1

MINI BOOKBIOTEKNOLOGI TANAMAN LANJUTAN

Dosen Pengasuh : Dr. Noer Rahmi Ardiarini, SP.,MP.Mahasiswa : Ika Dyah Saraswati

PRODI PEMULIAAN DAN BIOTEKNOLOGI TANAMANPROGRAM PASCASARJANAUNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG 2014

BAB I BIOTEKNOLOGI UNTUK KACANG BOGOR

A. Asal Kacang bambara

Kacang Bambara mulanya berasal dari daerah Bambara, Niger Afrika dan

dikenal sebagai kacang tanah dengan bentuk polong yang bulat. Menurut

Rukmana dan Oesman (2000), nama yang diberikan oleh para ahli botani

bermacam macam, misalkan Linnaeus di tahun 1763 memberikan nama Glycine

subterra selanjutnya Du Patit Thouars tahun 1806 memberikan nama Voandzria

subterranea dan saat ini berkembang dengan nama ilmiah Vigna subterranea atas

peran (Verdcourd, 1970) yang menyatakan bahwa kacang bogor atau kacang

Bambara ini lebih cenderung memiliki kemiripan dengan genus Vigna. Meskipun

secara hasil kacang ini berpotensi panen lebih rendah dari genus Vigna yang lain,

menurut Rungnoi et al., (2012) hal ini dimungkinkan karena kacang bogor

termasuk dalam kacang-kacangan yang sering ditanam di lahan marginal atau

sering disebut sebagai landrace crop. Mukakalisa (2010) juga menambahkan

bahwa bambara yang ditanam di daerah semi-arid Afrika berdaya hasil rendah

dengan rata-rata hasil hanya 300-800 kg/ha, hal ini berhubungan dengan distribusi

hujan, temperatur udara yang ekstrim, tanah yang miskin hara, serangan hama

penyakit, dan teknik budidaya yang buruk.

Tanaman asli Nigeria ini selanjutnya tersebar di berbagai negara misalkan

Srilanka, Brasil, India, Malaysia, Indonesia, dan Australia. Di Indonesia, kacang

Bambara untuk pertamakali dapat beradaptasi dengan baik di Bogor sehingga saat

ini disebut sebagai kacang Bogor. Perkembangan kacang Bogor di Indonesia tidak

terbatas di Bogor saja tetapi juga berkembang di daerah lain seperti Sukabumi dan

Bandung sehingga terkadang juga disebut sebagai kacang Bandung, Liu (2010)

menambahkan terkadang kacang Bogor juga dikenal dengan nama kacang manila,

kacang gengge, kacang baleud, dan kacang banten. Menurut Rukmana dan

Oesman (2000), kacang Bogor juga berkembang di daerah Pati, Kudus, Lampung,

NTB dan NTT. Menurut Chomchalow (1993), kacang bogor termasuk dalam jenis

kacang-kacangan yang toleran terhadap keadaan tanah yang kurang subur

sehingga banyak ditanam di daerah dengan kesuburan rendah dan kering.

2

B. Anatomi dan Morfologi Kacang Bambara

Kacang bambara atau bogor membutuhkan waktu paling tidak 7-15 hari

untuk berkecambah. Benih yang disimpan paling lama adalah 12 bulan saja,

selebihnya benih dapat kehilangan viabilitasnya. Setelah tanaman melewati masa

vegetatif selanjutnya masa pembungaan terjadi antara 30-35 hst dan termasuk

dalam tanaman berhari pendek. Polong dan biji terbentuk sekitar 30-40 hari

setelah terjadinya fertilisasi. Polong terbentuk di atas permukaan tanah, sekitar 30

hari setelah fertilisasi lalu 10 hari berikutnya biji mulai terbentuk. Biji masak saat

jaringan parenkim yang menutupi embrio hilang dan polong berubah warna

menjadi coklat cerah. Sementara Nishitani et al., 1981 dalam Ratih (1991) dalam

Hamid (2009) menambahkan bahwa pembungaan pada kacang bogor terjadi pada

55 hst pada musim hujan dan 45 hst pada musim kemarau. Pemanenan biasanya

dapat dilakukan saat 80% dari polong masak dan siap dipanen (Swanevelder,

1998). Berchie et al., (2010) menambahkan bahwa siklus hidup secara lengkap

kacang bogor memerlukan waktu selama 110 hingga 150 hari untuk pertumbuhan

dan perkembangannya, meskipun pernah tercatat di Ghana semua siklus hanya

membutuhkan 90 hari dari tanam hingga panen, sedangkan Karikari et al., (1995)

dalam Hamid (2009) menambahkan bahwa biji masak fisiologis pada umur antara

120-155 hst.

Rukmana dan Oesman (2000) menjelaskan bahwa tanaman kacang bogor

termasuk dalam famili kacang-kacangan yang berbunga kupu-kupu

(Papilionaceae). Secara morfologi, kacang bogor memiliki bagian akar, batang,

daun, dan polong.

Menurut Rukmana dan Oesman (2000), akar tanaman menyebar ke segala

arah, rata-rata kedalaman sebaran akar adalah 30 cm. Kacang bogor termasuk

dalam kacang-kacangan sehingga akar tanamanannya dapat bersimbiosis dengan

bakteri penambat N Rhizobium dan membentuk bintil-bintil pada akar dan

merupakan pengganti pupuk nitrogen. IPGRI (2000) menambahkan bahwa akar

kacang bogor adalah perakaran lateral yang menyebar dan bersifat geotropikal.

Kacang bogor memiliki batang yang pendek dan berjumlah banyak.

Cabangnya ada yang berwarna merah muda, ungu atau hijau kebiruan (Doku dan

Karikari, 1971). Cabang tanaman kacang bogor merupakan salah satu bagian yang

3

mendukung potensi hasil kacang bogor, rata-rata cabang tanaman kacang bogor

terdiri atas ruas-ruas, rata-rata jumlah ruasnya 12 ruas. Ezedinma dan Maneke

(1985) mengelompokkan kacang bogor menjadi tiga kelompok didasarkan pada

diameter tutupan kanopi yaitu bunch 40 cm, semi bunch 40-80 cm dan open lebih

dari 80 cm.

Daun kacang bogor berbentuk lonjong dan berwarna hijau muda hingga

hijau tua, setiap tangkai daun terdiri dari 3 helai daun disebut sebagai trifoliat.

Rata-rata panjang daun 6 cm dan rata-rata lebar daun 3 cm (Rukmana dan

Oesman, 2000).

Kacang bogor termasuk dalam tanaman menyerbuk sendiri dan kelamin

jantan dan betina berada dalm satu bunga yang sama, susunan kromosmnya yaitu

dengan rumus 2n=2x=22 kromosom. Bunga kacang bogor muncul dari ketiak

daun sehingga dalam satu rumpun kacang bogor akan muncul banyak bunga.

Bunganya terdiri atas 5 kelopak dengan 4 kelopaknya terletak di atas dan hampir

bergabung sementara 1 kelopak terletak di bawah (IPGRI, 2000). Bunga kacang

bogor berwarna putih kekuningan saat pagi dan berubah menjadi kuning

kecoklatan saat menjelang malam. Doku dan Karikari (1971) menjelaskan bahwa

kematangan pollen dan reseptifitas stigma terjadi sebelum hingga saat sayap petal

atau petal standart telah terbuka. Saat petal standart terbuka ½ atau lebih dari lebar

bunga maka pollinasi terjadi. Meskipun termasuk tanaman menyerbuk sendiri,

tanaman kacang bogor dapat kawin silang dengan bantuan serangga semut. Saat

bunga membuka, semut akan masuk dengan membawa pollen. Selanjutnya setelah

pembungaan dan pembuahan, tangkai bunga akan memanjang ke dalam tanah,

membentuk genofor dan membentuk buah yang berupa polong (Fachruddin,

2000).

Menurut Duke et al., (1977) dan Mergeai (1986) kultivar kacang bogor

dapat dibedakan berdasarkan morfologinya yaitu meliputi ukuran polong, adanya

kerutan pada polong, ukuran biji, warna biji, jumlah polong per tanaman dan

warna daun. Polong melekat pada tangkai panjang dan berbentuk bulat. Setiap

polong berisi satu biji meskipun ada beberapa yang berbiji dua hingga tiga biji per

polong. Polong kacang bogor saat masih muda berwarna putih susu dan berubah

putih kecoklatan saat tua. Polongnya berbentuk membulat dan berkerut-kerut

4

dengan panjang berkisar antara 1-1,5 cm. Umumnya dalam satu polong terisi satu

hingga dua biji (Rukmana dan Oesman, 2000).

