampak negatif dari penggunaan antibiotik apabila digunakan secara terus

menerus dan dengan dosis yang tidak tepat yaitu dapat menyebabkan bakteri

menjadi resistensi (Rukyati et al., 1992). Selain itu dikhawatirkan adanya dampak

residu setelah mengkonsumsi hasil budidaya.

Hal ini masih dapat ditanggulangi yaitu dengan melakukan pencarian antibiotik

yang berasal dari ekstrak bahan-bahan alami. Penggunaan antibakteri alami

sampai sekarang masih terbatas sehingga perlu diadakannya penelitian tentang

penggunaan bahan-bahan alami yang mengandung antibakteri alami. Indonesia

sebagai negara agraris yang memiliki iklim tropis memiliki banyak jenis tanaman

yang berkhasiat sebagai obat. Kelimpahan tersebut dapat dimanfaatkan untuk

pencarian antibakteri alami sehingga pengguanaan antibiotik kimia dapat

dikurangi.

1.2. Tujuan

Adapun tujuan dari praktikum adalah agar mahasiswa mampu memanfaatkan

bahan-bahan alami sebagai kandidat antibakteri

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Daun Jengkol

Daun jengkol berkasiat sebagai obat eksim, kudis, luka dan bisul, kulit buahnya

digunakan sebagai obat borok. Biji, kortek daun jengkol mengandung saponin,

flavonoid dan tannin (Whitmore, 1978). Senyawa antibakteri dalam daun jengkol

merupakn senyawa yang tergolong dalam golongan senyawa terpenoid. Terpenoid

adalah suatu golongan hidrokarbon yang banyak dihasilkan oleh tumbuhan,

terutama terkandung pada getah dan vakuola selnya. Pada tumbuhan senyawa-

senyawa golongan terpen turunannya merupakan hasil metabolisme sekunder.

Heyhe (1987) menyatakan bahwa terpen atau terpenoid aktif terhadap bakteri,

virus dan protozoa.

2.2. Daun Mangrove

Mangrove mempunyai peranan penting untuk meningkatkan kesuburan perairan

melalui serasah yang dihasilkan. Tumbuhan ini juga dilaporkan banyak

mengandung senyawa metabolit sekunder yang aktif sebagai senyawa

antimikrobial, misalnya pada akar terdapat senyawa Oktasil, Stigmasterol,

Benzoksazolin-2-one, Stigmasteril glukopiranosid, Saponin dan Flopaloid

(Kokpol and Chittawong, 1987 dalam pembususkan organ Nursal, 1998).

Tanin yang terdapat dalam ekstrak Aegiceras corniculatum merupakan senyawa

phenolik komplek yang dapat menghambat aktivitas bakteri sehingga tumbuhan

yang mengandung tanin sering digunakan dalam bidang farmasi karena tanin

mengandung asam tanik yang telah digunakan sebagai antiseptic (Hogarth, 1999).

2.3.Bawang Putih

Bawang putih mempunyai karakteristik utama, yaitu mempunyai metabolit

sekunder yang berupa senyawa organosulfur yang tinggi, diantara genus Allium

yang lain (Wargovich et al., 1996). Senyawa organosulfur mengandung belerang

yang menyebabkan rasa, aroma dan sifaat-sifat farmakologi bawang putih

(Ellmore dan Fekldberg, 1994). Bawang putih dapat digunakan dalam tiga bentuk,

yaitu tepung bawang putih (TBP), minyak bawang putih (MBP) dan ekstrak yang

ada dalam bahan alam tersari sempurna (Wahyuono, 2002).

Kandungan senyawa yang sudah diketemukan pada bawang putih diantaranya

adalah ”allicin” dan ”sulfur amonia acid alliin”. Sulfur amonia acid alliin ini oleh

enzim allicin lyase diubah menjadi piruvic acid, amonia, dan allicin anti mikroba.

Selanjutnya allicin mengalami perubahan menjadi ”diallyl sulphide”. Senyawa

allicin dan diallyl sulphide inilah yang memiliki banyak kegunaan dan berkhasiat

obat (Rukmana R. 1995). Bawang putih mempunyai aktivitas antikarsinogenik

(Le Bon dan Siess, 2000) yaitu melindungi jaringan dari proses karsinogenesis

(Surh et al., 1995). Adanya allicin yang mengandung molekul organosulfur

mampu melewati membran phospholipid dan melindungi membran sel bakteri

(Miron et al. 2000). Bawang putih (EBP) (Millner, 2001).

