perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id SKRIPSI ANALISIS .../Analisis... · untuk studi struktur...

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

SKRIPSI

ANALISIS BAKTERI RIZOSFER TANPA PENGKULTURAN DENGAN PCR-RISA: HUBUNGANNYA DENGAN KESUPRESIFAN

TANAH TERHADAP BUSUK PANGKAL BAWANG PUTIH

Oleh : Fitha Septi Haryati

H0708101

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA 2012


commit to user

ii

SKRIPSI



Fitha Septi Haryati

H0708101

Pembimbing Utama

Ir. Zainal Djauhari Fatawi, MS NIP 194909061979031001

Pembimbing Pendamping

Prof. Dr. Agr. Sc. Ir. Vita R. C, MP NIP. 196612051990102001

Surakarta, Desember 2012 Universitas Sebelas Maret Surakarta

Fakultas Pertanian Dekan

Prof. Dr. Ir. Bambang Pujiasmanto, MS NIP 195602251986011001


commit to user

iii

SKRIPSI



yang dipersiapkan dan disusun oleh Fitha Septi Haryati

H0708101

telah dipertahankan di depan Tim penguji pada tanggal : ……………………………. dan dinyatakan telah memenuhi syarat

untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian Program Studi Agroteknologi

Susunan Tim Penguji

Ketua

Ir. Zainal D. F, MS. NIP. 194909061979031001

Anggota I

Prof. Dr. Agr. Sc. Ir. Vita R. C, MP NIP. 196612051990102001

Anggota II

Dr. Ir. Hadiwiyono, M.Si NIP. 196201161990021001


commit to user

iv

KATA PENGANTAR

Puji syukur pada Tuhan YME atas limpahan rahmat dan hidayah-Nya

sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Analisis Bakteri

Rizosfer Tanpa Pengkulturan dengan PCR-RISA: Hubungannya dengan

Kesupresifan Tanah terhadap Busuk Pangkal Bawang Putih”. Skripsi ini

disusun untuk memenuhi sebagian persyaratan guna memperoleh derajat Sarjana

Pertanian di Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret.

Penulisan skripsi ini tidak lepas dari bantuan, bimbingan dan dukungan

berbagai pihak, sehingga penulis tak lupa mengucapkan terima kasih kepada :

1. Prof. Dr. Ir. H. Bambang Pujiasmanto, MS selaku Dekan Fakultas Pertanian

Universitas Sebelas Maret Surakarta.

2. Dr. Ir. Hadiwiyono, MSi selaku Ketua Program Studi Agroteknologi Fakultas

Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta, pemberi ide penelitian dan

Dosen Pembahas.

3. Ir. Zainal Djauhari Fatawi, MS selaku Dosen Pembimbing Utama.

4. Prof. Dr. Agr Sc Ir. Vita Ratri C, MP selaku Dosen Pembimbing Pendamping.

5. Ir. HS Gutomo MP, selaku Dosen Pembimbing Akademik.

6. Bapak Ahmad Himawan, Bapak Tony Ruaedi dan Kakak Nina K selaku

Pembimbing Laboratorium.

7. Bapak Bejo Supriyanto dan Bapak Totok selaku Pembimbing Lapangan.

8. Bapak Musawab selaku Laboran Laboratorium Hama dan Penyakit Tanaman

9. Kedua orang tua tercinta yang selalu memberikan dukungan dan doa.

10. Teman-teman Soulmated, Pondok A5, Kakak Zu, dan para sahabat yang telah

memberi semangat dan dukungan.

Penulis sadar bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna, tetapi diharapkan

skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.

Surakarta, Oktober 2012

Penulis


commit to user

v

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR .............................................................................................. iv

DAFTAR ISI.............................................................................................................. v

DAFTAR TABEL ..................................................................................................... vi

DAFTAR GAMBAR ................................................................................................vii

RINGKASAN ......................................................................................................... viii

SUMMARY ............................................................................................................... ix

I. PENDAHULUAN ........................................................................................... 1

A. Latar Belakang ........................................................................................... 1

B. Rumusan Masalah ..................................................................................... 2

C. Tujuan dan Manfaat Penelitian ................................................................. 2

II. TINJAUAN PUSTAKA .................................................................................. 4

A. Bawang Putih ............................................................................................. 4

B. Rizosfer dan Tanah Supresif ..................................................................... 8

C. Penyakit Busuk Pangkal Bawang Putih ................................................... 9

D. Studi Komunitas Bakteri Rizosfer dengan PCR-RISA ...........................12

III. METODE PENELITIAN ................................................................................16

A. Tempat dan Waktu Penelitian...................................................................16

B. Bahan dan Alat Penelitian.........................................................................16

C. Pelaksanaan Penelitian ..............................................................................17

D. Analisis Data ..............................................................................................19

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................................20

A. Pengambilan Sampel dan Ekstraksi DNA Perakaran Bawang Putih .....20

B. Analisis Struktur Komunitas Bakteri Rizosfer dengan PCR-RISA .......24

V. KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................................30

A. Kesimpulan ................................................................................................30

B. Saran ..........................................................................................................30

DAFTAR PUSTAKA................................................................................................31

LAMPIRAN ...............................................................................................................34


commit to user

vi

DAFTAR TABEL

Nomor Judul dalam Teks Halaman 1. Hasil Analisis Kimia Tanah dari Lokasi Pengambilan

Sampel

22

Judul dalam Lampiran 2. Jumlah Pita DNA Hasil Amplifikasi Daerah Intergenic

Spacer 35

3. Kriteria Penilaian Hasil Analisis Tanah 37


commit to user

vii

DAFTAR GAMBAR

Nomor Judul dalam Teks Halaman 1. Sampel Tanaman Sehat Lahan Kondusif (Gondosuli) Umur

100 HST 20

2. Sampel Tanaman Sakit Lahan Kondusif (Gondosuli) Umur 100 HST

20

3. Sampel Tanaman Sakit Lahan Supresif (Pancot) Umur 100 HST

21

4. Sampel tanaman sehat lahan supresif (Pancot) umur 100 HST

21

5. Hasil Ekstraksi DNA Bakteri Rizosfer Tanah Supresif Umur 100 HST

23

6. Hasil Ekstraksi DNA Bakteri Rizosfer Tanah Kondusif Umur 100 HST

23

7. Pola Fragmen DNA Bakteri Rizosfer Tanah Supresif Umur 100 HST

24

8. Pola Fragmen DNA Bakteri Rizosfer Tanah Kondusif Umur 100 HST

25

9. Pola Fragmen DNA Bakteri Rizosfer Umur 100 HST 26 10. Dendrogram-UPGMA berdasarkan pola fragmen DNA

hasil PCR-RISA perakaran bawang putih umur 100 HST tanah kondusif dan Supresif

28

Judul dalam Lampiran 11. Skema pita DNA hasil amplifikasi daerah intergenic

spacer 36


commit to user

viii

RINGKASAN

ANALISIS BAKTERI RIZOSFER TANPA PENGKULTURAN DENGAN PCR-RISA: HUBUNGANNYA DENGAN KESUPRESIFAN TANAH TERHADAP BUSUK PANGKAL BAWANG PUTIH. Skripsi: Fitha Septi Haryati (H0708101). Pembimbing: Zainal D. Fatawi, Vita Ratri Cahyani, Hadiwiyono. Program Studi: Agroteknologi, Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret (UNS) Surakarta.

Bawang putih (Allium sativum L) merupakan salah satu jenis sayuran yang penting dan sebagai salah satu sumber pertumbuhan ekonomi dalam pembangunan pertanian. Tawangmangu merupakan salah satu daerah di Jawa Tengah yang komoditas unggulannya bawang putih. Budidaya bawang putih di Tawangmangu akhir-akhir ini mengalami kendala yaitu serangan patogen penyebab penyakit busuk pangkal bawang putih Fusarium oxysporum f.sp. cepae. Di lapangan, sebagian lahan ada yang memiliki insidens penyakit sangat ringan (lahan supresif) dan adapula yang berat (lahan kondusif). Salah satu mekanisme kesupresifan tanah yaitu keterlibatan agens pengendali hayati. Perlu informasi dasar tentang hubungan struktur komunitas mikrob dengan kesupresifan tanah. Polymerase chain reaction - Ribosomal intergenic spacer analysis (PCR-RISA) merupakan salah satu teknik molekuler tanpa pengkulturan yang dapat diandalkan untuk studi struktur komunitas mikrob pada habitat tertentu. Salah satu aspek penting yang perlu dipelajari adalah bagaimana hubungan struktur komunitas bakteri rizosfer dengan kesupresifan tanah terhadap busuk pangkal bawang putih Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari struktur komunitas bakteri rizosfer bawang putih tanpa pengkulturan dengan PCR-RISA dan hubungan struktur komunitas bakteri rizosfer dengan kesupresifan tanah terhadap busuk pangkal bawang putih.

