1. PENGANTAR

1.1. Latar Belakang

Kanker merupakan salah satu penyakit tidak menular namun menjadi permasalahan

kesehatan utama di dunia. Menurut Badan Kesehatan Dunia (WHO: World Health

Organization) pada tahun 2005 dilaporkan 7,6 juta orang meninggal karena kanker. Di

Indonesia kanker masih menduduki angka penyebab kematian nomor tiga setelah

penyakit jantung dan stroke (Anonym, 2006). Jumlah penderita penyakit kanker akan

semakin bertambah apabila upaya penanggulangan tidak seoptimal mungkin. Berbagai

metode penyembuhan telah dilakukan seperti pembedaham, penyinaran , khemoterapi,

dan imunoterapi, namun masing masing metode mempunyai kelemahan sehingga

tingkat keberhasilannya masih rendah (Hoffmann,1999). Karena tingkat keberhasilannya

masih rendah dan efek samping yang tinggi, diperlukan usaha untuk menemukan

antikanker yang efektif.

Berbagai senyawa alami hasil sintesis telah banyak dipromosikan salah satu diantaranya

adalah senyawa isoflavon. Isoflavon adalah senyawa metabolit sekunder yang termasuk

dalam kelompok senyawa flavanoid. Senyawa isoflavon merupakan senyawa yang

dapat diisolasi dari tumbuh tumbuhan. Genistein, daidzein, biochanin A dan

farmononetin merupakan beberapa varietas dari isoflavon yang dilaporkan dapat

menghambat perkembangan sel kanker payudara (Heo et al., 2001), kanker rahim (Choi

et al., 2007) dan sel kanker hati (Yeh et al., 2007)

Penyediaan bahan dasar untuk sintesis isoflavon adalah dengan memanfaatkan

tanaman yang banyak tersedia di Indonesia, karena Indonesia memiliki

keanekaragaman hayati yang masih belum banyak dimanfaatkan untuk pengembangan

obat. Eugenol sebagai senyawa yang mempunyai kemampuan bertindak sebagai bahan

baku sintesis isoflavon dapat diperoleh dengan cara diisolasi dari minyak daun cengkeh.

Gugus allil yang ada pada eugenol dapat dikonversi menjadi senyawa senyawa antara

isoflavon. Salah satu hasil sintesis senyawa isoflavon dari minyak daun cengkeh adalah

7-O-karboksimetil-5-hidroksi-3’,4’- dimetoksiisoflavon.

Aktivitas senyawa isoflavon sangat potensial untuk dikembangkan menjadi senyawa

antikanker sehingga anka kematian akibat penyakit kanker akan semakin

berkurang.Untuk mengetahui kemampuan senyawa isoflavon sebagai antikanker maka

perlu dilakukan uji sitotoksik senyawa tersebut secara in vitro pada kultur cell line MCF-

7 dan T47D. Proliferasi sel yang berlebihan dan aspek hambatan kematian sel

(apoptosis), diferensiasi sel merupakan karakteristik dari sel kanker (Contran et al.,

1999). Perubahn genetik mengarah kepada abnormalitas sel dan akhirnya menjadi

malignansi dan kehilangan kemampuan untuk apoptosis.

1.2.Perumusan Masalah

Perumusan masalahnya adalah:

Bagaimana aktivitas sitotoksik senyawa 7-O-karboksimetil-5-hidroksi-3’,4’-dimetoksi-

isoflavon terhadap kultur cell line MCF-7 dan T47D?

1.3.Keaslian Penelitian

Senyawa isoflavon yang telah diisolasi dari kedelai (Glycine max L) dan diuji aktivitas

biologinya adalah 5,7,5’- trihidroksiisoflavon-7-0-monoglukosida (geneistein) 7,4’-

dihidroksiisoflavon-7-0-monoglukosida (daidzein) dan 7,4’-dihidroksi-6-metoksiisoflavon-

7-0-monoglukosida (glisitein) (Ungar et al., 2003). Geneistein sebagai senyawa isoflavon

dilaporkan mampu menginduksi apoptosis sel kanker payudara MDA-MB-231 (Li et al.,

2008) dan 7-hidroksi-3’ ,4’-benzoisoflavon aktif terhadap sel osteocarcinoma (Hoe et al.,

2008). Genestein juga dapat menghambat proliferasi dan menginduksi apoptosis

terhadap adenocarcinoma paru cell line SPS-A1(Li et al., 2008; Guo et al.,2004; Taylor

et al., 2004; Murata et al., 2004; Yeh et al., 2007; Choi and Kim., 2008; Marini et al.,

2007; Zou et al., 2008; Chen et al., 2008; Su et al., 2003; Wang et al., 2002). Sedangkan

7-O-karboksimetil-5-hidroksi-3’4’-dimetoksiisoflavon yang disintesis menggunakan bahan

baku eugenol hasil isolasi dari minyak daun cengkeh belum diuji aktivitas sitotoksiknya.