2.4. Daun Ketapang

Daun ketapang biasanya dikenal berkhasiat untuk menjaga kualitas air pada

kegiatan budidaya perikanan. Kulit kayu, buah, dan daun ketapang sudah

digunakan sebagai obat tradisional untuk mengobati berbagai penyakit, termasuk

penyakit kulit, disentri, sakit kepala dan sakit perut pada anak-anak. Zat kimia

dalam ekstrak daun ketapang yang diduga bersifat antibakteri adalah tannin (Chee

Mun, 2003) dan flavonoid sehingga diharapkan mampu menjadi bahan alami

alternatif dalam pencegahan dan pengobatan penyakit MAS.

2.5. Daun Sambiloto

Dalam Prapanza, E. Dan Marianto, L.M. (2003), sambiloto dapat diklasifikasikan

sebagai berikut:

Divisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledoneae

Subkelas : Gamopetalae

Ordo : Personales

Famili : Acanthaceae

Subfamili : Acanthoidae

Genus : Andrographis

Spesies : Andrographis paniculata Nees

Sambiloto (Andrographis paniculata Nees.) adalah suatu jenis tanaman obat yang

banyak ditemukan di Indonesia dan diketahui dapat menghambat pertumbuhan

Aspergillus flavus pada isolat pakan serta dapat menghambat produksi aflatoksin

secara nyata (Kumar dan Prasad, 1992; Cahyadi, 1996).

Di dalam daun, kadar senyawa andrographolide sebesar 2,5-4,8% dari berat

keringnya (Prapanza, E. Dan Marianto, L.M., 2003). Ada juga yang mengatakan

biasanya sambiloto distandarisasi dengan kandungan andrographolide sebesar 4-

6%. Dalam Siripong et all ( 2003), Senyawa kimia lain yang sudah diisolasi dari

daun yang juga pahit yaitu diterpenoid viz. deoxyandro-grapholide-19β-D-

glucoside, dan neo-andrographolide.

Sultana et al (1995) menyatakan aktivitas hepatoprotektif suatu senyawa obat

seringkali berkaitan dengan sifat senyawa tersebut sebagai agen antioksidan dan

scavenger radikal bebas. Yang et al. (2001) telah melakukan penelitian dan

menyimpulkan bahwa aktivitas antioksidan flavonoid tergantung pada potensial

oksidasi senyawa tersebut dan struktur kimia flavonoid yang berperan dalam

aktivitas antioksidan adalah struktur O-dihidroksi pada cincin B, ikatan rangkap

pada C2 dan C3 yang terkonjugasi dengan gugus okso dan adanya gugus

hidroksil.

2.6. Daun Ketepeng

Tjitrosoepomo (1991) mengkalisifikasikan tumbuhan ketepeng cina sebagai

berikut :

Divisio : Angiospermae

Classis ( Kelas) : Dicotyledoneae

Ordo (Bangsa) : Rosales

Family (Suku) : Fabaceae

Genus (Marga) : Cassia

Spesies (Jenis) : Cassia alata L.

Dari beberapa hasil penelitian terdahulu telah terbukti bahwa ekstrak daun

ketepeng cina berpengaruh terhadap pertumbuhan jamur, juga mempengaruhi

perkembangan cacing perut, dapat mengatasi sembelit dan masih banyak lagi

prospek farmatik lainnya. Hal itu disebabkan oleh adanya kandungan zat

antimicrobial yang bersifat fungistatik di dalamnya, sehingga dapat menghambat

proses pemanjangan hifa (misellium) jamur dan akhirnya perkembangan jamur

pun menjadi terhambat.