Biji kacang bogor umumnya membulat, halus dan keras jika telah masak

dan kering. Warna bijinya bervariasi yaitu putih, kuning, ungu (Linneman dan

Azam-Ali, 1993), krem, coklat, kehitaman, merah atau ada juga yang bercorak

tutul-tutul (Rukmana dan Oesman, 2000). Kacang bogor adalah tanaman

berkeping dua atau dycotiledone dengan struktur bijinya seperti kebanyakan

kacang-kacangan yang terdiri dari kulit biji (spermodermis), tali pusat (feniculus)

berwarna keputih-putihan, dan inti biji (nucleus seminis) yang merupakan

cadangan makanan (Rukmana dan Oesman, 2000).

Meskipun kacang bogor termasuk dalam tanaman landrace yang dapat

bertahan hidup pada kondisi kekurangan hara dan air namun menurut Astawan

(2009), kacang bogor memiliki syarat tumbuh optimum yaitu ketinggian tempat

1600 meter di atas permukaan laut, suhu udara 19-27oC, pH tanah 5,0-6,5 dan

curah hujan antara 500- 3500 mm per tahun.

C. Pengembangan Bioteknologi Kacang Bambara

Pengembangan bioteknologi kacang bambara saat ini sudah semakin

banyak, hal ini dilakukan untuk meningkatkan mutu genetik melalui beberapa cara

misalkan melalui teknik kultur jaringan, mutasi, transformasi genetik dan MAS

(Marker Assist Selection). Teknik kultur jaringan dilakukan sebagai awal dari

pelaksanaan kegiatan bioteknologi yang lainnya, misalkan mutasi, transformasi

genetik dan memperpendek siklus hidup. Mutasi dilakukan untuk meningkatkan

keragaman dalam kacang bambara, sementara transformasi genetik dilakukan

untuk meningkatkan mutu genetik dengan cara mengintroduksikan gen baru.

MAS adalah teknik yang digunakan dalam membantu proses seleksi gen secara

molekuler, ada banyak tipe MAS yang sudah dilakukan untuk identifikasi karakter

secara molekular pada kacang bambara.

5

Daftar pustaka

Berchie J.N., J. Sarkodie –Addo, H. Adu-Dapaah, A. Agyemang, S. Addy, E. Assare, and J. Donkor. (2010), Yield Evaluation Of Three Early Maturing Bambara Groundnut (Vigna Subterranea L. Verdc.) Landraces at The Csir-Crops Research Institute, Fumesua-Kumasi, Ghana. J. Agric. Sci. 9: 175 - 179

Chomchalow, N. 1993. Bambarra Groundnut. In Prociding FAO/UNDP project/RAS/89/040 Workshop Underxploited dan Potencial Food Legumes in Asia “ Food dan Agriculture Organization of the United Nation Regional Office for Asia dan Pacific, Bangkok. Thailan. pp. 30-34

Doku, E.V. and S.K. Karikari. 1971. Bambara Groundnut. J. Agric. Sci. Hamid (2009)

Duke, J.A., B.N. Okigbo, C.P. Reeds dan J.K.P. Weder. 1977. Bambara Groundnut (Vodanzeia subterranea (L). Thours). J. Agric. Sci, 10: 8-10.

Liu, H. 2010. Kacang Bogor Sehat dan Enak. Available at: File://localhost/F:/Bambara/Kacang-Bogor-Sehat-dan-Enak.html

Mukakalisa, C., 2010. Molecular, Environmental And Nutritional Evaluation Of Bambara Groundnut (Vigna Subterranea (L.) Verdc.) For Food Production In Namibia. Ph.D. Thesis. The University Of Namibia. Namibia

Rukmana, R., dan Y.Y. Oesman., 2000. Kacang Bogor: Budidaya dan Prospek Usahatani. Kanisius. Jogjakarta

Rungnoi, O., J. Suwanprasert, P. Somta and P. Srinives. 2012. Molecular Genetic Diversity Of Bambara Groundnut (Vigna subterranea L. Verdc.) Revealed By Rapd and Issr Marker Analysis. Sabrao. J. Breed. Genet. 44 (1) 87-101

Swanevelder, C.J., 1998. Bambara: food for Africa (Vigna subterranea . bambara groundnut). National Department of Agriculture. ARC- Grain Crops Institute. Pretoria South Africa

6

BAB II KULTUR EMBRIO KACANG BOGOR

A. Pendahuluan

Kultur Jaringan

Kultur jaringan atau Kultur In Vitro adalah suatu teknik untuk

mengisolasi, sel, protoplasma, jaringan, dan organ dan menumbuhkan bagian

tersebut pada nutrisi yang mengandung zat pengatur tumbuh tanaman pada

kondisi aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan

beregenerasi menjadi tanaman sempurna. Kultur jaringan disebut juga sebagai

kultur in vitro karena jaringan dibiakkan di dalam tabung kaca, botol kaca, cawan

Petri dari kaca, atau material tembus pandang lainnya.

Kultur jaringan tanaman secara teoritis dapat dilakukan terhadap semua

jaringan, namun masing-masing jaringan memerlukan komposisi media tertentu.

Dasar teori teknik kultur jaringan adalah teori Totipotensi Sel yaitu bahwa setiap

sel memiliki kemampuan untuk tumbuh menjadi individu yang sempurna apabila

diletakkan pada lingkungan yang sesuai.

Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak

tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara

generatif. Bibit yang dihasilkan dari kultur jaringan mempunyai beberapa

keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang seragam dan identik dengan

induknya, dapat diperbanyak dalam jumlah yang besar tanpa membutuhkan

tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu

yang singkat, kesehatan dan mutu bibit lebih terjamin, kecepatan tumbuh bibit

lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan konvensional, pengadaan bibit

tidak tergantung musim, biaya pengangkutan bibit relatif lebih murah dan mudah.

Metode Kultur Jaringan

Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbanyakan tanaman

dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang

dilakukan dalam wadah yang steril. Dengan demikian Kultur Jaringan Tanaman

dapat didefinisikan sebagai teknik menumbuh kembangkan bagian tanaman, baik

berupa sel, jaringan maupun organ dalam kondisi aseptik secara in vitro.

Dalam pelaksanaannya, mikropropagasi dilakukan di dalam suatu

laboratorium yang terjaga sterilitasnya. melalui beberapa tahapan:

7

o Tahap 0 – preparasi yang terdiri atas proses pemilihan dan persiapan

tanaman induk, pembuatan media tanam dan sterilisasi bahan tanaman

o Tahap I - inisiasi dilakukan dengan persiapan eksplan

o Tahap II – inokulasi dilakukan dengan penanaman eksplan pada media

tanam

o Tahap III - inkubasi dilakukan dengan multiplikasi (perbanyakan)

tunas dan menumbuhkan akar

o Tahap IV – Aklimatisasi dilakukan dengan proses adaptasi pada

lingkungan luar botol

Eksplan

Eksplan adalah bagian dari tanaman yang digunakan dalam

mikropropagasi atau kultur jaringan tanaman. Seluruh bagian tanaman (daun,

batang, dan akar) dapat dipergunakan sebagai eksplan, namun yang biasanya

dipergunakan adalah meristem (jaringan muda), mata tunas dan tunas pucuk

(shoot tip). Eksplan dapat juga berupa embrio (kelapa), benih (anggrek), biji

(sengon), umbi (wortel), keping biji (kotiledon), benang sari dan putik.

Pembuatan eksplan dari bahan induk dilakukan dengan mempergunakan

peralatan yang bersih dan tajam. Eksplan selanjutnya dibawa ke dalam

laboratorium untuk dilakukan sterilisasi. Tahapan sterilisasi, bahan sterilisasi, dan

durasi sterilisasi tiap jenis eksplan tidak sama, namun secara umum sterilisasi

eksplan dilakukan dengan mencuci eksplan dalam air bersih yang mengalir.

8

Media Tanam

Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur

jaringan. Media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh dan mengambil nutrisi

yang mendukung kehidupan jaringan. Media tumbuh menyediakan berbagai

bahan yang diperlukan jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya.

Media yang digunakan biasanya terdiri dari unsur hara makro dan mikro

dalam bentuk garam mineral, vitamin, dan zat pengatur tumbuh (hormon). Selain

itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti gula, agar, arang aktif, bahan organik

lain (air kelapa, bubur pisang, ekstrak buah, ekstrak kecambah) . Media yang

sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol kaca dan disterilisasi.

Komposisi media yang digunakan tergantung dari tujuan dan jenis tanaman yang

dikulturkan.

Berdasarkan komposisi dan kesesuaian media terhadap jenis tanaman yang

akan dikulturkan, dikenal beberapa jenis media dasar:

- Media VW yang diformulasikan dan diperkenalkan oleh E. Vacin dan F.

Went (1949), untuk tanaman Anggrek

- Media MS yang diformulasikan dan diperkenalkan oleh Murashige dan

Skoog (1962) untuk berbagai tanaman hortikultura

- Media Euwen untuk tanaman kelapa

- Media B5 atau Gamborg, digunakan untuk kultur suspense sel kedelai, alfafa

dan legume lain.