Penelitian dilaksanakan mulai Oktober 2011 sampai September 2012 di Tawangmangu, Surakarta dan Yogyakarta. Penentuan sampel dengan metode purposive sampling. Sampel yang diambil adalah rizosfer tanaman sehat dan sakit. Sampel yang telah diambil kemudian diekstraksi menggunakan DNAMITE® kit. Hasil ekstraksi dianalisis dengan PCR-RISA kemudian divisualisasi menggunakan agarose gel dan PAGE 12%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ada perbedaan komunitas bakteri rizosfer pada tanah supresif dan kondusif, baik tanaman yang sehat maupun tanaman yang sakit. Berdasarkan analisis UPGMA menunjukkan bahwa nilai koefisien kesamaan genetik dari komunitas bakteri rizosfer tanah supresif dan kondusif adalah 62%. Pada tanah supresif, meskipun keragaman komunitas bakteri rizosfer lebih rendah, tetapi diduga mampu berperan sebagai agens pengendali hayati busuk pangkal bawang putih dibandingkan tanah kondusif.


commit to user

ix

SUMMARY

ANALYSIS OF RHIZOSPHERE BACTERIA THROUGH INDEPENDENT CULTURABLE APPROACH BASED ON PCR-RISA: THE RELATION TO SOIL SUPPRESSIVENESS ON BASAL ROT OF GARLIC. Thesis-S1: Fitha Septi Haryati (H0708101). Advisers: Zainal D. Fatawi, Vita Ratri Cahyani, Hadiwiyono. Study Program: Agrotechnology, Faculty of Agriculture, University of Sebelas Maret (UNS) Surakarta.

Garlic (Allium sativum L) is one of the important vegetables commodity and as a source of economic growth in agricultural development. Tawangmangu is one of the certain area of garlic in Central Java beside of as an important commodity in the area. Cultivation of garlic in the area recently experienced problems caused by Fusarium oxysporum f.sp. cepae causing basal rot disease. In the field, there are some land has mild disease incidence (land suppressive) and those that are heavy (land conducive). One of the mechanisms of soil suppressiveness is the involvement of soil biological control agent. The basic information about the relationship of microbial community structure to soil suppressiveness is needed. Polymerase chain reaction - Ribosomal intergenic spacer analysis (PCR-RISA) is one of the analysis tool through independent culturable approach to study bacterial community structure. The research was purposed to study rhizosphere bacterial community structure of garlic independent culture by PCR-RISA and the relationship of rhizosphere bacterial community structure to soil suppressiveness.

The research was held from October 2011 to September 2012 in Tawangmangu, Surakarta and Yogyakarta. Sampels were determined with purposive sampling. The samples are diseased and healthy plant rhizosphere growing on suppressive and conducive land. Samples have been taken then extracted using DNAMITE® kit. The results of the PCR-RISA were visualized by agarose gel and PAGE 12%. The results showed that there were differences of bacterial community in the garlic rhizosphere on suppressive soil to conducive soil healthy plants to diseased plants. Based on UPGMA analysis there are differences grouping between samples from suppressive to conducive soil. In suppressive soil, despite the diversity of the rhizosphere bacterial community is lower, but is thought to be able to act as a biological control agent basal rot garlic than conducive soil.


commit to user

1

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Bawang putih (Allium sativum L) merupakan salah satu jenis sayuran yang

penting dan sebagai salah satu sumber pertumbuhan ekonomi dalam

pembangunan pertanian. Bawang putih dianggap sebagai komoditas potensial

terutama untuk subsitusi impor dalam hubungannya dengan penghematan devisa.

Tahun 2011, impor bawang putih Indonesia berjumlah 351.890 ton untuk

memenuhi kebutuhan konsumsi dalam negeri (Departemen Pertanian 2012).

Kondisi ekologi yang mendukung sangat diperlukan dalam budidaya bawang

putih. Tidak semua tanaman dapat tumbuh dengan baik di setiap tempat dengan

segala kondisi. Demikian halnya dengan bawang putih, untuk dapat tumbuh baik

dan memberikan hasil yang optimum diperlukan kondisi ekologi tertentu. Iklim,

tanah, dan air merupakan tiga faktor utama yang perlu mendapat perhatian agar

hasil yang memuaskan dapat lebih terjamin. Satu hal lagi yang perlu diperhatikan

dalam budidaya bawang putih, yaitu ketinggian tempat yang berhubungan erat

dengan suhu udara (Wibowo 2003)

Tawangmangu merupakan salah satu daerah dataran tinggi di Jawa Tengah

yang salah satu komoditas unggulannya adalah bawang putih. Budidaya bawang

putih di Tawangmangu akhir-akhir ini mengalami kendala. Salah satu kendala

dalam budidaya bawang putih di Tawangmangu adanya serangan patogen

penyebab penyakit busuk pangkal bawang putih. Busuk pangkal bawang putih

disebabkan oleh Fusarium oxysporum f.sp. cepae yang merupakan penyakit

penting pada bawang putih di Tawangmangu, Karanganyar. Di pertanaman,

insidens penyakit ini dapat mencapai di atas 60% (Fatawi et al. 2003, Fatawi dan

Hadiwiyono 2004). Di lapangan, sebagian lahan ada yang memiliki insidens

penyakit sangat ringan yang disebut sebagai lahan supresif, dan adapula yang

berat, disebut lahan kondusif. Pada lahan supresif terdapat patogen tetapi penyakit

tidak berkembang, sedangkan pada lahan kondusif, terdapat patogen dan


commit to user

2 menyebabkan penyakit yang merugikan sehingga dapat menurunkan produktivitas

tanaman.

Salah satu mekanisme kesupresifan tanah yang penting adalah keterlibatan

agens pengendali hayati. Berbagai upaya dapat dilakukan untuk memanfaatkan

agens pengendali hayati tersebut, oleh karenanya diperlukan informasi dasar

tentang hubungan struktur komunitas mikrob dengan kesupresifan tanah tersebut.

Teknik molekuler tanpa pengkulturan diperlukan untuk studi tersebut, karena 99%

mikrob tidak terkulturkan sehingga metode konvensional yang tergantung kultur

kurang terandalkan. Polymerase chain reaction - Ribosomal intergenic spacer

analysis (PCR-RISA) merupakan salah satu teknik molekuler tanpa pengkulturan

yang dapat diandalkan untuk studi struktur komunitas mikrob pada habitat tertentu

(Borneman dan Triplett 1997).

B. Rumusan Masalah

Busuk pangkal bawang (Fusarium oxysporum f.sp cepae) merupakan salah

satu penyakit penting pada bawang putih terutama di wilayah Tawangmangu,

Karanganyar. Insidens penyakit yang terjadi di lapangan mencapai frekuensi

ringan hingga berat. Berdasarkan hal tersebut perlu dipelajari bagaimana struktur

komunitas bakteri rizosfer bawang putih tanpa pengkulturan melalui pendekatan

PCR-RISA dan hubungannya dengan kesupresifan tanah terhadap busuk pangkal

bawang putih pada lahan supresif dan kondusif?

C. Tujuan dan Manfaat Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari struktur komunitas bakteri

rizosfer bawang putih tanpa pengkulturan melalui pendekatan PCR-RISA dan

hubungannya dengan kesupresifan tanah terhadap busuk pangkal bawang putih

pada lahan supresif dan kondusif.

Adapun manfaat dari penelitian ini adalah untuk menambah informasi bagi

pelaku di bidang pertanian dalam hal eksplorasi agens pengendali hayati spesifik

lokasi yang diharapkan dapat bermanfaat pada pengembangan terhadap


commit to user

3 pengendalian penyakit busuk pangkal bawang putih, terutama di wilayah

Tawangmangu, Karanganyar.


commit to user

4

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Bawang Putih (Allium sativum L.)

1. Arti Ekonomi

Permintaan pasar di dalam negeri terhadap bawang putih tiap tahun

cenderung terus meningkat. Hal ini tidak diimbangi dengan ketersediaan produksi,

sehingga tiap tahun harus mengimpor bawang putih dalam jumlah yang relatif

tinggi. Pada periode tahun 1977-1987 produksi bawang putih di Indonesia

mencapai 352.914 ton atau rata-rata per tahun sebesar 32.083 ton, sedangkan

permintaan bawang putih pada periode tahun yang sama mencapai 593.184 ton

atau rata-rata per tahun 53.925 ton (Rukmana 1995).