2.7. Daun Sirih

Klasifikasi lengkap tanaman sirih menurut Koesmiati (1996) dalam Dwiyanti

(1996) adalah sebagai berikut :

Divisio : Spermatopyta

Subdivisio : Angiospermae

Kelas : Dicotyledonae

Ordo : Piperales

Familia : Piperaceae

Genus : Piper

Species : Piper betle Linn

Daun sirih dapat digunakan sebagai antibakteri karena mengandung 4,2% minyak

atsiri yang sebagian besar terdiri dari betephenol yang merupakan isomer

Euganol allypyrocatechine, Cineol methil euganol, Caryophyllen (siskuiterpen),

kavikol, kavibekol, estragol dan terpinen (Sastroamidjojo, 1997). Sedangkan

menurut Tampubolon (1981) dalam Dwiyanti (1996), daun sirih mengandung

senyawa tanin, gula, vitamin, dan minyak atsiri. Minyak atsiri daun sirih yang

berwarna kuning kecokelatan mempunyai rasa getir, berbau wangi dan larut

dalamm pelarut organik seperti alkohol, eter, dan kloroform, serta tidak larut

dalam air (Soemarno, 1987 dalam Dwiyanti, 1996).

2.8. Buah Kecubung

Klasifikasi tanaman kecubung menurut Sugara (2008) adalah sebagai berikut:

Kingdom : Plantae

Filum : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Ordo : Solanales

Familia : Solanaceae

Genus : Datura

Spesies : Datura metel

Kecubung termasuk tumbuhan jenis perdu yang mempunyai pokok batang kayu

yang tebal. Buahnya hampir bulat yang salah satu ujungnya didukung oleh tangkai

tandan yang pendek dan melekat kuat. Buah kecubung, bagian luarnya dihiasi

duri-duri dan ukurannya bervariasi dan dalamnya berisi biji-biji kecil yang

berwarna kuning kecoklatan (Dalimartha, 2000; Thomas, 2003). Kecubung

mengandung alkaloid, zat lemak, steroid, fenol, saponin, tanin dan tritepen. Biji

dan buahnya mengandung alkaloida, saponin, tanin dan tritepen. Zat aktifnya

dapat menimbulkan halusinasi pada pemakainnya (Dalimartha, 2000).

Alkaloid yang terkandung dalam kecubung diperkirakan dapat merangsang

kelenjar endokrin untuk menghasilkan hormon ekdison; peningkatan hormon

tersebut dapat menyebabkan kegagalan metamorfosis (Aminah dkk, 1995).

Kecubung dimanfaatkan sebagai obat tradisional, diantaranya sebagai obat pada

penderita asma, reumatik, sakit pinggang, pegel linu, bisul, eksim, sakit gigi, sakit

perut bagian atas, bengkak (obat luar), ketombe (obat luar), sulit buang air besar

(obat luar), terkilir (obat luar) (Ipteknet, 2005).

2.9. Bakteri Aeromonas hydrophila

Berikut adalah klasifikasi Aeromonas sp. (Holt et. al. 1994):

Filum : Protophyta

Kelas : Schizomycetes

Ordo : Pseudanonadeles

Family : Vibrionaceae

Genus : Aeromonas

Spesies : Aeromonas hydrophila

Bakteri Aeromonas hydrophila memiliki kemampuan osmoregulasi yang tinggi

dimana mampu bertahan hidup pada perairan tawar, perairan payau dan laut yang

memiliki kadar garam tinggi dengan penyebaran melalui air, kotoran burung,

saluran pencernaan hewan darat dan hewan amfibi serta reptil (Mangunwardoyo

et al., 2010). Bakteri Aeromonas hydrophila, merupakan bakteri negatif, dianggap

sebagai salah satu bakteri patogen yang paling penting pada hewan air di daerah

beriklim sedang, seperti ikan yang sakit, belut, katak, dan kura-kura. Selain itu

bakteri A. hydrophila dilaporkan sebagai salah satu spesies Aeromonas paling

umum yang terkait dengan penyakit usus pada manusia (Esteve et al., 2004). A.

Hydrophila tidak dapat diisolasi pada suhu lebih besar dari 450C, kepadatan

tertinggi terjadi pada 350C, sepanjang gradien termal mulai dari 20

0C sampai

720C. PH air tampaknya tidak memainkan peran penting dalam distribusi A.

hydrophila, karena bakteri dapat diisolasi selama rentang pH seluruh sampel (5,2-

9,8). Bakteri Aeromonas hydrophila tidak mampu tumbuh pada pH lebih rendah

dari 4 atau lebih tinggi dari 10 (Hazen et al., 2011).