- Media White, untuk kultur akar

- Media Woody Plant Madium (WMP) untuk tanaman berkayu

- Media N6 untuk tanaman serealia

- Media Nitsch dan Nitsch untuk kultur sel dan kultur tepung sari

- Media Schenk dan Hildebrandt untuk tanaman berkayu

Pada semua komposisi media kultur jaringan, hormon dan vitamin

diperlukan dalam jumlah yang sangat sedikit. Masing-masing komponen media

memiliki peran, unsur hara makro berfungsi dalam metabolisme tanaman, unsur

hara mikro: pengaturan enzym, vitamin: regulasi (pengaturan), sukrosa sebagai

suplay karbohidrat, sumber karbon, sumber energi, Zat Pengatur Tumbuh (ZPT)

9

untuk merangsang, menghambat atau mengubah pola pertumbuhan dan

perkembangan tanaman, arang aktif untuk mengarbsorbsi senyawa fenolik dan

untuk merangsang pertumbuhan akar, agar sebagai pemadat dan aquades sebagai

pelarut.

Media dasar tersebut dapat dimodifikasi sesuai dengan kebutuhan, dengan

menambahkan vitamin dan zat pengatur tumbuh (hormon). Zat pengatur tumbuh

diperlukan untuk mengatur diferensiasi tanaman.

Pada umumnya, hormon yang banyak dipergunakan adalah golongan

auksin dan sitokinin. Perbandingan komposisi antara kedua hormon tersebut akan

menentukan perkembangan tanaman, yaitu:

- Auxin lebih rendah dari Cytokinin maka terjadi perkembangan akar

- Cytokinin lebih rendah dari Auxin maka terjadi perkembangan tunas

- Auxin sama dengan Cytokinin maka terjadi perkembangan kalus

Salah satu kendala dalam pengembangan kacang bambara adalah karena

tidak adanya pengembangan genetik. Peningkatan nilai genetik kacang bambara

dapat diakukan dengan rekombinasi genetik dan seleksi. Terdapat beberapa

penelitian mengenai efisiensi sistem regenerasi yang sesuai untuk perkembangan

sel dan manipulasi genetik, kultur jaringan harus dilaksanakan sebelum

pelaksanaan transformasi genetik. Kacang-kacangan dengan ukuran benih yang

besar kebanyakan termasuk dalam kelompok rekalsitran dapat disimpan dalam

bentuk regenerasi in vitro. Kone et al., (2013) menyatakan bahwa penelitian

mengenai kacang bambara di bidang bioteknologi juga dilakukan untk

pengembangan teknik integrasi gen dalam tanaman secara langsung untuk

perbaikan plasma nutfah dengan persilangan antar taxa. Pengembangan teknologi

ini tergantung pada efisiensi regenerasi untuk tanaman dewasa yang fertil dengan

menggunakan organ, jaringan dan protoplas, meskipun demikian, kultur jaringan

untuk kacang bambara sangat jarang meskipun perbanyakan dapat dilakukan

dengan menggunakan eksplan embrio, epikotil, hipokotil dan kotiledon.

Beberapa penelitian terdahulu menurut Owonubi et al., (2011) telah

dilakukan kultur jaringan kacang bambara yang berasal dari jaringan adventif

batang dari embrio, ada pula penelitian yang menggunakan eksplan yang berasal

dari kotiledon dan jaringan epikotil, sementara untuk kultur jaringan

10

organogenesis secara langsung dapat dilakukan dengan menggunakan eksplan

yang berasal dari epikotil dan hipokotil. Organogenesis secara langsung pada

eksplan adalah metode multiplikasi yang berguna dalam proses pengembangan

tanaman transgenik. Karena plantlet langsung terbentuk tanpa melalui fase kalus

sehingga variasi somaklonal dapat diminimalisis. Organogenesis sangat berguna

dalam kegiatan modifikasi genetik pada tanaman. Dalam pelaksanaan kultur

jaringan kacang bambara ada beberapa hal yang perlu diperhatikan, dua

diantaranya adalah asal eksplan dan juga komposisi media yang digunakan.

Aklimatisasi

Tahapan akhir dari perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan

adalah aklimatisasi planlet (tanaman kecil). Aklimatisasi adalah kegiatan

memindahkan planlet keluar dari ruangan aseptik. Tahap aklimatisasi merupakan

tahap yang sangat penting dan kritis dalam rangkaian budidaya tanaman in vitro,

karena kondisi lingkungan di rumah kaca atau rumah plastik dan di lapangan

sangat berbeda dengan kondisi di dalam botol kultur.

Aklimatisasi dilakukan dengan memindahkan planlet ke media

aklimatisasi dengan intensitas cahaya rendah dan kelembapan nisbi tinggi,

kemudian secara berangsur-angsur kelembapannya diturunkan dan intensitas

cahayanya dinaikkan. Pemindahan ini dilakukan secara hati-hati dan bertahap,

yaitu dengan memberikan sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit

dari udara luar, sinar matahari langsung dan serangan hama penyakit karena bibit

hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara

luar.

Media tanaman yang dipergunakan dalam tahap ini biasanya berupa bubuk

arang, arang sekam, mos, pakis halus, campuran tanah halus dan kompos, dan

sebagainya. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka

secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara

yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif. Selanjutnya bibit siap

dipindahkan ke lapang atau lahan penanaman.

Lingkungan in vitro Lingkungan ex vitroSuhu 25±2oC Suhu 23-36oC

Intensitas cahaya 1200-200 lux Intensitas cahaya 4000-12000 luxSpektrum cahaya sempit Spektrum cahaya luas

11

Kelembaban relatif 98-100% Kelembaban relatif 40-80%Akar hampir tidak berfungsi Akar sangat berfungsi

Sistem fotosintesis hampir tidak berfungsi

Sistem fotosintesis sangat berfungsi

Hormon eksogen Hormon endogenKondisi steril Kondisi tidak steril

Keberhasilan teknik propagasi secara in vitro ini ditentukan oleh beberapa

faktor, antara lain:

a. Faktor tanaman: Genotipe tanaman (varietas, species tanaman induk), dan

kondisi eksplan (jenis eksplan, ukuran, umur, fase fisiologis jaringan ).

b. Faktor lingkungan tumbuh: Suhu ± 25 oC , kelembaban : 80-99% (botol

tertutup rapat), cahaya dari lampu TL ±1000 lux, dan media tanam jenis

media, komposisi media, hormon

c. Faktor sterilitas / kondisi aseptik: sterilitas bahan dan peralatan

laboratorium degan penggunaan autoklaf, sterilitas ruang dengan

penggunaan bahan antiseptic (kloroform, alkohol), dan sterilitas dalam

pelaksanaan dengan penggunaan entkas dan laminar air flow

B. Teknik kultur embrio pada kacang bogor

1. Organogenesis kacang bambara oleh Owonubi et al., (2011)

Owonubi et al., (2011) dalam penelitian mengenai organogenesis pada

kacang bambara menggunakan teknik in-vitro dengan media MS. Prosedur

pelaksanaan yang telah dilakukan adalah sebagai berikut,

Benih dari aksesi yang digunakan disterilisasi dengan ethanol 70% untuk

satu menit yang dilanjutkan dengan sterilisasi permukaan dengan 10% larutan

sodium hipoklorit dan dua tetes minyak Tween-20 selama 20 menit. Eksplan

dicuci sebanyak tiga kali dengan aquades dan dikocok semalaman. Sterilisasi

kedua dilakukan dengan menggunakan larutan sodium hipoklorit 5% dengan dua

tetes minyak tween-20 selama 10 menit dan dicuci dengan aquades sebelum

dipotong-potong menggunakan stereomikroskop pada LAFC.

Embrio yang sudah diberikan perlakuan dikulturkan pada test tube dengan

medium MS bervitamin. Media MS mengandung 3% sukrosa, 100mg/l myo-

inositol, 0,7% agar dengan pH media 5,8 dan dilanjutkan dengan autoclav dengan

tekanan 15 psi dan suhu 121oC selama 15 menit dan diinkubasi pada ruang

12

pertumbuhan dengan suhu 24±2oC dibawah penyinaran 16 jam. Masa inkubasi

dilakukan selama 4 minggu.

Setelah 4 minggu, plnanlet dengan pertumbuhan akar yang baik dapat

dipindahkan dari media kultur dan setelah pencucian dengan air mengalir,

tanaman dapat dipindahkan ke media yang berisi 70% topsoil, 20% serat

kelapadan 10% pasir yang telah disterilisasi selam 4 jam sebelum digunakan.

Setelah 3 minggu, tanaman dapat dipindahkan ke media yang mengandung tanah,

pasir dan pupuk dan ditumbuhkan di dalam rumah kaca selama 3 minggu untuk

aklimatisasi.