Peningkatan produktivitas bawang putih di Indonesia terjadi setelah tahun

1981. Produktivitas yang semula hanya sekitar 3 ton per hektar meningkat tajam

sejak tahun 2000-an menjadi lebih dari 6 ton per hektar. Produksi dalam negeri

tersebut masih jauh dari kebutuhan nasional yang terus meningkat. Tahun 2003,

menurut data Susenas, konsumsi bawang putih penduduk Indonesia mencapai

1,13 kg per kapita. Tahun 2004, konsumsi bawang putih diperkirakan mencapai

273.258 ton yang kemudian meningkat menjadi 304.118 ton tahun 2005 dan tahun

2006 mencapai 315.817 ton atau dengan pertumbuhan rata-rata sekitar 7,5% per

tahun. Pertumbuhan konsumsi ini tidak diimbangi sama sekali oleh produksi

Nasional yang cenderung tidak berubah (Wibowo 2009).

2. Biologi

Bawang putih termasuk salah satu familia Liliaceae yang populer di dunia.

Bawang putih yang nama ilmiahnya Allium sativum L. Ini mempunyai nilai

komersial uang tinggi dan tersebar di seluruh dunia. Tanaman ini merupakan

tanaman terna yang tumbuh tegak dengan tinggi dapat mencapai 30-60cm dan

membentuk rumpun. Sebagaimana warga kelompok Monokotiledon, sistem

perakarannya tidak memiliki akar tunggang dan akarnya serabut yang panjang,


commit to user

5

tidak terlalu dalam berada di dalam tanah. Dengan perakaran yang demikian,

bawang putih tidak tahan terhadap kekeringan. Padahal kebutuhan air untuk

pertumbuhannya cukup banyak. Terutama pada waktu proses pembesaran umbi

(Wibowo 2003).

Klasifikasi bawang putih dalam sistematika tumbuhan (taksonomi) sebagai

berikut:

Kingdom : Plantae

Divisi : Spermatophyta

Sub-divisi : Angiospermae

Kelas : Monocotyledonae

Ordo : Liliales (Liliflorae)

Famili : Liliales

Genus : Allium

Spesies : Allium sativum L.

(Rukmana 1995).

Bawang putih hingga kini belum pernah mampu berbunga di Indonesia,

walaupun muncul tangkai bunga yang kuat. Tangkai bunga ini berubah menjadi

batang sesungguhnya yang beruas. Beberapa ruas batang sering muncul umbi-

umbi kecil yang disebut umbi batang (top garlic) yang dapat ditanam. Aroma

bawang putih khas karena mengandung minyak eteris yang disebut allecin. Daun

bawang putih panjang, kecil, pipih, dan tidak berlubang (Sunarjono 2004).

Pangkal daun bawang putih tidak membentuk bengkakan sebagai cadangan

makanan seperti pada bawang merah. Bagian pangkal daun bawang putih berupa

selaput tipis yang mengering tetapi kuat dan merupakan selaput pembungkus

umbi-umbi kecil. Di dekat pusat tajuk terdapat tunas-tunas. Tunas-tunas ini berada

diantara daun-daun mudanya. Tunas-tunas ini akan terbentuk umbi-umbi kecil

atau siung (Wibowo 2009).


commit to user

6

3. Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Bawang Putih

Rukmana (1995) menyatakan bahwa bawang putih menghendaki kondisi

lingkungan tumbuh di daerah yang suhu udaranya 15-20oC, curah hujan sekitar

100-200 mm/bulan, kelembaban udara 60%-80%, dan cukup mendapat sinar

matahari. Di daerah yang suhu udaranya di atas 25oC, pertumbuhan bawang putih

akan terhambat dan sulit membentuk umbi. Sebaliknya di daerah yang suhu

udaranya kurang dari 15oC, pertumbuhan bawang putih akan merana atau

umbinya kecil-kecil.

Bawang putih di Indonesia banyak ditanam pada ketinggian antara 600-

1200 m dpl, seperti di Sumatera (sekitar danau Toba), Jawa Timur, Jawa Tengah,

Bali, Nusa Tenggara Barat, dan Nusa Tenggara Timur. Bawang putih yang

ditanam di dataran rendah hasilnya tidak sebaik jika ditanam di dataran tinggi.

Jumlah siung tiap umbi juga relatif lebih sedikit. Jenis-jenis yang lain seperti

Lumbu Kuning, Tawangmangu, Cirebon, dan sebagainya mempunyai

kecenderungan yang sama (Wibowo 2009).

Bawang putih cocok ditanam pada tipe tanah andosol, latosol, dan regosol.

Karakteristik tanah andosol adalah memiliki ketebalan solum tanah agak tebal

(100-225 cm), berwarna hitam, kelabu sampai coklat tua, teksturnya debu,

lempung berdebu sampai lempung, dan strukturnya remah, serta reaksi tanahnya

antara asam sampai netral (pH 5-7). Sifat fisik dan kimia tanah andosol cukup

baik, sehingga produktivitasnya cukup baik pula, yaitu antara sedang sampai

tinggi. Tanah latosol memiliki solum tanah tebal (1,3-5,0 m), warna tanah merah,

coklat sampai kekuningan, tekstur tanahnya liat, strukturnya remah, dan derajat

keasaman tanah berkisar antara pH 4,5-6,5. Pada umumnya tanah latosol relatif

memiliki kandungan bahan organik rendah. Tanah regosol memiliki solum tanah

hanya 25 cm, berwarna kelabu sampai coklat atau coklat kekuningan sampai

keputih-putihan, strukturnya lepas (butir tunggal), tekstur pasir sampai lempung

berdebu , dan reaksi tanahnya asam, agak asam sampai netral (Rukmana 1995).

Angin berpengaruh terhadap pertumbuhan bawang putih, menurut Wibowo

(2009) angin yang cukup kencang dan berkelanjutan dapat mempengaruhi kondisi


commit to user

7

tanah. Permukaan tanah cepat mengering dan mengakibatkan mengerasnya

permukaan tanah. Akibatnya secara tidak langsung dapat menghambat

pertumbuhan. Angin yang kencang juga dapat merobohkan tanaman. Bawang

putih dapat ditanam di tanah tegalan, pekarangan, maupun di tanah sawah setelah

panen padi. Tanah ringan atau gembur dapat menghasilkan umbi yang lebih baik

daripada tanah berat. Tanah yang gembur akan mendorong perkembangan umbi

sehingga dapat tumbuh besar. Kondisi tanah yang paling baik adalah tanah

lempung atau tanag lempung liat. Bawang putih juga menyukai tanah yang

banyak mengandung bahan orgnik atau humus, subur, gembur, aerasi baik, dan

tidak becek.

4. Budidaya

Rukmana (1995) menyatakan bahwa perbanyakan bawang putih umumnya

dilakukan dengan cara vegetatif, yaitu berupa umbi bibit. Prasyarat umbi bibit

yang baik sebagai berikut:

a. Berasal dari tanaman yang berumur tua ± 100-120 hari dan termasuk varietas

unggul.

b. Telah mengalami masa simpan selama 7-9 bulan.

c. Penampakan kulit umbi mengkilap dan bebas dari kandungan hama ataupun

penyakit.

d. Ukuran siung berkisar antara 1,1-2,0 gram.

e. Bila ujung siung dipatahkan telah tampak tunas berwarna hijau sepanjang

duapertiga siung.

Jarak tanam bawang putih berpengaruh terhadap hasilnya. Sementara itu,

jarak tanam itu sendiri dipengaruhi oleh ukuran bibit (siung). Jarak tanam juga

berpengaruh terhadap jumlah bibit yang dibutuhkan. Jarak tanam untuk bawang

putih umumnya antara 8-20 cm antar baris dan jarak masing-masing tanaman

dalam baris sekitar 15-20 cm. Siung berukuran besar sebaiknya ditanam dengan

jarak tanam agak renggang, yaitu 15 x 10 cm, sedangkan siung kecil ditanam

dengan jarak tanam 10 x 10 cm (Wibowo 2009).


commit to user

8

Wibowo (2009) menyatakan bahwa bawang putih bersifat musiman,

akibatnya akan terjadi fluktuasi produksi yang dapat menyebabkan fluktuasi harga

di pasaran. Oleh karena itu, perlu diusahakan budidaya bawang putih di luar

musim tanam. Penanaman bawang putih pada musim hujan tidak mudah dan besar

resikonya. Banyaknya air hujan yang turun menyebabkan terbentuknya ekologi

yang kurang menguntungkan bagi penanaman bawang putih dan sering

menyebabkan kegagalan. Penyebab kegagalan tersebut terutama oleh serangan

patogen penyebab penyakit, khususnya cendawan. Umur panen bawang putih

berkisar antara 3,4-4 bulan, tergantung varietas, kesuburan tanah, dan kesuburan

tanamannya. Saat bawang putih berumur 90-100 hari, daun-daunnya mulai

menguning dan mengering. Bila 50-60% dari seluruh tanaman bawang putih

sudah tampak menguning dan mengering, berarti sudah tiba saatnya untuk

dipanen. Tanda-tanda yang lain, batang mengering dan pangkal batangnya

mengeras. Bila daun-daun sudah kering dan batang kelihatan kering atau hijau

kekuningan, bawang putih harus segera dipanen. Terlalu awal atau terlambat

melakukan panen dapat memberikan hasil yang kurang baik.