2.10. Bakteri Aeromonas salmonicida

Soeripto (2002) menyatakan bahwa vaksin Aeromonas yang digunakan untuk

mencegah penyakit berhasil menurunkan penggunaan antibakteria secara drastis.

Vaksin yang baik adalah vaksin yang stabil dan imunogenisitasnya tidak mudah

berkurang (Radji, 2010). Salah satu cara untuk memperkuat system

imunogenisitas vaksin adalah dengan penambahan adjuvant.

2.11. Bakteri Vibrio Harveyi

Spesies Vibrio harveyi umumnya menyerang larva udang dan penyakitnya disebut

vibriosis (Lavilla-Pitogo et al., 1995). Dalam keadaan normal bakteri Vibrio sp.

berada dilingkungan pemeliharaan dan bersimbiosis dengan ikan air laut. Kondisi

lingkungan memungkinkan, Vibrio sp. tertentu berubah menjadi bersifat

patoghenik (Sunaryanto et al., 1987 dalam Naiborhu, 2002). Serangan ditandai

adanyapendaran cahaya pada tubuh larva udang saat gelap. Tanda-tanda lain yang

diperhatikan akibat serangan penyakit ini yaitu bercak-bercak merah pada tubuh

udang, pergerakan lambat, bentuk tidak normal dan nafsu makan menurun

(Panjaitan, 1991).

2.12. Bakteri Bacillus sp.

Bakteri dari Genus Bacillus memainkan peranan utama dalam perkembangan

industri. Karena mempunyai sifat yang mudah dipelihara dan dikembangbiakkan

juga mempunyai karakter yang beraneka ragam yaitu psikrofilik, mesofilik,

termofilik di samping itu alkalofilik, neutrofilik dan asidofilik. Bacillus

licheniformis menghasilkan beberapa enzim ekstraseluler yaitu (J,- amilase,

amino peptidase, protease metal, ~-laktamase, endo- N-asetilglukoaminidase dan

lipase.

2.13. Uji Zona Hambat

Zona Hambat merupakan tempat dimana bakteri terhamabat pertumbuhannya

akibat antibakteri atau antimikroba. Zona hambat adalah daerah untuk

menghambat pertumbuhan mikroorrganisme pada media agar oleh antibiotik.

Contohnya: tetracycline, erytromycin, dan streptomycin. Tetracycline merupakan

antibiotik yang memiliki spektrum yang luas sehingga dapat menghambat

pertumbuhan bakteri secara luas (Pelczar, 1986).

2.14. Uji Minimum Inhibitory Concentration (MIC)

Uji MIC dilakukan dengan cara mengencerkan secara berseri dari stok ekstrak

bahan alami dengan metode disk diffusion pada agar lapis ganda (double layer

agar) (Horikawa et al., 1999).

2.15. Uji Toksisitas dengan Brine Shrimp Test (BST)

Metode BST merupakan uji yang dilakukan secara in vivo pada larva artemia

salina (Vlientinck and Apers, 2001).

III. METODELOGI

3.1. Waktu dan Tempat

Pada praktikum ekstrak bahan-bahan alami untuk pengobatan ikan dilaksanakan

pada tanggal 20 September sampai 31 Oktober 2013 di Laboratorium Perikanan

Jurusan Budidaya Perairan Fakultas Pertanian Universitas Lampung.

3.2. Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah sebagai berikut bahan

alami (daun ketapang, daun ketepeng, daun sambiloto, daun sirih, daun mangrove,

daun jengkol, bawang putih, buah kecubung), bakteri (Aeromonas hydrophila,

Aeromonas salmonicida, Vibrio harvey, Bacillus sp.), methanol, medium TSB,

pisau dapur, alas pemotong (telenan), mortar dan homogenizer, mikropipet, blue

tp dan yellow tip, tabung reaksi, sentrifuse, botol Falcon, vortex, serta

Spektofotometer.

