PETUNJUK PRAKTIKUM

BIOLOGI MOLEKULER

Oleh

Tim Asisten Praktikum Biologi Molekuler

LABORATORIUM GENETIKA FAKULTAS BIOLOGI

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

PURWOKERTO

2013

KATA PENGANTAR

Diktat petunjuk praktikum ini disusun guna membantu para mahasiswa

Program Studi S1 Biologi Fakultas Biologi Unsoed dalam mempersiapkan,

melaksanakan, dan menulis laporan hasil praktikum Biologi Molekuler. Materi acara

yang diberikan disesuaikan dengan perkembangan fasilitas yang tersedia di Faklutas

Biologi Unsoed.

Segala saran dan kritik akan diterima dengan senang hati demi

penyempurnaan mata acara dan petunjuk praktikum ini di masa mendatang. Semoga

praktikum biologi molekuler yang dilaksanakan dapat memberikan pembekalan

ketrampilan dasar bagi para mahasiswa yang pada suatu ketika akan melakukan

penelitian di bidang biologi molekuler.

Purwokerto, April 2013

Penyusun

DAFTAR ISI

Halaman

I. ISOLASI DNA STRAWBERRY

II. ISOLASI DNA KROMOSOM BAKTERI

III. ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

IV. PENENTUAN KUALITAS DAN KUANTITAS ASAM

NUKLEAT MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETER

V. BIOINFORMATIKA

ACARA I.

ISOLASI DNA STRAWBERRY

LANDASAN TEORI

Isolasi DNA secara garis besar meliputi tahap-tahap perusakan dan

pembuanagn dinding sel, lisis sel, pembuangan remukan sel, serta pemisahan DNA

dari protein dan RNA. Perusakan dinding sel antara lain dapat dilakukan dengan

pemberian lisozim, sedangkan untuk lisis sel biasanya digunakan triton X-100 atau

sodium dodesil sulfat (SDS). Pembuangan remukan sel dilakukan dengan cara

sentrifugasi, sedangkan protein dan RNA masing-masing dihilangkan menggunakan

kloroform dan RNAse.

Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan, misalnya

dengan penambahan amonium asetat dan alkohol. DNA hasil isolasi dikatakan baik

apabila mempunyai tingkat kemurnian yang tinggi dan tidak mengalami fragmentasi.

TUJUAN

mengisolasi DNA kromosom buah

mengetahui prinsip dan proses isolasi DNA kromosom

BAHAN DAN ALAT

1. Buah

2. Deterjen cair

3. NaCl (garam dapur)

4. Etanol

5. Etanol 70%

6. Akuades

7. Tabung falcon

8. Tenderizer

9. Corong plastik/gelas

10. Pipet plastik

11. Sarung tangan

12. Saringan (kain)

13. Kamera Digital

CARA KERJA ISOLASI

1. Masukkan satu buah ke dalam kantung plastik.

2. Tambahkan 50 ml larutan ekstraksi (900 ml akuades, 100 mL deterjen, 2 sendok

teh garam dapur) ke dalam kantung yang berisi buah.

3. Hancurkan buah dalam kantung plastik dengan cara meremas-remas.

4. Kemudian saring, tambahkan tenderizer dan masukan ke dalam tabung falcon.

5. Tambahkan etanol absolut dan amati kabut putih yang terbentuk.

HASIL

Amatilah hasil isolasi DNA kromosom bakteri dengan melihat visualisasi sampel

larutan DNA kromosom yang diperoleh menggunakan elektroforesis gel agarosa

(Acara III.)

ACARA II

ISOLASI DNA KROMOSOM BAKTERI

LANDASAN TEORI

Isolasi DNA kromosom secara garis besar meliputi tahap-tahap perusakan

dan pembuanagn dindind sel, lisis sel, pembuangan remukan sel, serta pemisahan

DNA dari protein dan RNA. Perusakan dinding sel antara lain dapat dilakukan

dengan pemberian lisozim, sedangkan untuk lisis sel biasanya digunakan triton X-

100 atau sodium dodesil sulfat (SDS). Pembuangan remukan sel dilakukan dengan

cara sentrifugasi, sedangkan protein dan RNA masing-masing dihilangkan

menggunakan kloroform dan RNAse.