B. Rizosfer dan Tanah Supresif

Rizosfer adalah daerah sekitar perakaran tanaman yang masih dipengaruhi

aktivitas akar dan kaya akan mikroorganisme. Kajian tentang rizosfer erat

kaitannya dengan anatomi dan struktur akar tanaman, yang banyak berperan

dalam penyediaan eksudat dan deposit akar lainnya. Rizosfer juga merupakan

tempat terjadinya interaksi mikrob tanah. Daerah rizosfer sangat berbeda dengan

daerah di luarnya atau berjarak beberapa milimeter darinya. Mikrob dijumpai

sangat besar di daerah rizosfer, sering secara kualitas berbeda dengan mikrob di

daerah lain. Populasi mikrob yang tinggi disebabkan pada daerah tersebut

merupakan bagian yang sangat kaya nutrisi seperti asam amino dan gula sebagai

sumber nitrogen dan karbon. Adanya nutrisi sangat diperlukan untuk pertumbuhan

dan perbanyakan mikrob tanah, termasuk di antaranya pengkoloni akar tanaman

dan antagonis. Mikrob yang terdapat pada daerah perakaran ini ada pula yang


commit to user

9

bersifat patogen bagi tanaman. Patogen tular tanah (soilborne) ini beradaptasi

tumbuh dan bertahan dalam tanah. (Raaijmakers et al. 2009, Eliza et al. 2007 dan

Soesanto 2008).

Tanah merupakan tempat hidup bagi patogen, melalui pembatasan baik

lamanya bertahan hidup ataupun pertumbuhan patogen. Tanah supresif

merupakan tanah yang mampu menekan perkembangan penyakit, walaupun

patogen ada dalam tanah dan kondisi menguntungkan untuk penyakit, penyakit

tidak muncul atau kecil, tidak membahayakan bagi tanaman. Tanah supresif

sangat ditentukan oleh keragaman mikrob tanah. Keragaman mikrob tanah

dipengaruhi oleh tiga hal utama : (a) tipe tanaman, sebagai penentu utama struktur

komunitas mikrob dalam tanah, seperti tanaman penyedia utama karbon dan

sumber energi, (b) tipe tanah, seperti kombinasi struktur dan tekstur tanah, bahan

organik, stabilitas mikroagregat, pH, dan keberadaan nutrisi seperti N,P, dan Fe,

dan (c) cara mengelola pertanian yaitu rotasi tanaman, pengolahan tanah,

herbisida, aplikasi pemupukan dan irigasi juga menentukan struktur komunitas

mikrob dalam tanah. Beberapa metode untuk menciptakan tanah supresif yakni

(1) rotasi tanaman, dapat memperbaiki struktur tanah, bahan organik, mencegah

patogen tertentu. (2) conservation tillage, sekurang-kurangnya sepertiga dari

permukaan tanah tertutup oleh residu tanaman sebelumnya setelah penanaman dan

(3) pemberian kompos untuk meningkatkan sejumlah besar bahan organik yang

mampu didegradasi oleh mikrob. Peranan tanah supresif sangat signifikan dalam

menekan patogen khususnya yang bersifat tular tanah, seperti Pythium,

Phytophtora, Fusarium, Rhizoctonia, Sclerotium, Armillaria dan Verticillium

(Sudarma dan Jambe 2009, Garbeva et al. 2004).

C. Penyakit Busuk Pangkal Bawang Putih

1. Arti Ekonomi

Wibowo (2003) menyatakan bahwa tidak sedikit jenis penyakit yang dapat

menyebabkan panen bawang gagal, mulai dari cendawan, bakteri sampai virus. Di

antara ketiga kelompok tersebut yang paling sering menyerang tanaman bawang


commit to user

10

adalah bakteri dan cendawan. Fusarium termasuk cendawan dan menyebabkan

daun bawang menjadi layu, yang dimulai dari ujung-ujung daunnya. Ini dapat

terjadi jika cendawan ini menyerang tanaman bawang di lahan.

Busuk pangkal bawang putih merupakan penyakit yang merugikan dan

mengancam pertanaman bawang putih serta menjadi kendala baru sejak musim

tanam 2000 di Tawangmangu Karanganyar jawa Tengah. Busuk pangkal bawang

putih disebabkan oleh Fusarium oxysporum f.sp. cepae. Pada musim tanam 2000

intensitas penyakit baru mencapai 10 persen namun pada musim tanam 2002

intensitas penyakit meningkat mencapai 60 persen. Penyakit ini sangat merugikan

karena umbi tanaman sakit menjadi busuk, sehingga besarnya kerugian sama

dengan intensitas penyakit (Hadiwiyono 2004).

2. Gejala Penyakit

Penyakit layu disebabkan cendawan Fusarium oxysporum dan merupakan

penyakit tular tanah, tetapi dapat juga tersebar lewat air pengairan dari tanah yang

terkontaminasi. F. oxysporum dapat bertahan hidup lama dalam tanah tanpa

tanaman inang, karena dapat membentuk klamidospora yaitu spora aseksual yang

dibentuk dari ujung hifa yang membengkak. Gejala tanaman yang terinfeksi yaitu

daun mati dari ujung dengan cepat dan berwarna kuning, kemudian menjalar ke

bagian bawah, yang berakhir pada kematian tanaman. Pangkal tanaman

memperlihatkan akar-akar yang membusuk dan terdapat jamur berwarna keputih-

putihan pada dasar umbi. Apabila tanaman dicabut akar mudah ditarik karena

pertumbuhan akar tidak sempurna dan membusuk. Jika umbi dipotong membujur

tampak ada pembusukan yang berair, meluas ke atas maupun ke samping dan

pangkal umbi (Korlina 2011, Direktorat Perlindungan Hortikultura 2012).

3. Patogen Penyebab

Menurut Semangun (1996) jamur penyebab layu Fusarium memiliki

klasifikasi sebagai berikut:

Kingdom : Mycetaceae


commit to user

11

Divisi : Eumycota (Eumycetes)

Subdivisi : Deuteromycotina (Deuteromycetes)

Kelas : Hyphomycetes

Ordo : Hyphales (Monoliales)

Famili : Tuberculariaceae

Genus : Fusarium

Spesies : Fusarium oxysporum

Busuk pangkal bawang-bawangan yang disebabkan oleh F. oxysporum f. sp.

cepae (FOCe) telah menjadi penyakit yang merugikan dan mengancam

pertanaman bawang putih di Tawangmangu Karanganyar Jawa Tengah sehingga

menjadi kendala baru sejak musim tanam 2000. Berdasarkan hasil identifikasi

penyakit, busuk pangkal Fusarium di Tawangmangu disebabkan oleh F.

oxysporum Schlecht. f. sp. cepae (Fatawi dan Hadiwiyono 2003).

Fusarium merupakan genus terpenting dari famili Tuberculariaceae karena

merupakan jenis terbesar dan sangat sukar dalam penggolongannya. Adanya

perubahan-perubahan yang terjadi pada genus ini maka para ahli mempunyai

pendapat yang berbeda-beda dalam mengklasifikasikannya. Fusarium mempunyai

makrokonidium dan mikrokonidium, dimana makrokonidium berbentuk

melengkung, panjang dengan ujung yang mengecil dan mempunyai satu atau tiga

buah sekat, sedangkan mikrokonidium mempunyai bentuk tidak bersekat atau

bersekat satu dan dihasilkan oleh sporodokium (ukuran lebih kecil dari

makrokonidium). Klamidospora dan sclerotia juga sering terbentuk dari hasil

miseliumnya. Klamidospora dihasilkan apabila keadaan lingkungan tidak sesuai

bagi patogen dan berfungsi untuk mempertahankan kelangsungan hidup patogen.