2. Kultur kotiledon pada kacang bambara oleh Kone et al., (2013)

Pada penelitian lain oleh Kone et al., (2013) dalam penelitiannya

mengenai organogenesis kacang bambara dengan eksplan kotiledon melakukan

penelitian dengan metode sebagai berikut,

Keterangan: (a) Benih yang digunakan untuk regenerasi, (b) benih yang sudah

dibuang kulit luarnya, (c) benih yang dipotong transvesal, (d) benih yang dipotong

longitudinal, (e) eksplan dalam media organogenesis, (f) regenerasi batang

langsung dari kotiledon dengan bagian adaxial pada medium, (g) regenerasi

batang langsung dari kotiledon dengan bagian abaxialpada medium, (h)

pembentukan akar pada medium pengakaran MS tanpa ZPT, (i) pemindahan

plantlet ke medium tanah:pasir, (j) tanaman yang diaklimatisasi pada greenhouse

(Kone et al., 2013)

Benih kacang bambara yang diambil dari kotiledon yang memiliki

kemampuan untuk regenerasi, mudah ditumbuhkan dan dapat dikembangkan

dalam jumlah yang banyak. Benih kemudian disterilisasi dengan menggunakan

ethanol 70% selama satu menit dan dilanjutkan dengan 7% kalsium hipoklirit

13

selama 30 menit. Pada tahap selanjutnya benih dicuci dengan aquade sebanyak 4

kali dan dikocok pada air steril 25oC selama 48 jam dalam keadaan gelap. Setelah

proses ini selesai kemudian benih dikeringkan dengan kertas filter, kulit benih

dilepaskan dan kotiledon dipisahkan dengan embrio, tahap ini yang disebut

sebagai de-embrionasi. Kotiledon ditanam dengan terlebih dulu memoting

kotiledon dengan ukuran 0,5 cm2 dan eksplan kemudian diinkubasi pada media

kultur MS.

Setelah batang adventif terbentuk sekitar 2-3 cm maka eksplan

dipindahkan ke media pengakaran dengan komposisi dasar MS tanpa penambahan

ZPT. Saat batang sudah mencapai 3-4 cm dan akar sudah terbentuk sekitar 6-8

dengan 4 atau 5 daun maka dilanjutkan dengan pemindahan pada media baru yang

berisi tanah dan pasair 1:1 dengan penutup untuk menjaga kelembaban. Pot yang

diguanakan sebagai media harus dijaga suhu dan kelembabannya yaitu 25 ± 2 ºC,

dan kelembaban 40–50% dan fotoperiodisitas atau penyinaran 16 jam penyinaran

8 jam. Setelah tanaman tidak lagi ditutup dengan plastik, maka tanaman sudah

bisa ditransfer pada greenhouse.

3. Pemendekan sikluas generasi kacang bambara dengan kombinasi teknik In

vitro dan in vivo oleh Dapaah dan Sangwan (2004)

Mutasi dengan kombinasi teknik in vitro dan in vivo dilakukan dengan

melalui empat tahap yaitu:

- Media kultur: media yang digunakan adalah media MS dengan komposisi

makro elemen, mikro elemen dan vitamin, 2% sukrosa dan 0,6% agar.

Medium yang dibuat sudah didesain untuk media kultur bambara yang

mengandung jenis dan konsentrasi ZPT berbeda. Untuk mendukung

pertumbuhan akar maka ditambahkan ZPT 0,5-1,0mg/l NAA.

- Sterilisasi: kacang bambara dikocok dengan aquades selama satu malam,

setelah pengocokan selama satu malam kemudian benih dicuci debanyak

3-4 kali pencucian. Setelah semua proses tersebut dilanjutkan dengan

sterilisasi permukaan dengan ethanol 70% dan 5% kalsium hipoklorit.

- Kondisi kultur: untuk memperpendek siklus generasi, terdapat tiga

perlakuan yaitu dengan menggunakan eksplan (1) benih kacang bambara

kontrol, (2) benih yang kulit bijinya sudah dilepaskan dan (3) embrio yang

14

diisolasi dari benih, embrio dipisahkan dari benih dengan hati-hati dengan

skapel. Benih dan embrio ditanam di cawan petri, kondisi ruang kultur

dibuat dengan kondisi 5000 lux dengan lama penyinaran 10 jam dan rata-

rata 27oC saat siang dan 25oC. Saat eksplan setinggi 3-4 cm maka eksplan

dipindahkan ke greenhouse.

C. Evaluasi hasil kultur embrio kacang bogor

1. Organogenesis pada kacang bambara oleh Owonubi et al., (2011)

Konsentrasi dari dua hormon auksin dan sitokinin pada media memberikan

pengaruh yang besar terhadap regenerasi planlet. Kombinasi BA 0,45mg/l dan

NAA 0,25mg/l menghasilkan jumlah batang yang banyak dengan nilai panjang

batang yang tinggi. Pengurangan konsentrasi NAA menjadi 0mg/l ternyata dapat

menurunkan regenerasi batang dan daun. Hasil menunjukkan bahwa konsentrasi

yang berbeda dari NAA antara 0-0,25mg/l dapat mempengaruhi frekuensi

regenerasi dengan peningkatan konsentrasi NAA, sementara konsentrasi BA yang

rendah dapat menginduksi pembentukan batang. Keberhasilan kultur in vitro

didapatkan dengan mengatur konsentrasi hormon sitokinin dan uksin pada meda.

Keseimbangan hormon menjadi sangar penting. Pembelahan sel dan pembesaran

sel terjadi pada jaringan yang aktif dengan sitokinin dan auksin yang simbang.

Sementara itu, pembentukan kalus terjadi pada media yang lebih banyak

mengandung auksin-NAA pada media sehingga pembentukan akar lebih tingi.

15

2. Kultur kotiledon pada kacang bambara oleh Kone et al., (2013)

Kone et al., (2013) dari hasil penelitian yang dilakukannya menunjukkan

bahwa regenerasi batang yang paling optimum adalah dari kotiledon dengan

konsentrasi hormon BAP tinggi, hal ini dikarenakan sitokinin dapat meningkatkan

deferensiasi dan laju translokasi.pada beberapa spesies kacang-kacangan, efek

dari konsentrasi tinggi dari sitokinin dan konsentrasi auksin yang rendah dapat

menyebbkan respon organogenesis batang lebih baik daripada media dengan

hormon sitokinin saja. Pada kultur kotiledon V.subterranea, tunas muncul dari

adaxial dan abaxial dari kotiledon.

3. Pemendekan sikluas generasi kacang bambara dengan kombinasi teknik In

vitro dan in vivo oleh Dapaah dan Sangwang (2004)

Rerata perkecambahan dan pertumbuhan plantlet menunjukkan bahwa

benih tanpa kulit berkecambah 7 hari setelah penanaman, benih dengan kulit

berkecambah 14 hari. Pada 21 hst persentase perkecambahan sudah sempurna.

Persentase perkecambahan menunjukkan bahwa pada eksplan yang berasal

dari embrio menghasilkan persentase perkecambahan yang paling besar hampir

dua kali benih yang dikupas dan tidak dikupas, hal ini dimungkinkan karena

proses perkecambahan semakin cepat jika embrio dikeluarkan dari kotiledon.

Untuk ukuran plantlet dan panjang akar untuk benih yang dikupas dan tidak

dikupas menunjukkan hasil yang lebih tinggi yaitu tiga kali lipatnya dari eksplan

embrio hal ini dikarenakan eksplan benih dengan kotiledon memiliki cadangan

16

makanan yang lebih banyak untuk mendukung regenerasi eksplan, meskipun

demikian jumlah cabang lebih banyak tiga kali lipat pada eksplan embrio.

Kultur in vitro dilakukan untuk memperpendek siklus generasi pada

kacang bambara sehingga pertumbuhan vegetatif dapat dikurangi untuk

membentuk beberapa biji. Sebenarnya teknik ini dikembangkan untuk seleksi

SSD (Single Seed Descent) untuk mendapatkan benih dari satu tanaman untuk

ditanam kembali secara in vivo dan diseleksi. Dengan sistem ini maka dalam satu

tahun dapat digunakan untuk menyeleksi empat generasi secara langsung yang

tidak mungkin dilakukan jika dilakukan secra in vivo.

Durasi yang semakin pendek akan menyebabkan perbanyakan dengan

teknik gabungan in vitro dan in vivo semakin efisien and independensi genetik

sehingga sangat memungkinkan untuk digunakan sebagai aplikasi bioteknologi.

Teknik gabungan ini juga pernah digunakan dalam pengembangan benih kacang

bambara dalam jumlah banyak yang merupakan hasil mutasi dengan irradiasi

sinar gamma.

D. Penutup

a. Kesimpulan

Dalam kegiatan kultur pada kacang bambara seperti kultur jaringan yang

lain, media perlu untuk diperhatikan selain komposisi dasar yaitu ZPT. ZPT

sangat penting untuk diperhatikan karena konserntrasi ZPT akan mempengaruhi

pemanjangan akar, batang dan pembentukan kalus. Seperti pada penelitian yang

pernah dilakukan untuk perlakuan ZPT BA yang tinggi dan NAA yang rendah

menginduksi pembentukan akar sebaliknya ZPT BA rendah dan NAA tinggi

menginduksi pembentukan batang dan pada konsentrasi keduanya yang sama

menginduksi pembentukan kalus.