Molekul DNA yang telah diisolosi tersebut kemudian dimurnikan, misalnya

dengan penambahan amonium asetat dan alkohol. DNA hasil isolasi dikatakan baik

apabila mempunyai tingakt kemurnian yang tinggi dan tidak mengalami fragmentasi.

TUJUAN

mengetahui prinsip dan proses isolasi DNA kromosom

melakukan isolasi DNA kromosom bakteri E. coli

BAHAN DAN ALAT

1. Isolat cair E. coli

2. Mikrosentrifuga

3. Tabung mikrosentrifuga

4. Buffer TE 1x

5. Tenderizer 30%

6. Inkubator

7. Kloroform

8. Isopropanol

9. Alkohol 70%

10. Akuades

11. Sarung tangan

12. Seperangkat mikropipet beserta tipnya

13. Lemari pendingin (freezer)

14. Kertas tisu

15. Kamera Digital

CARA KERJA ISOLASI DNA BAKTERI

1. Sebanyak 1,5 ml kultur hasil inkubasi semalam diambil dan dimasukkan ke

dalam tabung mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan

5000 rpm selama 3 menit.

2. Setelah disentrifugasi, tambahkan 1 ml buffer TE 1x ke dalam tabung tadi lalu

dihomogenkan.

3. Lakukan sentrifugasi kembali dengan kecepatan 5000 rpm selama 3 menit.

4. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan diperoleh pellet sel bakteri, kemudian

pellet diresuspensi dengan 50 µl tenderizer 30% dan diinkubasi pada suhu 37oC

selama 1 jam.

5. Setelah proses inkubasi, tambahkan 10 µl SDS 10% lalu dihomogenkan dan

dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit.

6. Supernatan yang dihasilkan dipindah ke tabung mikrosentrifuga yang baru

kemudian isopropanol dengan volume 1:1 dari volume supernatan kemudian

diendapkan selama 7x24 jam dalam lemari pendingin (freezer).

7. Lakukan sentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit pada suhu

4°C

8. Supernatan dibuang dan pellet diresuspensi dengan 1 ml alkohol 70% kemudian

disentrifugasi lagi dengan kecepatan 10000 selama 10 menit.

9. Supernatan dibuang kembali, tabung dikeringkan, ditambah 50 µl TE 1x dan

diresuspensi dengan cara dibolak-balik. Suspensi yang diperoleh adalah suspensi

DNA kromosom bakteri.

HASIL

Amatilah hasil isolasi DNA kromosom bakteri dengan melihat visualisasi sampel

larutan DNA kromosom yang diperoleh menggunakan elektroforesis gel agarosa

(Acara III.)

ACARA III.

ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

LANDASAN TEORI

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA

berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang

biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk

memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang

basa (bp).

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan

bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran

molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat

diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-

fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya.

Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah

terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara

lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium

bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet.

TUJUAN

Melakukan cara kerja elektroforesis gel agarosa

BAHAN DAN ALAT

1. DNA marker, misalnya DNA λ yang dipotong dengan HindIII

2. Sampel DNA, misalnya :

a. DNA kromosom bakteri,

b. DNA kromosom buah

3. Agarosa

4. Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml

EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml)

5. Akuades

6. Gelas Ukur 1000 ml

7. Labu Erlenmeyer 50 ml

8. Tabung mikrosentrifuga

9. Sarung tangan

10. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)

11. Kertas parafilm

12. seperangkat alat elektroforesis

13. Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe

4000; EDTA 120 mM)

14. larutan Etidium Bromid (EtBr)

15. UV transluminator

16. Kaca mata UV

17. kamera digital

CARA KERJA

1. Buat 500 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 10 ml TAE 50x

ke dalam 490 ml akuades.

2. Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0,6 g untuk dilarutkan ke

dalam bufer TAE 1x hingga volume 60 ml. Larutan agarosa dididihkan hingga

larut sempurna.

3. Siapkan baki gel agarosa, lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (pastikan

bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masing-masing ujung

baki)

4. Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi

hampir menyentuh dasar baki

5. Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan,

jika suhunya sudah turun hingga sekitar 50-600C, tambahkan 1 µl etidium bromid

(PERINGATAN KERAS!!, gunakan sarung tangan karena bersifat

karsinogenik).