3.3. Metode Kerja

Adapun metode yang dilakukan pada praktikum yaitu sebagai berikut:

Ekstraksi Kasar Bahan Alami

a. Bahan-bahan alami dicuci dengan air tawar dan dikeringkan.

b. Bahan alami selanjutnya dipotong kecil-kecil dengan pisau.

c. Timbang hingga 50 g.

d. Bahan alami dihomogenizer dengan mortar selama 10 menit dan

diselingi dengan penambahan methanol dengan perbandingan 1: 4

(w/v).

e. Bahan alami dimasukkan kedalam tabung falcon kemudian di

sentrifus dengan kecepatan 4500 rpm selama 20 menit.

f. Supernatant diambil dan dimasukkan kedalam tabung falcon yang

baru.

Uji Zona Hambat

Uji zona hambat dilakukan dengan metode difusi (Diffusion Test)

menggunakan kertas cakram. Sebanyak 20 µl isolate cair Vibrio harvey

masing-masing dengan kepadatan 107 cfu/ml, diteteskan pada media TSA

lalu diratakan dengan spreader. Kertas cakram dengan diameter 6 mm yang

telah direndam di dalam ekstrak bahan aktif pada konsentrasi 10. 20, 30, 40,

50 dan 60 mg/l selama 15 menit. Kemudian diletakkan pada permukaan

media TSA. Kontrol positif dilakukan dengan memberikan kertas cakram

berisi antibiotic oxytetracycline, sedangkan kontrol negative berupa kertas

cakram netral.lalu di inkubasi selama 18-24 jam. Setelah itu, diamati dan di

ukur diameter zona hambat yang terbentuk di sekitar kertas cakram tersebut.

Uji Minimum Inhibitory Concetration (MIC)

Uji MIC dilakukan dengan pengenceran menyiapkan tabung reaksi steril dan

dimasukkan 4,5 ml media TSB ke dalam masing-masing tabung reaksi.

Ekstrak bahan-bahan alami dengan konsentrasi 0%, 2,5%, 5%, 7,5%, 10%

dan kontrol, kontrol positif berupa antibiotic oxytetracycline, sedangkan

kontrol negative hanya diberi bakteri Vibrio harveyi yang dimasukkan pada

masing-masing tabung reaksi sebanyak 0,5 ml. kemudian ditambahkan

suspensi bakteri dengan kepadatan 107cfu/ml sebanyak 0,1 ml dan di vortex

hingga homogeny. Diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Pengamatn uji

MIC dilakukan dengna cara menghitung kepadtan bakteri dengan

menggunakan spektofotometer berdasarkan standar MCFarland.

Uji Toksisitas dengan Brine Shrimp Lethality Test (BST)

Uji toksisitas menggunakan larva artemia sebanyak 10 ekor yang berumur 2

hari, kemudian dimasukkan kedalam botol film yang sudah diisi dengan

sampel konsentrasi masing-masing 0, 1, 2 dan 4 x MIC (tiap perlakuan

dengan 2 ulangan). Larva yang mati diamati dan dihitung dengan bantuan

kaca pemebsar setelah 24 jam.

Mortalitas =

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Pengamatan

Tabel 1. Hasil Uji Zona Hambat

Kelompok Ekstrak Diameter (cm)

1 Daun jengkol 0,5

2 Mangrove 0.6

3 Bawang putih 1,5

4 Ketapang 2.07

5 Sambiloto 1.1

6 Ketepeng 0.6

7 Daun Sirih 2

8 Buah Kecubung 0

Tabel 2. Hasil Uji MIC

Konsentrasi Nilai Absorbansi Kepadatan Bakteri

2,5 % 0,824 A 2,15954 x 109

5 % 0,715 A 1,86851 x 109

7,5 % 0,301 A 0,76313 x 109

10% 0,181 A 0,44273 x 109

Kontrol 0,688 A 1,79642 x 109

Tabel 3. Hasil Uji Toksisitas/Mortalitas Bakteri

Kelompok Konsentrasi Mortalitas

1 0 % 80%

2,5 % 100%

5 % 100%

7,5 % 100%

10 % 100%

2 0 % 70%

2,5 % 100%

5 % 100%

7,5 % 100%

10% 100%

3 0 % 70%

2,5 % 100%

5 % 100%

7,5 % 100%

10% 100%

4 0 % 100%

2,5 % 100%

5 % 90%

7,5 % 80%

10% 100%

5 0 % 78 %

2,5 % 90 %

5 % 100 %

7,5 % 100 %

10% 100 %

6 0 % 80%

2,5 % 90%

5 % 100%

7,5 % 100%

10% 100%

7 0 % 78%

2,5 % 90%

5 % 100%

7,5 % 100%

10% 100%

8 0 % 70 %

2,5 % 100 %

5 % 100 %

7,5 % 100 %

10% 100 %

4.2. Pembahasan

Dari hasil pengamatan diperoleh hasil uji zona hambat dari bakteri Bacillus sp.

yang memiliki diameter terbesar adalah dengan menggunakan ekstrak daun sirih

sedangkan yang tidak memiliki zona hambat adalah ekstrak buah kecubung.