Selain itu, pada penelitian lain yang menggunakan eksplan berupa benih

(dengan pengupasan dan tanpa pengupasan) dan kultur embrio menunjukkan

perbedaan dalam beberapa hal yaitu kecepatan kecambah, panjang akar, batang

dan jumlah batang. Kultur in vitro pada kacang bambara dapat dilakukan untuk

membantu memperpendek siklus hidup sehingga memudahkan dalam pelaksanaan

pemuliaan tanaman sehingga dapat menghemat waktu satu tahun dapat digunakan

untuk perkembangan empat generasi kacang bambara.

17

b. Rekomendasi

Penggunaan teknik in vitro dari beberapa penelitian yang pernah ada maka

kultur in vitro dapat digunakan untuk kegiatan pemuliaan bioteknologi misalkan

transformasi genetik, mutasi atapun memperpendek masa regenerasi sehingga

lebih efektif dan efisien.

Daftar Pustaka

Dapaah, A., and Sangwan. 2004. Improving bambara groundnut productivity

using gamma irradiation and in vitro techniques. African Journal of

Biotechnology. 3(5): 260-265

Kone, M., T. Kone., H.T. Kouakou, S. Konate and J.S. Ochatt. 2011. Plant

regeneration via direct shoot organogenesis from cotyledon explants of

Bambara groundnut, Vigna subterranea (L.) Verdc. Biotechnol. Agron.

Soc. Environ. 2013 17(4), 584-592

Nugrahani, P., Sukendah dan Makziah. 2011.Teknik Propagasi Secara In Vitro.

Universitas Pembangunan Nasional. Surabaya

Owonubi, S.J., O.B. Ojuederie, dan M.N.Olayode. 2011. Organogenesis of

Bambara Groundnut (Vigna subterranea (L.) Verdc.) through in Vitro

Culture from Nodal Segmen. International Journal of Plant Development

Biology

18

BAB III INDUKSI MUTASI KACANG BOGOR

A. Pendahuluan

Pengertian Mutasi

Menurut Warianto, (2011) mutasi berasal dari kata Mutatus (bahasa latin)

yang artinya adalah perubahan. mutasi didefenisikan sebagai perubahan materi

genetic (DNA) yang dapat diwariskan secara genetis keketurunannya. Mutasi

adalah perubahan pada materi genetik suatu makhluk yang terjadi secara tiba-tiba,

acak, dan merupakan dasar bagi sumber variasi organisme hidup yang bersifat

terwariskan (heritable). Mutasi juga dapat diartikan sebagai perubahan struktural

atau komposisi genom suatu jasad yang dapat terjadi karena faktor luar (mutagen)

atau karena kesalahan replikasi. Peristiwa terjadinya mutasi disebut mutagenesis.

Makhluk hidup yang mengalami mutasi disebut mutan dan factor penyebab

mutasi disebut mutagen (mutagenic agent). Perubahan urutan nukleotida yang

menyebabkan protein yang dihasilkan tidak dapat berfungsi baik dalam sel dan sel

tidak mampu mentolerir inaktifnya protein tersebut, maka akan menyebabkan

kematian (lethal mutation).

Mutasi adalah perubahan yang terjadi pada bahan genetik (DNA maupun

RNA), baik pada taraf urutan gen (disebut mutasi titik) maupun pada taraf

kromosom. Mutasi pada tingkat kromosomal biasanya disebut aberasi. Mutasi

pada gen dapat mengarah pada munculnya alel baru dan menjadi dasar bagi

kalangan pendukung evolusi mengenai munculnya variasi-variasi baru pada

spesies. Mutasi dapat mempengaruhi DNA maupun kromosom. DNA dapat

dipengaruhi pada saat sintesis DNA (replikasi). Pada saat tersebut factor

mutagenic mempengarugi pasangan basa nukleutida sehingga tidak berpasangan

dengan basa nukleutida yang seharusnya (mismatch). Misalnya triplet DNA

cetakan adalah TTA. Namun karena adanya mutagen menyebabkan DNA

polymerase memasangkan A dengan C, bukan dengan T.

Jenis-jenis mutasi

Menurut Kejadiannya Mutasi dapat terjadi secara spontan (spontaneous

mutation) dan juga dapat terjadi melalui induksi (induced mutation). Mutasi

spontan adalah mutasi (perubahan materi genetik) yang terjadi akibat adanya

sesuatu pengaruh yang tidak jelas, baik dari lingkungan luar maupun dari internal

19

organisme itu sendiri. Sedangkan mutasi terinduksi adalah mutasi yang terjadi

akibat paparan dari sesuatu yang jelas, misalnya paparan sinar UV. Secara

mendasar tidak terdapat perbedaan antara mutasi yang terjadi secara alami dan

mutasi hasil induksi.

Berdasarkan sel yang mengalami mutasi, mutasi dibedakan atas mutasi

somatik dan mutasi gametik atau germinal. Mutasi somatik adalah mutasi yang

terjadi pada sel-sel somatik. Sedangkan mutasi gametik atau germinal adalah

mutasi yang terjadi pada sel gamet. Mutasi somatik dapat diturunkan dan dapat

pula tidak diturunkan. Sedangkan mutasi gametik, karena terjadinya di sel gamet,

maka akan diwariskan oleh keturunannya.

Mutasi secara umum menurut tempat terjadinya ada dua yaitu:

a. Mutasi gen ialah perubahan kimiawi pada satu atau beberapa pasangan

basa dalam satu gen tunggal yang menyebabkan perubahan sifat individu

tanpa perubahan jumlah dan susunan kromosomnya.

b. Mutasi kromosom adalah perubahan yang terjadi pada kromosom yang

disertai dengan perubahan struktur dan jumlah kromosom.

Mutasi kromosom atau sering juga disebut dengan mutasi besar/gross

mutation atau aberasi kromosom adalah perubahan jumlah kromosom dan

susunan atau urutan gen dalam kromosom. Mutasi kromosom sering terjadi

karena kesalahan meiosis dan sedikit dalam mitosis. Mutasi kromosom

berdasarkan jumlah kromosomnya dibagi menjadi dua yaitu Aneuploid dan

Aneusomi:

- Aneuploidi adalah perubahan jumlah kromosomnya. Aneuploidi dibagi

menjadi 2, yaitu:

20

Autopoliploidi, yaitu kromosomnya mengganda sendiri karena

kesalahan meiosis.

Allopoliploidi, yaitu perkawinan atau hibrid antara spesies yang

berbeda jumlah set kromosomnya.

- Aneusomi adalah perubahan jumlah kromosom. Penyebabnya adalah

anafase lag (peristiwa tidak melekatnya beneng-benang spindel ke

sentromer) dan non disjunction (gagal berpisah).

Mutasi kromosom menurut Suparmuji (2009) berdasarkan jumlah

kromosomnya dibagi menjadi empat yaitu duplikasi, translokasi, delesi

(defisiensi) dan inversi:

1. Delesi adalah mutasi karena kekurangan segmen kromosom. Penghilangan

dapat terjadi pada segmen panjang lengan kromosom seperti yang

dilaporkan pada tanaman gandum. Tergantung pada gen dan tingkat ploidi,

defisiensi dapat menyebabkan kematian, separuh kematian, atau

menurunkan viabilitas. Pada tanaman defisiensi yang ditimbulkan oleh

perlakuan bahan mutagen (radiasi) sering ditunjukkan dengan munculnya

mutasi klorofil. Kejadian mutasi klorofil biasanya dapat diamati pada

stadia muda (seedling stag), yaitu dengan adanya perubahan warna pada

daun tanaman.

2. Duplikasi adalah mutasi karena kelebihan segmen kromosom. Mutasi ini

terjadi pada waktu meiosis, sehingga memungkinkan adanya kromosom

lain (homolognya) yang tetap normal. Duplikasi menampilkan cara

peningkatan jumlah gen pada kondisi diploid. Dulikasi dapat terjadi

melalui beberapa cara seperti: pematahan kromosom yang kemudian

diikuti dengan transposisi segmen yang patah, penyimpangan dari

mekanisme crossing-over pada meiosis (fase pembelahan sel),

rekombinasi kromosom saat terjadi translokasi, sebagai konsekuensi dari

inversi heterosigot, dan sebagai konsekuensi dari perlakuan bahan

mutagen. Beberapa kejadian duplikasi telah dilaporkan dapat

miningkatkan viabilitas tanaman.

3. Translokasi ialah mutasi yang mengalami pertukaran segmen kromosom

ke kromosom non homolog. Translokasi terjadi apabila dua benang

21

kromosom patah setelah terkena energi radiasi, kemudian patahan benang

kromosom bergabung kembali dengan cara baru. Patahan kromosom yang

satu berpindah atau bertukar pada kromosom yang lain sehingga terbentuk

kromosom baru yang berbeda dengan kromosom aslinya. Translokasi

dapat terjadi baik di dalam satu kromosom (intrachromosome) maupun

antar kromosom (interchromosome). Translokasi sering mengarah pada

ketidakseimbangan gamet sehingga dapat menyebabkan kemandulan

(sterility) karena terbentuknya chromatids dengan duplikasi dan

penghapusan.