6. Larutan agarosa dihomogenkan sebentar, kemudian tuangkan larutan ke dalam

baki gel agarosa, biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat.

7. ambil sisir dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki.

8. masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang

telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam seluruhnya

dalam TAE).

9. siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis.

10. masukkan 10 µl sampel DNA dan 2 µl loading dye 6x ke dalam sumuran gel

agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara

merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet.

11. buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang

dimasukkan.

12. hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel

yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran; jika tidak demikian,

ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya).

13. nyalakan sumber arus, aturlah volatase dan waktu running hingga diperoleh

angka 100 V dan 40 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada

sumber arus.

14. jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada

sumber arus.

15. elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang

ditandai oleh adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari

tangki elektroforesis.

16. keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca

hitam di atas UV transluminator).

17. nyalakan UV transluminator, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi.

HASIL

Dokumentasikan pita-pita DNA hasil elektroforesis dengan nomor sumuran dan jenis

sampelnya. Perkirakan ukuran masing-masing fragmen/pita dengan

membandingkannya dengan posisi migrasi pada DNA marker.

ACARA IV

PENENTUAN KUALITAS DAN KUANTITAS ASAM NUKLEAT

MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETER

LANDASAN TEORI

Molekul hayati dan bahan kimia seperti asam nukleat, protein, fenol, dan

karbohidrat mampu menyerap sinar ultra violet (UV). Namun, zat-zat tersebut

memiliki nilai serapan (absorbansi) cahaya tertinggi pada panjang gelombang yang

berbeda-beda. Asam nukleat, baik DNA maupun RNA, menyerap sinar UV dengan

nilai absorbansi tertinggi pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan protein

memiliki nilai absorbansi tertinggi pada panjang gelombang 280 nm. Kemikalia yang

digunakan dalam isolasi asam nukleat seperti alkohol, kloroform, dan guanidin, atau

pun karbohidrat dan materi organik lain yang umumnya terdapat pada sel tanaman

menyerap sinar UV dengan nilai absorbansi teringgi pada panjang gelombang 230

nm. Sementara itu, panjang gelombang 320 nm sering digunakan untuk mengukur

kekeruhan larutan asam nukleat dan berfungsi sebagai faktor koreksi, khususnya

dalam penentuan kuantitas asam nukleat menggunakan spektrofotometer.

Kuantitas asam nukleat ditentukan berdasarkan atas konsentrasinya, yang

merupakan hasil kali nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dengan faktor

pengenceran dan nilai konsensi. Nilai konsensi untuk DNA untai ganda (dsDNA)

adalah 50 ng/µL (50 µg/mL) untuk tiap unit absorbansi pada 260 nm, sedangkan

nilai konsensi untuk RNA atau DNA untai tunggal (ssDNA) adalah 40 ng/µL (40

µg/mL) untuk tiap unit absorbansi pada 260 nm. Secara umum pengukuran

konsentrasi asam nukleat dirumuskan sebagai berikut.

[DNA]ng/µL = (A260-A320) × 50 ng/µL x F(faktor pengenceran)

[RNA]ng/µL = (A260-A320) × 40 ng/µL x F(faktor pengenceran)

Sementara itu, kualitas asam nukleat ditentukan berdasarkan atas tingkat

kemurniannya. Untuk DNA, kemurnian dikatakan tertinggi apabila nilai

perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm mendekati 1,8. Bila nilai perbandingan

tersebut lebih rendah dari 1,8, dikatakan bahwa DNA terkontaminasi oleh protein.

Sebaliknya, bila nilai perbandingan tersebut lebih tinggi dari 1,8, dikatakan bahwa

DNA terkontaminasi oleh RNA. Kemurnian RNA sendiri dikatakan tertinggi jika

nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm mendekati 2.

Kemurnian asam nukleat dari pengotor karbohidrat atau pun materi organik

lain dan kemikalia ditentukan berdasarkan perbandingan nilai absorbansi pada

panjang gelombang 260 nm terhadap absorbansi pada panjang gelombang 230 nm.