Fusarium hidup sebagai parasit dan saprofit pada berbagai tanaman terutama pada

bagian pembuluhnya, sehingga tanaman menjadi mati karena terhambatnya

jaringan oleh suatu toksin. Fusarium mula-mula berwarna putih kemudian kream

atau kuning pucat dan apabila ditumbuhkan dalam medium PDA maka akan

berwarna merah muda atau ungu (Sastrahidayat 1990).


commit to user

12

4. Faktor yang Berpengaruh terhadap Perkembangan Penyakit

Drainase yang buruk dan kelembaban tanah yang tinggi sangat membantu

perkembangan penyakit busuk pangkal bawang putih. Akibat infeksi akhir dari

lapangan, di gudang cendawan Fusarium oxysporum dapat menginfeksi umbi

mulai dari dasar umbi, yang kemudian berkembang masuk ke dalam umbi dan

akan menjadi sumber infeksi pada pertanaman berikutnya (Korlina 2011).

Cendawan Fusarium oxysporum membentuk klamidospora dan dapat

bertahan lama di dalam tanah. Cendawan menginfeksi dengan cara menembus

jaringan pada dasar batang tanpa ada luka sebelumnya. Penetrasi dipermudah bila

terdapat luka. Serangan cendawan pada umbi sangat lambat sehingga tidak

menampakkan gejala, namun setelah disimpan dan bibit ditanam di lapang, maka

gejala akan timbul. Kelembaban yang tinggi di dalam tanah akan memacu

perkembangan penyakit (Direktorat Jenderal Hortikultura 2012)

5. Pengendalian yang Telah Dilakukan

Pengendalian penyakit layu Fusarium menurut Semangun (1996) dengan

penanaman varietas tahan, pemakaian fungisida, mencegah infestasi tanah,

perlakuan tanah dan mengendalikan populasi nematoda. Penggendalian penyakit

busuk pangkal bawang putih juga dapat dilakukan dengan pergiliran tanaman,

menghindari kerusakan mekanis sewaktu pemeliharaan tanaman, menggunakan

bibit yang sehat (bebas patogen), dan menghindari kerusakan umbi pada saat

penanaman (Rukmana 1995)

D. Studi Komunitas Bakteri Rizosfer dengan PCR-RISA

DNA merupakan salah satu makromolekul yang mempunyai peranan sangat

penting pada jasad hidup. DNA adalah polimer nukleotida yang tersusun secara

sistematis dan merupakan pembawa informasi genetik yang diturunkan kepada

jasad keturunannya. Informasi genetik disusun dalam bentuk kodon (codon) yang

berupa tiga pasang basa nukleotida dan menentukan bentuk, struktur maupun

fisiologi suatu jasad (Yuwono 2008).


commit to user

13

Analisis komunitas berdasar pada PCR memiliki sejumlah langkah, diawali

dengan ekstraksi DNA. Sel bakteri memiliki berbagai struktur diantara kelompok

taksonomi, beberapa bakteri lebih mudah rusak dibanding yang lain. Faktor

lingkungan perlu menjadi pertimbangan khusus pada saat pengumpulan sampel

dan ekstraksi DNA. Walaupun melalui beberapa tahap, metode analisis

komunitas dengan PCR umum digunakan karena kemudahannya dalam

menganalisis banyak sampel dan mampu menganalisis organisme khusus yang

diteliti atau taksa yang menarik dengan menggunakan kelompok primer umum

maupun khusus (Kent dan Triplett 2002).

Ekstraksi DNA diawali dengan cara mengisolasi DNA sampel. Proses

pengeluaran DNA dari nukleus, mitokondria maupun organel lain dengan cara

diekstraksi atau dilisiskan, biasanya dilakukan dengan homogenasi melalui

penambahan bufer ekstraksi atau bufer lisis untuk mencegah DNA rusak. Proses

selanjutnya adalah pemisahan DNA dari komponensel yang lain atau

kontaminanyang tidak diinginkan. Pemisahan DNA dari komponen selyang lain,

termasuk debris sel, dilakukan dengan sentrifugasi (Fatchiyah et al 2011)

Polymerase chain reaction - ribosomal intergenic spacer analysis (PCR-

RISA) merupakan suatu metode analisis struktur komunitas yang memberikan

estimasi keanekaragaman dan komposisi mikrob tanpa kesalahan interpretasi.

RISA merupakan metode yang sangat baik untuk mengamati struktur dan

dinamisasi komunitas bakteri yang sangat kompleks melalui perubahan pita-pita

DNA serta untuk mengidentifikasi populasi yang terjadi dalam suatu komunitas.

RISA melibatkan amplifikasi PCR daerah gen operon rRNA antara subunit kecil

(16S) dan subunit besar (23S) yang disebut intergenic spacer region (ISR),

menggunakan primer oliginukleotida dengan target daerah sasaran gen 16S dan

23S. Kemayoran rRNA operon memberikan suatu fungsi struktural, daerah 16S-

23S dapat disandi tRNAs tergantung spesies bakteri. Nilai taksonomi ISR

memberikan heterogenitas yang signifikan, baik panjang maupun urutan

nukleotida. Heterogenitas panjang ISR berkisar 150-1500 bp dengan panjang

mayoritas berkisar antara 150 dan 500 bp. RISA dapat digunakan untuk


commit to user

14

mengamati ekologi bakteri pada lingkungan alamiah sehingga bermanfaat untuk

mempelajari komposisi komunitas mikrob baik untuk identifikasi genus, spesies

atau pengelompokan phylogenetik dan mengamati perubahan lingkungan yang

terjadi. Variasi bagian teramplifikasi dari intergenic spacer (IGS) dapat dengan

langsung dipisahkan atas dasar ukurannya menggunakan gel poliakrilamid.

Variabilitas ukuran yang tinggi menunjukkan adanya variabilitas yang tinggi

dalam struktur genetik komunitas (Christanto et al. 2007, Fisher dan Triplett 1999,

dan Ikeda et al. 2007).

Saito et al. (2007) mengatakan bahwa PCR-RISA akan berguna untuk

analisis peran mikrob tanpa pengkulturan dan memberikan pandangan baru pada

pemahaman terhadap mikrob berguna dan merugikan dalam fitosfer. PCR-RISA

dapat digunakan untuk menghasilkan profil komunitas mikrob yang berasosiasi

dengan tumbuhan dari berbagai produk agronomis tanpa kesalahan berarti oleh

akibat adanya sejumlah DNA tumbuhan. Ranjard et al. (2001) melaporkan bahwa

pendekatan ini telah berhasil untuk mengetahui struktur komunitas bakteri tanah

dan mengevaluasi perubahan perlakuan antibiotik, tekanan merkuri dan

pengurangan lahan hutan.

Penggunaan sekuen 16S rRNA memiliki kelemahan karena kadang-kadang

kurang dapat membedakan dengan jelas suatu spesies dalam level genus.

Beberapa bakteri memiliki sifat fisiologis yang berbeda tetapi memiliki sekuen

16S rRNA yang sama. Berbeda dengan sekuen 16S rRNA, sekuen di antara 16S-

23S rDNA yang dikenal dengan ribosomal intergenic spacer (RIS) memiliki

panjang sekuen yang berbeda untuk masing-masing spesies, sehingga sekuen RIS

dapat digunakan sebagai penanda untuk membedakan spesies dan genus dalam

suatu spesies (Yu dan Mohn 2001).

Perbedaan antara komunitas mikrob yang hidup di tanah hutan dan tanah di

dekat padang rumput diilustrasikan oleh pola pita RISA yang berbeda yang

diperoleh dari masing-masing tempat. Masing-masing jenis tanah menunjukkan

bermacam-macam pita yang tampak unik terhadap lingkungannya. Perbedaan ini

kemungkinan dipengaruhi oleh sifat tanah yang berbeda dari masing-masing


commit to user

15

lokasi pengambilan sampel. Identifikasi filogenetik dari organisme diditunjukkan

dengan pita RISA baik pita eksisi, ekstraksi maupun kloning DNA, kemudian

disekuensi daerah SSU rRNA (kurang lebih 138 basa) dari molekul RISA. Bagian

ini mengandung untai hipervariabel 49, yang berperan dalam identifikasi

filogenetik. Di sisi lain, jumlah yang lebih besar molekul SSU rDNA dapat

diperoleh untuk mendukung lebih banyak informasi filogenetik. Hal ini dapat

dicapai dengan amplifikasi PCR dari DNA tanah menggunakan primer untuk

menghibridisasi sekuensi dari rRNA, dapat menggunakan primer yang khusus

maupun umum (Borneman dan Triplett 1997).


commit to user 16

III. METODE PENELITIAN

A. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Oktober 2011 sampai September

2012. Pengambilan sampel dilakukan di Desa Pancot dengan ketinggian 1.193

mdpl pada posisi 7o39’ LS dan 111o8’ BT dan Desa Gondosuli dengan ketinggian

1.577 mdpl pada posisi 7o40’ LS dan 111o9’ BT Kecamatan Tawangmangu,

Karanganyar. Analisis laboratorium dilakukan di Laboratorium Hama dan

Penyakit Tumbuhan Fakultas Pertanian, Laboratorium Agribiotech Yogyakarta,

dan Laboratorium PAU UGM Yogyakarta.