4. Inversi ialah mutasi yang mengalami perubahan letak gen-gen, karena

selama meiosis kromosom terpilin dan terjadi kiasma. Inversi terjadi

karena kromosom patah dua kali secara simultan setelah terkena energi

radiasi dan segmen yang patah tersebut berotasi 180o dan menyatu

kembali. Kejadian bila centromere berada pada bagian kromosom yang

terinversi disebut pericentric, sedangkan bila centromere berada di luar

kromosom yang terinversi disebut paracentric.

Induksi Mutasi

Mutasi berdasarkan mutagennya dibagi menjadi dua yaitu mutasi alami

dan mutasi buatan.

- Mutasi alam atau mutasi spontan biasanya terjadi karena kesalahan

pemasangan basa pada waktu proses replikasi, perbaikan, atau

rekombinasi DNA sehingga mengarah pada terjadinya substitusi, insersi

atau delesi pasangan basa. Selain itu mutasi secara alami dapat terjadi

karena radiasi radioaktif alam, sinar kosmis dan sinar ultraviolet.

- Mutasi buatan, yaitu mutasi yang ditimbulkan akibat campur tangan

manusia (telah direncancanakan). Dengan memperlakukan sel

menggunakan zat-zat kimia, sinar-X, sinar gamma, sinar alfa, dan

beberapa jenis radiasi hasil sampingan tenaga nuklir. Penyebab mutasi

dalam lingkungan yang bersifat fisik menurut Warianto (2011) adalah

radiasi dan suhu. Radiasi sebagai penyebab mutasi dibedakan menjadi

radiasi pengion dan radiasi bukan pengion.

22

o Radiasi pengion adalah radiasi berenergi tinggi sedangkan radiasi

bukan pengion adalah radiasi berenergi rendah. Contoh radiasi

pengion adalah radiasi sinar X, sinar gamma, radiasi sinar kosmik.

Contoh radiasi bukan pengion adalah radiasi sinar UV. Radiasi

pengion mampu menembus jaringan atau tubuh makhluk hidup

karena berenergi tinggi.

o Radiasi bukan pengion hanya dapat menembus lapisan sel-sel

permukaan karena berenergi rendah. Radiasi sinar tersebut akan

menyebabkan perpindahan elektron-elektron ke tingkat energi yang

lebih tinggi.

o Penyebab mutasi dalam lingkungan yang bersifat kimiawi disebut

juga mutagen kimiawi. Mutagen-mutagen kimiawi tersebut dapat

dipilah menjadi 3 kelompok, yaitu analog basa, agen pengubah

basa dan agen penyela.

B. Teknik induksi mutasi pada kacang bogor

Kacang bambara adalah kacang-kacangan yang banyak diproduksi di

Nigeria, Niger, dan Ghana dan pada daerah-daerah di Afrika barat. Kacang

bambara mengandung protein lysin dan methonine, kandungan proteinnya sekitar

18%-24%, karbohidrat 51%-70%, energi 367-414 kcal per 100g, zat besi 4,9-48

mg/100g. Masalah yang dihadapi dalam pengembangan kacang bogor yaitu

potensi hasil yang rendah, rentan terserang penyakit seperti Cercospora, virus

mozaic, dan hama. Induksi nutasi pada kacang bambara juga dilakukan untuk

mengembangkan potensi hasil bambara sementara sedikit sekali pengembangan

indksi mutasi dengan tujuan untuk mengamati pengaruh terhadap resistensi

penyakit. Dengan dilakukannya mutasi maka variasi genetik yang terbentuk

menjadi lebih banyak sehingga memudahkan dalam melakukan seleksi untuk

tindakan pemulian selanjutnya.

Mutasi dapat dilakukan dengan berbagai cara, yang paling umum adalah

mutasi dengan irradiasi, contohnya dengan penyinaran sinar gamma.

Pembelajaran mengenai mutagen kimia didahului dengan percobaan dengan

mutasi menggunakan radiasi sebagai agen mutagenik. Saat ini mutasi kimia telah

banyak diuji cobakan dengan beberapa sistem mutagen biologis, contohnya yaitu

23

ethylenimine, N-ethyl-N-nitrisomourea, diethylsulphonate, ethyle methane

sulphonate, sodium azide, hydroxylamine, colchicin dan streptomycin.

Streptomycin adalah antibiotik yang bekerja sebagai reaktor dengan

elemen non-kromosomal dalam sel. Efek strpthomycin pada jagung dan bunga

matahari dapat menyebabkan male sterility, pada rye menyebabkan pengkerdilan

dan penebalan pada akar. Pemberian streptomycin pada perkecambahan dapat

menyebabkan rendahnya klorofil karena hambatan yang disebabkan karena

streptomycin terhadap pembentukan klorofil.

Peningkatan produksi kacang bambara dapat dilakukan dengan teknik

rekombinasi genetik dan seleksi, induksi mutasi, dan bioteknologi. Penggunaan

streptomycin dapat digunakan untuk mengidentifikasi faktor-faktor genetik yang

dapat meningkatkan program pemuliaan pada tanaman. Tujuan dari penelitian

yang dilakukan adalah untuk mengetahui frekuensi, efektifitas dan efisiensi

streptomycin sebagai mutagen pada kacang bambara untuk pertama kali.

Pada dasarnya, semua materi mutagen yang diberikan adalah sebagai satu

upaya untuk membetntuk rekombinasi genetik dengan cara bereaksi dengan

kromosom dalam sel untuk merekombinasi susunan baik pada kromosom, DNA

aupun RNA. Mutasi dapat terjadi pada gen yang disebut dengan mutasi titik yang

dapat memunculkan adanya alel baru dan juga dapat terjadi pada kromosom yang

disebut dengan aberasi. Maka penelitian oleh Adu-Dapaah (2004) dan Mensah et

al, (2012) memfokuskan untuk meneliti mengenai mutasi pada kacang bambara

untuk meningkatkan ketahanan penyakit dan peningkatan hasil.

Mutasi pada kacang bambara sudah pernah dilakukan beberapa kali dalam

beberapa penelitian mengenai pembentukan variasi genetik kacang bambara

melalui teknik induksi mutasi.

1. Mutagen Streptomycin

Benih kacang bambara Africa dari petani lokal diambil sebagai sampel

yang memiliki keseragaman ukuran, warna cream dan bebas hama penyakit.

Benih diberikan perlakuan rendaman streptomycin dengan konsentrasi 0%

(kontrol), 0,005%, 0,05%, 0,5%, 0,75% dan 1,0% (berat/volum) larutan

streptomycin pada cawan petri dengan suhu ruang (25oC).

24

Benih masing-masing 50 benih per perlakuan, dimasukkan dalam beaker

glass bersama dengan larutan streptomycin dan dikocok dengan alat shaking

selama 24 jam. Setelah treatment selesai, benih dicuci pada ddH2O untuk

menghilangkan bahan kimia dan racun yang terbentuk dan ditiriskan pada kain

selama satu minggu kemudian ditanam di plot hingga panen.

Parameter-parameter yang diamati adalah perkecambahan, persentase

tanaman bertahan, jumlah daun, hari berbunga, berat kering, jumlah nodule per

tanaman, jumlah cabang per tanaman, abnormalitas, dan infeksi penyakit.

Efektifitas mutagenik da efisiensi dihitung dengan menggunakan persentase lethal

sebagai dasar perhitungan efisiensi mutagenik.

2. Mutagen Sinar Gamma dan Mutagen Ethylmethan sulphonate (EMS)

Mutasi dengan sinar gamma (GR) dengan 60C gamma 220 unit dosis 0, 50,

100, 150, 200,250, 300, 350, 400 Gy yang dicobakan pada kacang bambara yang

berproduksi tinggi tetapi rentan terhadap serangan Cercospora dan virus Mosaic.

Benih yang diambil adalah benih aksesi lokal yang seragam dan memiliki daya

kecambah 100%. Setelah dilakukan perlakuan selanjutnya benih ditanam dengan

jarak tanam 20 cm x 30 cm.

Mutasi dengan EMS dengan dosis 0,0%, 0,2%, 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0%

dan 1,2%. Benoh diambil dari varietas Tom dan Nav dengan daya kecambah 98%.

Benih sebanayak 200 benih tiap perlakuan direndam pada EMS yang telah

dilarutkan pada beaker glass dan diletakkan pada shaker selama 6 jam. Setelah 6

jam, benih dicuci dan ditanam pada lahan dengan jarak tanam 20 cm x 30 cm.

C. Evaluasi hasil induksi mutasi kacang bogor

1. Mutagen Streptomycin

a. Perkecambahan, tanaman bertahan, sensitifitas, dan efektifitas mutagen.