Bila nilai perbandingan absorbansi tersebut berkisar dari 2 hingga 2,2, dikatakan

bahwa sampel asam nukleat yang diukur murni. Namun, bila nilai tersebut lebih

rendah dari 2, dikatakan bahwa asam nukleat terkontaminasi oleh karbohidrat, materi

organik lain atau pun kemikalia yang terbawa saat dilakukan proses isolasi.

Sebaliknya, jika perbandingan nilai absorbansi tersebut lebih tinggi dari 2,2, hal ini

menandakan penggunaan blanko yang tidak sesuai dengan pelarut DNA atau RNA

yang digunakan.

TUJUAN

1. Melakukan pengukuran kualitas dan kuantitas DNA hasil isolasi

2. Mengetahui pengaruh perbedaan perlakuan isolasi DNA terhadap kualitas dan

kuantitas DNA yang diperoleh

ALAT DAN BAHAN

1. Spektrofotometer UV (dalam praktikum ini digunakan UV-VIS

Spectrophotometer Shimadzu model UV Mini 1240)

2. Akuades steril

3. DNA hasil isolasi dari buah dan bakteri

4. Tissue

5. Pipet tetes

CARA KERJA

1. Nyalakan mesin spektrofotometer dan tunggulah 15 menit supaya stabil.

2. Sebanyak 10 μL DNA hasil isolasi dilarutkan dalam 3.000 μL akuades,

kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang

gelombang 230 nm, 260 nm, 280 nm, dan 320 nm.

3. Nilai absorbansi 260 nm yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam rumus

untuk menghitung konsentrasi DNA.

4. Untuk mengetahui kemurnian DNA dari protein, lakukan pembagian nilai

absorbansi 260 nm dengan nilai absorbansi 280 nm.

5. Untuk mengetahui ada tidaknya kontaminasi karbohidrat dan kemikalia, lakukan

pembagian nilai absorbansi 260 nm dengan nilai absorbansi 230 nm.

6. Catatlah semua data dan bandingkan antara DNA hasil isolasi dari tanaman dan

dari bakteri. Apakah terdapat perbedaan nilai, baik tingkat kemurnian maupun

konsentrasi? Jelaskan alasannya.

ACARA V

BIOINFORMATIKA

LANDASAN TEORI

Bioinformatika merupakan pemanfaatan teknologi informasi dalam

menyimpan, mengolah, dan menginterpretasikan data biologi molekuler. Oleh

karenanya, bioinformatika merupakan gabungan antara ilmu biologi, komputer, dan

statistika. Melalui perhitungan secara statistik dan pemodelan yang telah dikaji

secara komprehensif dapat dilakukan penggambaran dan simulasi data tingkat

kemiripan urutan (sekuens) nukleotida, asam amino, sampai dengan pola ikatan dan

reaksi kimia (metabolomik).

Suatu urutan DNA hasil sekuensing dapat diketahui kemiripannya dengan

urutan DNA yang tersimpan dalam pangkalan data melalui teknik bioinformatika.

Bahkan, dari urutan DNA yang ada dapat diketahui petra restriksi sehingga diperoleh

informasi enzim restriksi apa saja yang mampu memotong urutan DNA tersebut

untuk kepentingan diagnosis atau pun rekayasa genetika. Selain itu, dengan

bioinformatika perancangan primer untuk mendeteksi keberadaan suatu gen pada

spesies tertentu juga dapat dilakukan menggunakan berbagai jenis piranti lunak yang

tersedia.

TUJUAN

1. Melakukan penjajaran (alignment) data hasil sekuensing DNA

2. Membuat peta restriksi

3. Melakukan perancangan primer

ALAT DAN BAHAN

1. Urutan-urutan DNA hasil sekuensing

2. Program of line BIOEDIT.

3. Program-progam on line BLAST (www. ncbi.nlm.nih.gov), program PRIMER3

(http://www.idtdna.com/SciTools/), NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter), dan

IDT Oligo Analyzer (http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/Oligo

Analyzer/)

CARA KERJA

A. Penjajaran DNA dengan Data DNA di GenBank (harus terhubung dengan

internet)

1. Kunjungi website GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.

2. Pilih BLASTn.

3. File hasil sekuens dicopy-paste (data berupa satu sekuens DNA disediakan

oleh asisten dan sudah diberi nama sesuai dengan nama praktikan).