Dimana menurut Sastroamidjojo (1997), daun sirih dapat digunakan sebagai

antibakteri karena mengandung 4,2% minyak atsiri yang sebagian besar terdiri

dari betephenol yang merupakan isomer Euganol allypyrocatechine, Cineol

methil euganol, Caryophyllen (siskuiterpen), kavikol, kavibekol, estragol dan

terpinen. Sedangkan kecubung mengandung alkaloid, zat lemak, steroid, fenol,

saponin, tanin dan tritepen. Biji dan buahnya mengandung alkaloida, saponin,

tanin dan tritepen. Zat aktifnya dapat menimbulkan halusinasi pada pemakainnya

(Dalimartha, 2000). Sehingga ekstrak daun sirih lebih efektivitas dalam

menghambat pertumbuhan bakteri Bacilus sp.

Untuk hasil uji MIC nilai kepadatan bakteri tertinggi adalah pada konsentrasi

2,5% dengan kepadatan 2,15954x109 cfu/ml sedangkan kepadatan bakteri

terendah adalah pada konsentrasi 10% dengan kepadatan 0,44273x109 cfu/ml.

Sedangkan untuk uji toksisitas, Artemia sp. yang tingkat mortalitasnya tinggi pada

konsentrasi 10%. Kemungkinan hal tersebut akibat kadar dosis yang terlalu tinggi

untuk Artemia dapat hidup sehingga ekstrak bersifat toksik bagi Artemia.

V. KESIMPULAN

5.1. Kesimpulan

Dari hasil pembahasan dapat disimpulkan sebagai berikut:

a. Ekstrak yang paling baik dalam zona hambat adalah ekstrak daun sirih

yang merupakan tumbuhan antibakteri.

b. Kepadatan bakteri terendah adalah pada konsentrasi 10% dengan

kepadatan 0,44273x109 cfu/ml.

c. Tingkat mortalitas tertinggi adalah pada konsentrasi 10%.

DAFTAR PUSTAKA

LAMPIRAN

Kelompok Konsentrasi Angka

Hidup

Angka

Mati

Akumulasi

Mati

Akumulasi

Hidup

Akumulasi

Mati/Total

1 0% 2 8 8 2 0,8

2,5% 1 9 17 2 0,1

5% 0 10 27 2 1

7,5% 0 10 37 2 1

10% 0 10 47 2 1

2 0% 3 7 7 3 0,7

2,5% 0 10 17 3 1

5% 0 10 27 3 1

7,5% 0 10 37 3 1

10% 0 10 47 3 1

3 0% 3 7 7 3 0,7

2,5% 0 9 17 3 1

5% 0 10 27 3 1

7,5% 0 10 37 3 1

10% 0 10 47 3 1

4 0% 0 10 10 3 1

2,5% 0 10 20 3 1

5% 1 9 29 3 0,1

7,5% 2 8 37 3 0,2

10% 0 10 47 3 1

5 0 % 3 7 7 4 0,78

2,5 % 1 9 16 4 0,9

5 % 0 10 26 4 1

7,5 % 0 10 36 4 1

10 % 0 10 46 4 1

6 0% 2 8 8 2 0,8

2,5% 1 9 17 2 0,1

5% 0 10 27 2 1

7,5% 0 10 37 2 1

10% 0 10 47 2 1

7 0% 3 7 7 4 0,78

2,5% 1 9 16 4 0,9

5% 0 10 26 4 1

7,5% 0 10 36 4 1

10% 0 10 46 4 1

8 0% 3 7 7 3 0,7

2,5% 0 10 17 3 1

5% 0 10 27 3 1

7,5% 0 10 37 3 1

10% 0 10 47 3 1