B. Bahan dan Alat Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu rizosfer bawang putih

yang diperoleh dari tanah supresif dan kondusif lahan pertanaman bawang putih

di Tawangmangu, Karanganyar, Jawa Tengah, DNAMITE® kit, larutan

penyangga Tris base, boric acid EDTA (TBE), gel agarose Vivantis®; campuran

reaksi PCR (DNA cetakan bakteri total; Bovine Serum Albumin (BSA), Mega Mix

Royal (MMR), Primer L189r dan S926f, air destilat ganda); polyacrilamid gel

electrophoresis (PAGE) 12%, yang dibuat dari: 6 ml 30% polyacrilamid, 3 ml

penyangga 5XTBE, 5,85 ml dH2O, 15 ml N, N, N', N'-tetramethylethylenediamine

(temmed), dan 135 ml dari 10% (Amonium persulfat) APS; larutan perak nitrat

1% (0,1% AgNO3 dan 0,56% formaldehid); larutan pewarna (3% NA2CO3,

2mg/ml NA2S2O3 dan 0,56 formaldehid).

Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain sentrifuge, mesin

automatic thermocycler, mesin horizontal electrophoresis, mesin mini vertical

electrophoresis (BioRadTM), kamera digital.


commit to user

17

C. Pelaksanaan Penelitian

Tata laksana penelitian direncanakan sebagai berikut :

1. Survei lokasi dan pengambilan sampel

Pengambilan sampel ditentukan melalui purposive sampling. Kriteria lahan

yang digunakan untuk penelitian adalah pertanaman berumur 100 HST, terserang

F. oxysporum f. sp. cepae penyebab busuk pangkal bawang putih, dengan insidens

penyakit kurang 1% untuk tanah supresif dan sama atau lebih dari 40% untuk

tanah kondusif. Tanaman yang telah ditentukan dari setiap lahan diambil secara

acak kemudian dicabut. Rizosfer dikumpulkan menjadi satu untuk dijadikan

sampel komposit dalam 5 ulangan. Pengambilan sampel dari lahan supresif dan

kondusif penyakit dilakukan pada 2 lahan yang berbeda untuk dilakukan analisis

secara terpisah.

2. Isolasi DNA Bakteri Rizosfer dengan DNAMITE® Kit

Sel bakteri diperoleh melalui suspensi dari rizosfer bawang putih yang telah

direndam selama satu malam. Suspensi dalam tabung reaksi diambil ± 4,5µl untuk

dipindahkan dalam 3 tabung eppendof, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan

1000 rpm 5 menit, bertujuan untuk memisahkan tanah dengan larutan. Supernatan

hasil sentrifugasi dipindahkan dalam eppendof baru untuk disentrifugasi kembali

dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit, bertujuan untuk mengendapkan

kotoran. Supernatan hasil sentrifugasi dipindahkan kembali dalam eppendof yang

baru, lalu disentrifugasi lagi dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit.

Supernatan hasil sentrifugasi dipindahkan dalam eppendof baru, lalu

disentrifugasi kembali 10.000 rpm dalam waktu 10 menit. Pelet hasil dari dua

sentrifugasi terakhir digunakan untuk ekstraksi DNA. Isolasi DNA bakteri

menggunakan DNAMITE® kit. Pelet dari dua sentrifugasi terakhir tadi, ditambah

larutan LA, dijadikan dalam 1 tabung eppendof, hingga ± sebesar 1 ml, lalu

tambahkan larutan PA masing-masing 100 µl, gojok hingga homogen. Kemudian,

menyentrifugasinya dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan

hasil sentrifugasi, ditambah ± 400 µl larutan CA, lalu disentrifugasi lagi dengan

kecepatan 10.000 rpm dalam waktu 10 menit. Hilangkan semua supernatan


commit to user

18 sampai bersih. Kemudian, semua sampel ditambah air destilat ganda 50 µl, lalu

disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. DNA template siap

digunakan atau simpan dalam kulkas -20oC.

3. Elektroforesis DNA pada gel agarosa 1%

Elektroforesis hasil ekstraksi DNA dilakukan menggunakan gel agarosa 1%

yang terdiri atas: 0,4 gram agarose, 40 ml TBE 1x dan 5µl/100ml alternatif

pengganti ethidium bromide (Goodview®). Hasil ekstraksi DNA sebanyak 20 µl

dihomogenkan dengan 2 µl 6x larutan pemberat DNA (Loading Dye) dan

dimasukkan dalam tiap sumuran gel. Elektroforesis dijalankan pada tegangan 100

V selama 10 menit menggunakan larutan penyangga TBE 1x dan hasil

elektroforesis dilihat dibawah UV.

4. Analisis struktur komunitas bakteri rizosfer menggunakan PCR-RISA

Intergenic spacer region (ISR) antara small-subunit (SSU) dan large-subunit

(LSU) rRNA diamplifikasi dalam 25 ml campuran reaksi PCR, yang terdiri dari

3µl DNA cetakan bakteri total, 2,5 ml dari 10mg/ml BSA (Bovine Serum

Allbumin), 12,5 µl MMR, 4 ml air destilat ganda dan 1 ml dari 100 pmol dari

masing-masing primer L189r (5’>TACTGAGATGYTTMARTTC<3’) dan S926f

(5’>CTYAAAKGAATTGACGG<3’) (Yu dan Mohn 2001). Notasi basa pada

primer menunjukkan: Y= C atau T ; M= A atau C ; R= A atau G; dan K= G atau

T. Program PCR dijalankan dengan program denaturasi awal pada 95oC selama 5

menit, 35 siklus terdiri dari denaturasi pada 95oC selama 1 menit, penempelan

50oC selama 1 menit, perpanjangan pada 72oC selama 2 menit dan pemanjangan

akhir 72oC selama 6 menit (Widayati 2007).

5. Elektroforesis dan pewarnaan DNA

Elektroforesis dari DNA teramplifikasi dilakukan dua kali, yaitu dengan gel

agarose 2% dengan marker 1 kb marker ladder (Microzone) selama 20 menit

dijalankan dengan arus 110 V kemudian divisualisasi dengan pewarnaan alternatif

pengganti Ethidium Bromida (Goodview®) dan polyacrilamid gel electrophoresis


commit to user

19 (PAGE) 12% yang dibuat dari: 6 ml 30% polyacrilamid; 3 ml penyangga 5X Tris

base, boric acid EDTA (TBE); 5,85 ml dH2O; 15 ml N, N, N', N'-

tetramethylethylenediamine (temmed); and 135 ml dari 10% Amonium persulfat

(APS). Hasil amplifikasi sebanyak 12,5 µl dihomogenkan dengan 2 µl 6x larutan

pemberat DNA dan dimasukkan dalam tiap sumuran pada gel. Elektroforesis

dijalankan dengan arus 100 V selama 170 menit dalam penyangga 1xTBE

menggunakan mesin mini vertical electrophoresis (BioRadTM) kemudian

dilanjutkan dengan pewarnaan perak nitrat (silver staining).

Pewarnaan perak nitrat dimulai dengan merendam gel hasil elektroforesis

dalam asam asetat glasial 10%. Setelah kurang lebih selama 60 menit digoyang

dalam rendaman asam asetat glasial 10%, larutan dibuang dan gel dibilas dengan

air destilat ganda selama 2 menit (sebanyak 3 kali) sambil terus digoyang. Setelah

air destilat ganda bilasan terakhir dibuang, gel direndam dalam larutan perak nitrat

(0,1% AgNO3 dan 0,56% formaldehid), dan digoyang kembali selama 40 menit.

Selanjutnya gel dibilas dengan air destilat ganda (selama 15 detik) dan direndam

pada larutan pewarna (3% Na2CO3; 2 mg/ml Na2S2O3 dan 0,56% formaldehid).