1.4. Manfaat Penelitian

Penelitian ini dikembangkan untuk mencari senyawa antikanker baru yang lebih sensitif

dan lebih spesifik. Secara teoritis manfaat yang diharapkan adalah mengetahui aktivitas

antikanker senyawa 5,7-dhidroksi-3’,4’-dimetoksiisoflavon dari efek sitotoksik senyawa

tersebut terhadap kultur cell line MCF-7 dan T47D. Secara praktis diharapkan senyawa

7-O-karboksimetil-5-hidroksi-3’,4’–dimetoksiisoflavon dapat dikembangkan sebagai

antikanker yang potensial.

II. TUJUAN PENELITIAN

Mengembangkan senyawa 7-0-karboksimetil-5-hidroksi-3’,4-dimetoksiisoflavon sebagai

antikanker yang potensial.

III. TINJAUAN PUSTAKA

III.1.Epidemologi kanker

Kanker merupakan penyebab kematian utama di dunia. Pada tahun 2000 di laporkan

adanya lebih dari 10 juta kasus kanker baru dan 7 juta kematian akibat kanker. Lebih

dari 60 % kematian dan sekitar 50 % kasus baru akibat kanker terjadi di negara negara

berkembang (Shibuya et al., 2002). Berdasarkan data World Health Organization (WHO)

pada tahun 2004 sebanyak 7,4 juta orang meninggal karena kanker. Jumlah ini akan

semakin meningkat apabila upaya penanggulangan tidak seoptimal mungkin.

III.2.Genetika Molekuler Karsinogenesis

Perubahan mengenai aspek genetika molekuler karsinogenesis pada dekade terakhir

membuktikan bahwa perubahan dalam ekspresi gen merupakan dasar dalam terjadinya

kanker. Paling tidak, 3 kelompok gen telah diketahui berperan dalam terjadinya kanker,

yakni onkogen,gen suppressor tumor dan gen yang berperan dalam proses perbaikan

DNA (Van de velde., 1996; Berterman & Macleod., 2000). Onkogen merupakan sekuen

gen yang bertanggung jawab atas transformasi keganasan. Onkogen juga terlibat pada

regulasi pertumbuhan dan differensiasi sel. Gen seluler normal yang bertalian dengan

onkogen disebut protoonkogen. Perubahan protoonkogen selalu menjadi onkogen dapat

melalui amplikasi gen, yakni terjadi copy yang lebih banyak dalam satu kromosom.

Terjadinya onkogen bias juga dapat melalui mekanisme translokasi kromosom (Cotran

et al., 2005)

III.3.Potensi Senyawa isoflavon

Senyawa isoflavon adalah salah satu jenis senyawa metabolit sekunder yang termasuk

dalam kelompok flavonoid (Harbone et al., 2000). Isoflavon banyak terdapat pada

daun,akar, batang, kulit, bunga, buah dan biji. Dilaporkan bahwa senyawa isoflavon

mampu berperan sebagai antioksidan, antifungal, antibakterial, antiinflamasi, aktivitas

estrogenik dan antikanker. Keragaman struktur dan aktivitas biologi dari senyawa

isoflavon dan beberapa yang telah berhasil disintesis perlu dilakukan uji sitotoksiknya

baik secara in vitro maupun in vivo untuk penentuan sebagai senyawa

antikanker.Beberapa senyawa isoflavon antikanker yang telah diisolasi adalah genistein,

daidzein, biochanin A. forfonometin, natrium 4’,7-bis(karboksimetoksi)isoflavon-3’-

sulfonat dan natrium 4’-hidroksi-7-karboksimetoksisoflavone-3’-sulfonat (Perruchon.,

2004; Yan et al., 2007). Aktivitas antikanker senyawa isoflavon yang diisolasi dari

kacang kedelai memiliki urutan sebagai berikut yaitu dimulai dari genestein, daidzein,

genistein, biochanin A, daidzin, formononetin dan kemudian yang paling rendah adalah

ononin (Liu et al.,2005). Senyawa isoflavon yang telah dikembangkan sebagai obat

sintetik untuk osteoporosis adalah isoflavon oksipropilamin (Wu et al., 1992) karboksialkil

isoflavon (Kohen et al.,2007), ipriflavon (7-isopropoksiy-3-fenil-4H-1-benzopiran-4on) .

IV.LANDASAN TEORI

Berdasarkan penelitian sebelumnya, telah dibuktikan bahwa:

1. Senyawa isoflavon merupakan salah satu jenis senyawa metabolit sekunder yang

mempunyai aktivitas antikanker pada berbagai jenis kanker.