4. Klik “run BLAST”.

5. Hasil BLAST akan muncul berupa nama-nama gen berikut kode aksesnya

yang memiliki kemiripan dengan sekuens yang dianalisis.

6. Sekuens dikatakan tepat sama dengan salah satu data di GenBank apabila

nilai Max idintity 100% dan nilai E value adalah 0. Jika nilai Max identity

tertinggi kurang dari 95%, hal ini menandakan bahwa sekuens yang dianalisis

merupakan sekuens baru (bisa didaftarkan di GenBank).

7. Ambillah tiga sekuens yang memiliki nilai Max identity tertinggi dan

simpanlah dalam notepad dengan format fasta (Format fasta dicirikan oleh

adanya tanda > disertai nama sekuens dan urutan basa pada baris berikutnya)

seperti contoh berikut.

B. Mendeteksi Situs-situs Restriksi

1. Kunjungi website NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter).

2. Pindahkan data hasil sekuens di notepad dengan format fasta.

3. Pilih ”Linier” dan pilih juga ”All commercially available specifities”.

4. Klik SUBMIT.

5. Data analisis bisa ditunggu atau bisa dikirim lewat e-mail.

6. Hasilnya akan nampak sebagai mistar yang melambangkan urutan DNA dengan

garis-garis yang memotong mistar dengan kode-kode enzim restriksi.

7. Untuk mengetahui daftar enzim apa saja dan memotong pada urutan berapa, klik

”List 1 cutter ”, dan setelah tampil daftarnya, ubahlah menu ”sort order” ke ”cut

position”.

8. Hasilnya akan tampil sebagai urutan enzim berdasarkan posisi pemotongannya.

Simpanlah data peta restriksi, baik dalam bentuk skema garis maupun tabel

daftar enzim.

C. Merancang Primer (Harus tersambung dengan internet)

1. Bukalah program BIOEDIT.

2. Bukalah data sekuens dalam format fasta pada BIOEDIT.

3. Blok semua data yang tampil di layar BIOEDIT, lalu aktifkan program

penjajaran (alignment) dengan mengeklik CLUSTAL W.

4. Hasil Clustal W dicari urutan basa yang sama dengan bantuan penanda.

5. Daerah yang urutannya sama lalu diblok dan satu sekuens yang mewakili daerah

tersebut dicopy paste di note pad dan disimpan dengan nama yang lain (misal:

”daerah konserv gen X”).

6. Kunjungi website PRIMER3 (http://tools.neb.com/NEBcutter).

7. Masukkan sekuens gen dengan format fasta.

8. Tentukan parameternya berupa

panjang primer 20 basa

panjang fragmen yang teramplifikasi 400-500 basa

kandungan GC 60%

suhu annealing 55°C

9. Kemudian klik SUBMIT.

10. Hasilnya berupa rancangan primer.

11. Primer hasil rancangan diuji kualitasnya dengan mengunjungi IDT Oligo

Analyzer (http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/).

12. Rancangan primer juga diuji spesifitasnya dengan BLASTn.

Catatan:

Rancangan primer yang baik akan menunjukkan spesifitas yang tinggi saat di

BLASTn. Artinya, rancangan primer tersebut memiliki E Value 0 dan Max Identity

100. Rancangan primer yang baik selanjutnya dapat digunakan sebagai dasar untuk

membuat primer dengan cara mengirimkan rancangan tersebut ke perusahaan

pembuatan primer.

Pertanyaan:

1. Setelah Anda melakukan praktikum ini, apakah Anda tahu nama asli sekuens

yang Anda analisis dan apa alasannya?

2. Agar sekuens DNA dapata disisipkan ke vektor tanpa terpotong sedikit pun,

maka enzim komersial apa saja yang tidak boleh Anda pakai?

3. Untuk mendeteksi keberadaan gen tersebut pada suatu organisme dengan metode

PCR, primer apa yang sebaiknya digunakan, dan kondisi PCR seperti apa yang

sebaiknya dipakai, lalu berapa ukuran pita yang dikehendaki? Apa alasannya?