25

Perkecambahan benih terhadap dosis mutasi adalah berbanding terbalik,

semakin tinggi dosis maka persentase perkecambahan akan semakin rendah.

Pengamatan ertumbuhan dan kemampuan bertahan tanaman juga menunjukkan

pola yang sama dengan perkecambahan. Perlakuan kontrol memiliki kemampuan

bertahan yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan konsentrasi mutagen yang

lain.

Kemampuan 50% tanaman dalam populasi untuk bertahan (LC50) telah

terbukti terjadi pada kacang bambara yang telah direndam streptomycin 0,5% w/v

selama 24 jam. Pola survival tanaman mingikuti pola perkecambahan hanya saja

lebih rendah. Pada konsentrasi 0,5% dan 1,0% ST menunjukkan penurunan

perkecambahan dengan cepat. Berdasarkan persentase pertahanan tanaman LC50

ditunjukkan oleh konsentrasi ST 0,5% w/v. Penurunan perkecambahan dan

pertahanan tanganan dapat dipengaruhi oleh gangguan fisiologi atau kromosom

pada sel yang menyebabkan mutasi.

Frekuensi mutagenik antara 2,75% hingga 42,7%, frekuensi akan

meningkat seiring dengan peningkatan konsentrasi mutagen. Aberasi morfologi

digunakan untuk perhitungan frekuensi mutasi yang meliputi bentuk daun,

internode, klorofil. Efektifitas mutagenik ST menurun dengan meningkatnya

konsentrasi ST, hal ini terbukti dengan lebih efektifnya konsentrasi rendah

0,005% dan 0,05% untuk menginduksi mutan pada kacang bambara. Efisiensi

mutagenik dapat dihitung berdasarkan kemampuan untuk menyebabkan kematian

pada hst 21. Hasil menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi maka level

kematian akan semakin besar. Terkadang, semakin tinggi konsentrasi maka

efisiensi makin tinggi, hal ini bertentangan dengan hasil yang diperoleh bahwa

efektifitas mutagenik tertinggi ada pada konsentrasi mutagenik terendah.

b. Pengamatan Agronomi

Peningkatan konsentrasi ST menunjukkan reduksi jumlah daun pada

0,005%, 0,5%, dan 0,75% sementara jumlah daun maksimum terdapat pada

konsentrasi ST 0,05%.

26

Hasil pengamatan terhadap jumlah cabang menunjukkan bahwa tidak ada

efek yang tinggi akibat peningkatan konsentrasi ST pada setiap tanaman.

Peningkatan konsentrasi ST pada 0,005% dan 0,05% mempengaruhi pengurangan

pemebentukan daun sebagai akibat inisiasi pembentukan bunga. Konsentrasi

0,5%, 0,75%, dan 1,0% ST menyebabkan penundaan pembunggan.

Hasil menunjukkan bahwa ST dapat digunakan untuk menghasilkan varian

kacang bambara dengan waktu pemasak yang cepat.

Konsentrasi 0,05% ST menunjukkan peningkatan yang tajam terhadap

jumlah nodule antara minggu ketiga dan kelima. Pada minggu ketujuh, jumlah

nodule mengalami penurunan pada setiap konsentrasi, hal ini menunjukkan tidak

efektifnya sistem nodule akar terhadap waktu, nodule memiliki waktu fungsional

yang pendek.

c. Hasil Vegetatif

Peningkatan konsentrasi ST menunjukkan pengurangan berat kering per

tanaman, tetapi pada konsentrasi 0,05% berat kering meningkat signifikan.

27

d. Infestasi spot daun

Pada konsentrasi ST yang lebih tinggi serangan penyakit spot daun

semakin menurun. Setiap peningkatan konsentrasi streptomycin, jumlah daun per

tanaman yang terinfestasi menurun kecuali dibawah 0,005%, karena pada

konsentrasi dibawah 0,005% mengalami peningkatan jumlah daun yang

terinfestasi spot daun, hal ini menunjukkan bahwa pada konsentrasi 0,005% ST

terlalu rendah untuk secara efektif mengatasi infestasi Cercospora spot daun. Hasil

menunjukkan bahwa konsentrasi 1,0% menghasilkan tanaman dengan jumlah spot

daun paling rendah.

2. Mutagen Sinar Gamma dan Mutagen Ethylmethan sulphonate (EMS)

a. Perkecambahan, tanaman bertahan, frekuensi mutasi, dan efektifitas

mutagen.

Secara umum hasil yang ditunjukkan melalui mutasi sinar gamma lebih

baik daripada hasil EMS. Hasil menunjukkan bahwa LD50 untuk varietas Tom

optimum berkisar pada 175 Gy dan 182 Gy pada Nav. Penurunan vigor tanaman

meningkat seiring dengan peningkatan dosis mutasi yang diberikan.

Mutagenik EMS LD50 pada persentase 0,75% Tom dan 0,82 pada Nav.

Populasi dengan perlakuan EMS, persentase tanaman bertahan tidak terlalu

bervariasi jika dibandingkan dengan kontrol pada dosis antara 0,2% dan 0,4%,

sementara pada dosis 0,6% hingga 1,2% dosis EMS menyebabkan penurunan

kemampuan tanaman untuk bertahan hidup. Efektifitas mutasi ditunjukkan oleh

dosis efektif dari kedua kultivar (Tom dan Nav) yaitu 0,6%.

28

Seiring dengan meingkatya dosis irradiasi sinar gamma maka frekuensi

terjadinya mutasi akan semakin tinggi, namun efektifitas mutasi paling tinggi

terjadi pada dosis mutasi antara 150 Gy untuk Tom dan 200 untuk Nav, hari

berkecambah juga berbanding lurus dengan dosis yang diberikan, semakin tinggi

dosis irradiasi sinar gamma yang diberikan maka waktu berkecambah semakin

lama, sedangkan untuk jumlah tanaman bertahan semakin rendah seiring dengan

meningkatnya dosis, pada varietas Tom jumlah bertahan 50 (LD50) pada

konsentrasi maksimal 175 Gy sedangkan LD50 pada Nav maksimal pada 182 Gy.

Seiring dengan meingkatya dosis EMS maka frekuensi terjadinya mutasi

akan semakin tinggi, namun efektifitas mutasi paling tinggi terjadi pada dosis

mutasi antara 0,6% untuk Tom dan Nav, hari berkecambah juga berbanding lurus

dengan dosis yang diberikan, semakin tinggi dosis irradiasi sinar gamma yang

diberikan maka waktu berkecambah semakin lama, sedangkan untuk jumlah

29

tanaman bertahan semakin rendah seiring dengan meningkatnya dosis, pada

varietas Tom jumlah bertahan 50 (LD50) pada konsentrasi maksimal 0,75%

sedangkan LD50 pada Nav maksimal pada 0,82%.

b. Pengamatan agronomi

Efek stimulasi terhadap hari berkecambah, tinggi tanaman, lama menuju

fase generatif, jumlah pod per tanaman dan jumlah hasil biji per tanaman terdapat

pada dosis lebih rendah pada 50 Gy dan 100 Gy pada irradiasi sinar gamma dan

0,2% dan 0,4% pada EMS. Pada parameter yang sama terjadi reduksi sifat

karakter pada dosis irradiasi sinar gamma 150 Gy dan 300 Gy sedangkan 0,6%

dan 1,2% pada EMS terhadap kedua kultivar Tom dan Nav.

Variasi genetik meningkat pada semua variabel pengamatan. Peningkatan

hasil pengamatan pada populasi dengan perlakuan irradiasi sinar gamma dan EMS

yang tinggi 2-4x jika dibandingkan dengan tanpa irradiasi dan tanpa EMS pada

waktu generatif, jumlah pod per tanaman, ukuran biji, dan hasil biji dari dua

varietas tersebut.

Pada semua karakter yaitu jumlah pod per tanaman, ukuran biji, hasil

benih, dan persentase kulit biji perlakuan irradiasi sinar gamma menunjukkan

rerata populasi yang lebih besar dari tanpa perlakuan, hal ini mempengaruhi

variasi genetik yang terbentuk semakin besar yang ditunjukkan dengan nilai

heritabilitas yang tinggi dan pertumbuhan genetik yang signifikan.

30

Sementara pada populasi dengan perlakuan EMS menunjukkan bahwa

rerata populasi untuk karakter jumlah pod, ukuran biji, pada kedua varietas lebih

rendah dari tanpa perlakuan namun tetap menunjukkan peningkatan pada

pembentukan varieasi genetik yang ditandai dengan nilai heritabilitas dan

kemajuan genetik pada populasi hasil mutasi dengan EMS.

c. Infestasi spot daun

Berdasarkan pegamatan terhadap semua tanaman, skoring serangan

penyakit ditunjukkan dengan lima skor dengan rerata yaitu 1,0-1,4 untuk resisten,

1,5-2,5 agak tahan, 2,6-3,5 agak rentan, 3,6-5,0 sangat rentan. Rerata skor

penyakit menunjukkan persentase tanaman terinfeksi. Gambar di bawah ini

menunjukkan hasil mutasi terhadap ketahanan penyakit spot daun Cercospora.