2. Senyawa 7-O-karboksimetil-5-hidroksi-3’4’-dimetoksiisoflavon merupakan senyawa

turunan isoflavon hasil sintesis kemungkinan memiliki aktivitas antikanker dengan

senyawa isoflavon hasil isolasi.

V. HIPOTESIS

Senyawa 7-O-karboksimetil-5-hidroksi-3’4’-dimetoksiisoflavon mempunyai aktivitas

sitotoksik tinggi terhadap sel MCF-7 dan T47D yang ditunjukkan dengan nilai IC50 yang

rendah.

VI. METODOLOGI PENELITIAN

Penelitian ini merupakan penelitian eksploratif dengan metode penelitian

eksperimental murni dan rancangan penelitian adalah randomized post test control

group design. Sebagai kontrol positif digunakan antikanker doksorubisin dan kontrol

negatif adalah media kultur sel.

Uji sitotoksik dilakukan dengan memasukkan suspensi sel MCF-7 atau T47D

dalam media kultur yang mengandung 1,5 x 104 sel/100μL suspensi ke dalam masing

masing sumuran (microwell plate) 96 dan diinkubasikan pada inkubator suhu 37 0 C 5 %

CO2 selama 24 jam. Selanjutnya dibuat larutan stok senyawa uji (7-O-karboksimeti-5-

hidroksil-3’,4’-dimetoksiisoflavon) dan kontrol positif (doksorubisin) dengan melarutkan

10 mg setiap senyawa turunan isoflavon dalam 1 mL media kultur RPMI. Larutan

senyawa uji selalu dibuat baru sebelum uji aktivitas dilakukan. Dari larutan stok senyawa

uji dan doksorubisin selanjutnya dibuat berbagai konsentrasi larutan uji mulai dari kadar

0,5; 1; 5; 10; 25; 50 dan 100 μg/mL. Sebanyak 100 μL larutan senyawa uji atau

doksorubisin dari masing-masing konsentrasi dimasukkan ke dalam suspensi sel dalam

sumuran 96 yang telah diinkubasikan sebelumnya. Sebagai kontrol negatif ditambahkan

media kultur sebanyak 100 μL ke dalam sumuran. Uji dilakukan secara triplikat untuk

tiap perlakuan dan diulangi 3 kali. Kultur yang telah diberi bahan uji diinkubasikan

selama 24 jam pada suhu 37 0C dalam inkubator 5 % CO2. Selesai inkubasi media

kultur dibuang dan dicuci dengan PBS dan ditambahkan 100 μL larutan MTT (1 mL

MTT dalam 10 mL media kultur) ke dalam setiap sumuran dan kemudian diinkubasikan

lagi pada suhu 37 0C 5% CO2 selama 4 jam. Setelah 4 jam ditambahkan 100 μL stopper

SDS 10 % dalam HCL 0,1 N ke dalam setiap sumuran (untuk melarutkan purple

formazan). Kemudian dizeker selama 5 menit dan dibungkus rapat. Setelah dibiarkan

dalam suhu kamar semalam dilakukan pembacaan absorpsi dengan microplate

ELISA reader pada panjang λ 595 nm. Dari hasil absorbansi dapat dihitung viabilitas sel

dengan rumus :

% hidup (viabilitas) = (c-b) (a-b) x 100

Keterangan : a adalah absorbansi kontrol sel; b adalah absorbansi kontrol media dan

c adalah absorbansi sampel.

Aktivitas sitotoksik setiap senyawa uji dan doksorubisin dinyatakan dengan nilai

IC50 yakni kadar yang mampu menghambat pertumbuhan sel hingga 50% yang dihitung

dengan analisis probit berdasarkan hubungan antara kadar dengan penghambatan

pertumbuhan sel.

I. DAFTAR PUSTAKA

Anonymous, 2006. Cell cyle . Avaiable from : http: //images, goole, co, id/(diakses 2 April 2008).

Chen, I.L., Chen, J.Y., Shieh, P.C., Chen, J.L., Lee, C.H., Juang , S.H. and Wang, T.C., 2008, Synthesis and antiproliferative evaluation of amide-containing flavone and isoflavone derivatives, Bioorg Med Chem, 16:7639–7645.

Choi, E.J., Kim, T., and Myeong-Sok, 2007, Pro-apoptotic effect and cytotoxicity of genistein and genistin in human ovarian cancer SK-OV-3 cells, Life Sci, 80: 1403–1408.

Choi, E.J and Gun-Hee Kim, 2008, Daidzein causes cell cycle arrest at the G1 and G2/M phases in human breast cancer MCF-7 and MDA-MB-453 cells, Phytomed, 15: 683–690.

Cotran, R.S., Kumar,V., Abbas, A.K., Fausto, N., Robbins, S.L,2005. Robbin and Cotran Pathologic Basis of Disease. 7 th ed. Elsevier Saunders, Philadephia.