Proses perendaman dilakukan secara bertahap sampai diperoleh visualisasi yang

diinginkan. Reaksi dihentikan dengan penambahan asam asetat glasial 10%

kemudiankan diamkan 60 menit. Hasil elektroforesis ditutup menggunakan plastik

kaca dan dikeringkan. Hasil visualisasi didokumentasi dengan kamera digital.

D. Analisis Data

Hasil visualisasi PCR-RISA dibuat data pola fragmen DNA masing-masing

isolat menjadi suatu matrik. Kemunculan fragmen DNA pada setiap tanaman

sampel diberi indeks 1, sedangkan yang tidak muncul diberi indeks 0. Matrik data

yang diperoleh dianalisis un-weighted pair-group method arithmetic average

(UPGMA) dengan perangkat lunak numerical taxonomy and multivariate system

(NTSYS) versi 2.1 untuk melihat hubungan kedekatan struktur komunitas bakteri

rizosfer antar tanaman sampel. Kedekatan hubungan dilihat berdasarkan koefisien

kesamaan dan pengelompokan dalam bentuk dendrogram.


commit to user 20

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pengambilan Sampel dan Ekstraksi DNA Rizosfer Bawang Putih

Ekstraksi DNA rizosfer bawang putih menggunakan DNAMITE® kit.

Sampel tanaman diperoleh dari dua lokasi pertanaman bawang putih yaitu desa

Pancot dan desa Gondosuli yang diambil dengan metode purposive sampling.

Jenis tanah pada kedua lokasi pengambilan sampel adalah tanah andosol dengan

struktur yang remah. Tanaman yang digunakan sebagai sampel adalah tanaman

yang sehat dan tanaman yang terserang Fusarium oxysporum f.sp. cepae

disesuaikan dengan kondisi ketika pengambilan sampel.

Gambar 1. Sampel tanaman sehat lahan kondusif (Gondosuli) umur 100 HST

Gambar 2. Sampel tanaman sakit lahan kondusif (Gondosuli) umur 100 HST


commit to user

21

Gambar 3. Sampel tanaman sakit lahan supresif (Pancot) umur 100 HST

Gambar 4. Sampel tanaman sehat lahan supresif (Pancot) umur 100 HST

Tanaman yang sudah ditetapkan sebagai sampel, kemudian diproses untuk

persiapan ekstraksi DNA. Akar tanaman sampel dipotong-potong untuk dijadikan

sampel komposit, dipisahkan antara akar tanaman yang sehat dan akar tanaman

yang sakit. Selanjutnya, sampel komposit dijadikan suspensi, 1 gram akar dalam 5

ml air steril. Masing-masing sampel dibuat dalam lima ulangan kemudian

direndam selama kurang lebih satu malam. Proses selanjutnya, suspensi perakaran

tanaman bawang putih ini diekstraksi menggunakan DNAMITE® kit.


commit to user

22

Kondisi kimia tanah pada lokasi pengambilan sampel sebagai berikut:

Tabel 1. Hasil analisis kimia tanah dari lokasi pengambilan sampel

No Sifat Kimia Tanah Pancot Gondosuli Harkat* (Supresif) (Kondusif) Supresif Kondusif

1. C Organik (%) 0,92 1,42 Sangat rendah Rendah

2. Bahan Organik (%) 1,58 2,46 Sangat rendah Sangat rendah

3. N total (%) 0,42 0,49 Sedang Sedang

4. P tersedia (ppm) 13,35 15,22 Tinggi Tinggi

5. K tersedia (%) 0,34 0,41 Sangat rendah Sangat rendah

6. pH 6,43 6,19 Agak masam Agak masam

*Sumber: Balai Penelitian Tanah 2005

Berdasarkan Tabel 1, dapat diketahui bahwa kondisi kimia tanah

berpengaruh terhadap intensitas penyakit busuk pangkal bawang putih. Pada tanah

kondusif, memiliki kandungan bahan organik yang lebih tinggi dibandingkan

tanah supresif. Menurut Hadiwiyono dan Widono (2008), tingginya bahan organik

ini cenderung meningkatkan intensitas busuk pangkal bawang putih. Kondisi

tersebut diduga menyebabkan tersedianya nutrisi dengan KPK yang tinggi justru

memberikan medium tumbuh yang baik bagi patogen Fusarium oxysporum f.sp.

cepae, sebagai patogen penghuni tanah (soil inhabitant) yang saprotrof (Koike et

al. 2008). Selain bahan organik, kandungan nitrogen total juga berpengaruh

terhadap busuk pangkal bawang putih. Kandungan nitrogen yang terlalu tinggi

dapat menyebabkan tanaman menjadi sukulen, sehingga mudah terserang patogen.


commit to user

23

Hasil ekstraksi DNA perakaran bawang putih sebagai berikut:

Gambar 5. Hasil ekstraksi DNA bakteri rizosfer tanah supresif umur 100 HST :

H1-5 sampel perakaran tanaman sehat dan J1-5 sampel perakaran tanaman sakit.

Gambar 6. Hasil ekstraksi DNA bakteri rizosfer tanah kondusif umur 100 HST :

M1-5 sampel perakaran tanaman sakit dan N1-5 sampel perakaran tanaman sehat.

Berdasarkan hasil ekstraksi DNA (Gambar 5 dan Gambar 6) dapat diketahui

bahwa terdapat bakteri rizosfer pada semua sampel, baik perakaran bawang putih

dari tanah supresif maupun kondusif. Hal yang membedakan terletak pada tebal

tipisnya pita DNA yang tampak. Hasil ekstraksi perakaran bawang putih dari

tanah supresif, menunjukkan pola pita DNA bakteri tanaman yang sehat lebih

tebal dibandingkan tanaman yang sakit. Hasil ekstraksi DNA perakaran bawang

putih dari tanah kondusif juga menunjukkan perbedaan antara tanaman yang sehat

dan tanaman yang sakit dilihat dari tebal tipisnya pita DNA yang tampak. Sama

halnya dengan tanah supresif, pada tanah kondusif, tanaman yang sehat

menunjukkan pita DNA yang lebih jelas dibandingkan tanaman yang sakit. Hal

M H1 H2 H3 H4 H5 J1 J2 J3 J4 J5

M M1 M2 M3 M4 M5 N1 N2 N3 N4 N5

250bp

750bp

250bp


commit to user

24

tersebut dapat terjadi karena kemungkinan pada tanaman sehat di tanah supresif

terdapat bakteri rizosfer yang berperan dalam meningkatkan ketahanan tanaman

terhadap patogen. Sesuai dengan pernyataan Hyakumachi (1994), bahwa banyak

bakteri rizosfer mempunyai kemampuan sebagai pemacu pertumbuhan tanaman

dan menekan patogen terbawa tanah. Kemampuan ini disebabkan bakteri rizosfer

menghasilkan hormon pertumbuhan dan antibiotik atau siderofor.

B. Analisis Struktur Komunitas Bakteri Rizosfer dengan PCR RISA

Hasil PCR divisualisasi menggunakan dua metode, yaitu menggunakan

agarose gel dan pewarnaan perak nitrat. Visualisasi menggunakan agarose gel

dapat menunjukkan ada tidaknya pita DNA pada sampel. Kemudian untuk

memperjelas pita DNA yang terlihat pada visualisasi agarose gel, digunakan

pewarnaan perat nitrat.

Hasil visualisasi pita DNA melalui PCR-RISA menggunakan agarose gel

dapat dilihat pada Gambar 7 dan Gambar 8 :

Gambar 7. Pola fragmen DNA bakteri rizosfer tanah supresif umur 100 HST :

H1-5 sampel perakaran tanaman sehat dan J1-5 sampel perakaran tanaman sakit.

M H1 H2 H3 H4 H5 J1 J2 J3 J4 J5

250bp

500bp

750bp

1000bp 1500bp


commit to user

25

Gambar 8. Pola fragmen DNA bakteri rizosfer tanah kondusif umur 100 HST :

N1-5 sampel perakaran tanaman sehat dan M1-5 sampel perakaran tanaman sakit.

Berdasarkan hasil visualisasi sampel menggunakan agarose gel, dapat

diketahui bahwa seluruh sampel yang divisualisasi menunjukkan adanya

komunitas bakteri rizosfer dalam tanah. Fragmen DNA bakteri rizosfer tanah

supresif dan kondusif yang terlihat memiliki panjang sekitar 1000-1500bp. Pola

pita DNA bakteri rizosfer memiliki perbedaan, baik terkait dengan kondisi

tanaman maupun dari lahan mana tanaman tersebut berasal. Tanaman sehat dari

tanah supresif menunjukkan pita DNA bakteri rizosfer yang lebih tebal dan lebih

banyak dibandingkan tanaman yang sakit. Hal ini dimungkinkan bahwa struktur

komunitas bakteri rizosfer pada tanaman sehat jauh lebih banyak dibandingkan

tanaman yang sakit. Kondisi yang sama juga terlihat pada tanah kondusif.