Guo, J.M., Kang, G.Z., Xiao, B.X., Liu, D.H., Zhang, S., 2004, Effect of daidzein on cell growth, cell cycle, and telomerase activity of human cervical cancer in vitro, Int J Gynecol Cancer, 14: 882–888.

Harbone, JB, Williams, CA, 2000. Advances in flavanoid research since 1992.Phytochem, 55, 481-504.

Heo MY, Sohn SJ and Au WW, 2001, Anti-genotoxicity of galangin as a cancer chemopreventive agent candidate, Mutat Res, 488: 135-150.

Hoffman, E. J. 1999. Cancer and the Searh for Selective Biochemical Inhibitor,CRCPress, Boca Raton, London.

Hou, C.H., Fong, Y.C., Chen, J.T, Liu, J.F., Lin, M.S., Chang, C.S., and Tang, H.T., 2008, The novel isoflavone 7-hydroxy-30,40-benzoisoflavone induces cell apoptosis in human osteosarcoma cells, Cancer Lett, 271: 117–128.

Kohen ,F., Gayer.B., Kulik. T., Fryman.V., Nevo, N., Katzburg, S., Limor. R., Sharon.O., Stern, N and Somjen,D.2007. Synthesis and evaluation of the antiproliferative Activities of Derivatives of Carboxyalkyl Isoflavones linked to N-t-Boc-hexylenediamine. J Med Chem, 50, 6405-6410.

Li, Z., Li, J., Mo, B., Hu, C., Liu, H., Qi, H., Wang, Z., and Xu, J.,2008, Genistein induces cell apoptosis in MDA-MB-231 breast cancer cells via the mitogen-activated protein kinase pathway, Toxicol In Vitro, 22:1749–1753.

Marini, H., Minutoli, L., Polito, F., Bitto, A., Altavilla, D., and Atteritano, 2007, Effects of the phytoestrogen genistein on bone metabolism in osteopenic postmenopausal women: a randomized trial, Ann Intern Med, 146: 839–847.

Murata, M., Midorikawa, K., Koh, M., Umezawa, K., Kawanishi, S., 2004, Genistein and daidzein induce cell proliferation and their metabolites cause oxidative DNA damage in relation to isoflavone-induced cancer of estrogen-sensitive organs, Biochem, 43: 2569–2577.

Su, S.J., Chow, N.H., Kung, M.L., Hung, T.C., Chang, K.L., 2003, Effects of soy isoflavones on apoptosis induction and G2-M arrest in human hepatoma cells involvement of caspase-9 activation, Bcl-2 and Bcl-XL downregulation,and Cdc2 kinase activity, Nutr Cancer, 45: 113–123.

Taylor, G.C., Feitelson, A.K., Taylor, D.D., 2004, Inhibitory effect of genistein and daidzein on ovarian cancer cell growth, Anticancer Res 24: 795–800.

Wang, H.Z., Zhang, Y., Xie, L.P., Yu, X.Y., Zhang, R.Q., 2002, Effects of genistein and daidzein on the cell growth, cell cycle, and differentiation of human and murine melanoma cells, J Nutr Biochem, 7: 421–426.

Wei H, Bowen R, Cai Q, Barnes S and Wang Y, 1995, Antioxidant and antipromotional effects of the soybean isoflavone genistein, Proc Soc Exp Biol Med, 208: 124-230.

Wei H, Zhang, X, Wang Y and Lebwohl M, 2002, Inhibition of ultraviolet light-induced oxidative events in the skin and internal organs of hairless mice by isoflavone genistein, Cancer Lett, 185: 21-29.

Yeh, T.C., Chiang, P.C., Li, T.K., Hsu, J.L., Lin, C.J., Wang, S.W., Peng, C.Y., and Jih-Hwa, 2007, Genistein induces apoptosis in human hepatocellular carcinomas via interaction of endoplasmic reticulum stress and mitochondrial insult, Biochem Pharmacol, 73: 782 – 792.

Zou, H., Zhan, S., and Cao, K., 2008, Apoptotic activity of genistein on human lung adenocarcinoma SPC-A-1 cells and preliminary exploration of its mechanisms using microarray, Biomed Pharmacother, 62: 583-589.

USULAN PENELITIAN DANA MASYARAKATTAHUN ANGGARAN 2010

Judul Penelitian

UJI SITOTOKSIK SENYAWA 7-O-KARBOKSIMETIL-5-HIDROKSI-3’,4’-DIMETOKSIISOFLAVON HASIL SINTESIS PADA KULTUR

SEL KANKER PAYUDARA MCF-7 DAN T47D

Nama Mahasiswa :

Rizky Estu Aditya (08/KU/264832/12611)

BAGIAN HISTOLOGI DAN BIOLOGI SELFAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS GADJAH MADA

YOGYAKARTA 2010