Tanaman sakit yang berasal dari tanah kondusif, setelah dilakukan analisis PCR-

RISA, ternyata memiliki perbedaan pola pita bakteri rizosfer jika dibandingkan

dengan tanaman yang sehat. Pola pita tanaman yang sehat lebih tebal dibanding

tanaman yang sakit. Benizri et al. (2005) melaporkan bahwa metode PCR-RISA

tanpa pengkulturan digunakan untuk membandingkan struktur komunitas bakteri

tanah yang sehat dan sakit pada pertanaman peach.

250bp

500bp 750bp

1000bp 1500bp

M M1 M2 M3 M4 M5 N1 N2 N3 N4 N5


commit to user

26

Hasil visualisasi secara molekular menunjukkan hanya tampak sedikit

perbedaan pola pita DNA, tetapi kondisi dilapangan menunjukkan bahwa tanah

supresif lebih mampu menekan perkembangan penyakit busuk pangkal bawang

putih. Hal ini dibuktikan bahwa tanaman di tanah supresif mulai mengalami gejala

busuk pangkal bawang putih ketika berumur lebih dari 80 hari setelah tanam,

sedangkan di tanah kondusif, tanaman umur 80 hari setelah tanam sudah mulai

menunjukkan gejala busuk pangkal bawang putih. Gejala busuk pangkal bawang

putih mulai terlihat ketika fase pengisian umbi. Hal ini didukung dengan

pernyataan Sudarma dan Jambe (2009) yang menyatakan bahwa tanah supresif

merupakan tanah yang mampu menekan perkembangan penyakit, walaupun

patogen ada dalam tanah dan kondisi menguntungkan untuk penyakit, penyakit

tidak muncul atau kecil, tidak membahayakan bagi tanaman.

Visualisasi hasil PCR-RISA diperjelas dengan polyacrilamid gel

elektroforesis sebagai berikut:

(A)

(B)

Gambar 9. Pola fragmen DNA bakteri rizosfer umur 100 HST. Tanah supresif (A): H sampel perakaran tanaman sehat dan J sampel perakaran tanaman sakit. Tanah kondusif (B): N sampel perakaran tanaman sehat dan M sampel perakaran tanaman sakit serta L marker ladder 1kb.

L H J M N L

250bp

500bp

750bp

1000bp

1500bp

250bp

500bp

750bp

1000bp

1500bp


commit to user

27

Berdasarkan Gambar 9, dapat diketahui bahwa visualisasi menggunakan

polyacrilamid gel elektroforesis yang dilanjutkan dengan pewarnaan perak nitrat

semakin memperlihatkan perbedaan pola pita bakteri rizosfer dibandingkan

visualisasi dengan agarose gel. Perbedaan terlihat pada tanaman yang berasal dari

tanah supresif dan kondusif baik tanaman sehat maupun sakit (Gambar 9).

Fragmen DNA bakteri rizosfer tanah supresif dan kondusif yang terlihat memiliki

panjang sekitar 500-1500bp. Hal tersebut menunjukkan bahwa terdapat beberapa

spesies bakteri rizosfer pada pertanaman bawang putih.

Berdasarkan perhitungan jumlah pita DNA bakteri rizosfer dapat diketahui

bahwa masing-masing sampel memiliki jumlah pita DNA bakteri rizosfer yang

berbeda-beda. Pada sampel rizosfer sehat yang berasal dari tanah supresif

memiliki sekitar 9-11 pita DNA bakteri rizosfer dan sampel rizosfer sakit dari

tanah supresif memiliki sekitar 13-14 pita DNA bakteri rizosfer. Sampel rizosfer

sehat yang berasal dari tanah kondusif memiliki sekitar 20-22 pita, sedangkan

sampel rizosfer sakit yang berasal dari tanah kondusif memiliki sekitar 20-21 pita

DNA bakteri rizosfer. Berdasarkan jumlah pita DNA ini, dimungkinkan masing-

masing sample memiliki struktur komunitas bakteri rizosfer yang berbeda-beda

pula. Perbedaan struktur komunitas bakteri rizosfer memungkinkan peran yang

berbeda-beda. Ada bakteri rizosfer yang berpotensi sebagai agens pengendali

hayati, tapi ada juga yang berasosiasi dengan tanaman yang dapat menyebabkan

tanaman menjadi lebih rentan terhadap patogen sehingga menyebabkan tanaman

lebih mudah sakit (menurunkan produktivitas tanaman).

Bakteri prokariotik dan jamur eukariotik memiliki berbagai hubungan

saprofitik dan simbiotik, termasuk detrimental (patogenik) dan benefisial

(mutualistik) mikrob. Sebagian besar detrimental mikrob adalah patogen dan

sebagian kecilnya merupakan bakteri dan jamur parasit dan non parasit deleterious

rizosfer. Benefisial saprofit terdiri dari berbagai kelompok mikrob yang mampu

mendukung pertumbuhan dan kesehatan tanaman. Mikrob yang termasuk

benefisial saprofit diantaranya pengurai bahan organik, PGPR, dan bakteri dan

jamur antagonis (Barea et al. 2004, Barea et al. 2004).


commit to user

28

Gambar 10. Dendrogram-UPGMA berdasarkan pola fragmen DNA hasil PCR- RISA perakaran bawang putih umur 100 HST tanah kondusif dan supresif.

Hasil analisis un-weighted pair-group method arithmetic average

(UPGMA) pada Gambar 10, menunjukkan bahwa terdapat pengelompokan yang

berbeda antara sampel yang berasal dari tanah supresif dan kondusif. Nilai

koefisisen kesamaan genetik dari kedua kelompok komunitas bakteri rizosfer

tersebut adalah 62%. Keragaman komunitas bakteri rizosfer cenderung lebih

banyak pada tanah kondusif. Akan tetapi, diduga komunitas bakteri rizosfer di

tanah kondusif ini tidak berperan sebagai agens pengendali hayati busuk pangkal

bawang putih. Berbeda halnya dengan tanah supresif, walaupun keragaman

komunitas bakteri rizosfernya lebih rendah dibanding tanah kondusif, tetapi

mampu menekan perkembangan busuk pangkal bawang putih, karena diduga

komunitas bakteri rizosfer di tanah supresif ini berperan sebagai agens pengendali

hayati. Menurut Agrios (1997), penekanan penyakit pada tanah supresif terjadi

karena adanya satu atau beberapa mikroorganisme antagonis pada tanah tersebut.

Koefisien kesamaan

0.62 0.68 0.74 0.80 0.86

Sup Sehat

Sup Sakit

Kond Sehat

Kond Sakit


commit to user

29

Antagonisme ini bekerja melalui antibiotik yang dihasilkan, melalui kompetisi

terhadap makanan atau parasitisme langsung terhadap patogen, sehingga tidak

memberi peluang bagi patogen untuk mencapai populasi yang dapat menyebabkan

penyakit yang parah. Whipps (1997) melaporkan bahwa kemampuan supresif

tanah biasanya berhubungan dengan dua hal yaitu kompetisi mikroba dalam

menyerap nutrien dan produksi antibiotik oleh mikroba tanah. Keduanya

berpengaruh besar terhadap hubungan antar komunitas bakteri dalam tanah

supresif.


commit to user

30

V. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan analisis struktur komunitas bakteri rizosfer bawang putih

dengan PCR-RISA dapat diketahui bahwa terdapat perbedaan struktur komunitas

bakteri rizosfer bawang putih pada lahan supresif dan kondusif. Tanah kondusif

cenderung memiliki keragaman bakteri rizosfer yang lebih tinggi dibanding tanah

supresif, tetapi kemungkinan komunitas bakteri rizosfer pada tanah supresif lebih

berperan sebagai antagonis patogen dibandingkan komunitas bakteri rizosfer pada

tanah kondusif.

B. Saran

Perlu adanya penelitian lebih lanjut untuk mengetahui spesies bakteri

rizosfer dari pertanaman bawang putih di tanah supresif dan kondusif, sehingga

dapat diketahui spesies bakteri yang dapat berperan sebagai agens pengendali

hayati.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id SKRIPSI ANALISIS .../Analisis... · untuk studi struktur...

Documents

Transcript of perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id SKRIPSI ANALISIS .../Analisis... · untuk studi struktur...