Umumnya, semua perlakuan radiasi dan EMS pada kultivar menunjukkan

hasil lebih baik jika dibandingkan dengan kontrol. Ketahanan terhadap virus

menunjukkan serangan infeksi lebih rendah pada 150 Gy- M3 dan EMS daripada

galur lain. Terjadinya infeksi adalah sekitar 50-80%.

31

Pada kasus antraknose yang disebabkan karena Colletotrichum dematium

lebih merata daripada spot daun Cercospora pada galur radiasi dan EMS.

Persentase terjadinya infeksi lebih besar antara 0-100 pada Colletotrichum

dematium jika dibandingkan dengan Cercospora berkisar antara 0-40%. Meski

demikian persentase serangan pada galur-galur hasil mutasi menunjukkan

persentase serangan yang lebih rendah daripada kontrol, sehingga irradiasi dan

EMS dapat diambil sebagai langkah menangani penyakit pada kacang bambara.

E. Penutup

a. Kesimpulan

Observasi yang dilakukan dengan induksi mutasi kimia Streptomycin pada

kacang bambara menunjukkan hasil yang bervariasi pada parameter pengamatan

yang diamati. Hasil yang penting dalam observasi ini adalah untuk mengetahui

resistensi terhadap penyakit spot daun, seiring dengan peningkatan konsentrasi

maka resistensi akan dapat dicapai. Selain itu, mutasi kimia ST dapat digunakan

untuk mempercepat masa pembungaan dan meningkatkan jumlah daun, jumlah

cabang, jumlah nodule pada konsentrasi dibawah 0,05%. Pemberian ST dapat

membentuk varietas resisten terhadap penyakit spot daun. Studi tentang pewarisan

sifat pada karakter agronomi penting untuk mendukung peningkatan kualitas

genetik untuk petani lokal dan untuk meningkatkan produktifitas tanaman.

Kesimpulan yang hampir serupa dengan perlakuan mutagen Streptomycin

dari perlakuan mutagen sinar gamma dan EMS adalah tingkat kematian 50%

(LD50) pada irradiasi sinar gamma adalah pada 178,56 rata-rata antara 175 Gy

pada Tom dan 182 Gy pada Nav, dan 0,78 pada perlakuan EMS. Mutasi dapat

meningkatkan adanya variasi genetik menjadi 4x dari tanpa perlakuan.

32

Mutagenesis juga dapat digunakan untuk meningkatkan produkrifitas dan

mengendalikan penyakit yang menyerang pada kacang bambara.

b. Rekomendasi

Penggnaan teknik mutasi untuk kacang bambara memiliki peluang yang

baik untuk meningkatkan nilai keragaman, meskipun hasil yang didapat tidak

dapat diperkirakan, tetapi dengan meningkatnya keragaman maka sumber gen

akan tersedia dalam jumlah yang banyak yang berguna dalam kegiatan pemuliaan

baik secara konvensional ataupun modern.

Daftar Pustaka

Adu-Dapaah, H.K., J.Y. Asibuo, O.A. Danquah, M. Owusu Akyaw, J. Haleegoah.

2004. Bambara Groundnut Improvement Through Mutation Breeding In

Ghana. Proceedings Of A Final Research Coordination Meeting Organized

By The Joint Fao/Iaea Division Of Nuclear Techniques In Food And

Agriculture And Held In Pretoria, South Africa, 19–23 May 2003

Mensah, J.K., N.E. Edema, G. Okooboh, and S.O. Aifuwa. 2012. Effects of

Streptomycin on the chemo-sensitivity and agronomic parameters of

bambara groundnut (Vigna subterranea (L.) Verdc.). J.Nat.Prod.Plant

Resour. 2 (1): 113-118

Suparmuji, 2009. Diktat Pembelajaran Biologi Kelas XII IPA: Genetika Mutasi.

_______. ________

Warianto, C., 2011. Modul Perkuliahan 2010-2011: Mutasi. _______. ________

33

BAB IV PENGGUNAAN MARKA SELEKSI

A. Pendahuluan

Salah satu tujuan pemuliaan tanaman menurut Warta Biogen (2004) adalah

merakit suatu tanaman yang memiliki sifat lebih baik dari yang sudah ada.

Perakitan tanaman baru ini biasanya dengan memasukkan gen-gen tertentu yang

memiliki ketahanan terhadap sifat tertentu. Dua tahap yang umum dilakukan

dalam program pemuliaan tanaman adalah membuat variabilitas genetik dengan

program persilangan, kemudian diikuti dengan seleksi masing-masing individu

hasil persilangan yang mengandung gen yang diinginkan.

Seleksi pada umumnya dilakukan dengan menanam tanaman hasil

persilangan dan mengujinya dengan perlakuan tertentu. Namun pada

kenyataannya ketika ditanam di lapang masih ada kemungkinan terjadinya ketidak

sesuaian antara tanaman yang diujikan dengan lingkungan sehingga gen yang

diharapkan tidak terekspresi dengan baik, hal ini tentu saja menyebabkan pemulia

mengalami kesulitan dalam seleksi. Sebagai upaya untuk mengatasi permasalahan

ini maka saat ini telah ada teknologi seleksi dengan menggunakan penanda DNA

ataupun protein sehingga hasil seleksi lebih akurat.

Warta Biogen (2004)

Marka-marka inilah yang kemudian digunakan untuk seleksi yang

kemudian terkenal dengan istilah Marker Assisted Selection (MAS). Penggunaan

marka molekuler ini dapat digunakan bersamaan dengan pengujian fenotipik atau

34

dilakukan terlebih dahulu baru kemudian menguji tanaman yang terpilih secara

molekuler dengan pengujian fenotipik.

Menurut Ahmad (2010), evaluasi dari variasi genetik dalam ataupun antar

populasi dan interaksi gen dengan lingkungannya dapat diketahui dengan

menggunakan marka. Marka penanda DNA secara prinsip dikembangkan dari

teknik Southern blot untuk mengetahui polimorfisme dalam genom yang

kompleks.

Karakteristik RFLP SSR AFLP RAPD SNPNomer Lokus

terdetekiSatu lokus

Satu lokus Multi lokus

Multi lokus

Satu lokus

Alel Co-dominan

Co-dominan

dominan Dominan Co-dominan

Level polimorfisme

Baik Sangat baik

baik Baik Sangat baik

Polimorfisme lokus

2-5 alel Banyak alel

- - 4 alel

Kuantitas DNA yang dipakai

Banyak Sedikit sedikit Sedikit Sedikit

Kualitas DNA yang dipakai

Sangat baik

Sedang baik sedang Sedang

Reproduktibilitas Baik Baik Baik Rendah BaikWaktu Lama Cepat, jika

sudah ditemukan

marker

cepat Cepat Cepat, jika sudah

ditemukan marker

Biaya Mahal Rata-rata Murah Murah MahalTeknik Sulit Mudah Medium Medium Sulit

(Ahmad, 2012).

a. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

RFLP merupakan marka molekuler yang menggunakan enzim restriksi

untuk mengidentifikasi susunan sekuen DNA. Analisis RFLP telah banyak

digunakan untuk mencapai berbagai tujuan karena dengan enzim restriksi maka

variasi keberadaan situs restriksi dapat menunjukkan adanya variasi susunan

DNA. RFLP dapat digunakan sebagai penduga variasi DNA. Variasi DNA dapat

dideteksi dengan pemotongan rangkaian panjang polimorfik (ganda) yang

memungkinkan dari fragmen itu sendiri, rangkaian variasi yang panjang dalam

suatu bagian dapat dinilai dari subtitusi nukleotida.

35

b. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

RAPD adalah jenis reaksi PCR, tetapi segmen DNA yang digunakan

adalah acak. primer yang digunakan dalam RAPD adalah primer acak dan pendek

dengan ukuran basa nukleotida 8-12 nukleotida, bahan yang digunakan sebagai

template PCR adalah DNA genom atau DNA total. RAPD adalah teknik

amplifikasi secara acak baik primer atau tempat penempelan primer, sehingga

pengguna sama-sama tidak bisa memperdiksi primer yang tepat untuk urutan basa

yang sesuai. Dalam beberapa tahun terakhir, RAPD telah digunakan untuk

mengkarakterisasi, dan melacak, filogeni dari spesies tanaman dan hewan yang

beragam.

c. AFLP (Amplified fragment length polymorphism)

AFLP adalah metode yang juga menggunakan PCR sebagai teknik dasar

dalam pelaksanaannya. AFLP menggunakan enzim restriksi untuk memotng

genom DNA yang diikuti dengan ligasi dari hasil fragmen restriksi. Hasil fragmen

selanjutnya diperbanyak pada PCR, fragmen-fragmen itu kemudian diseparasi

dalam gel poliakrilamid dan divisualisasi untuk mengetahui band yang terbentuk.

d. SSR

Mikrosatelit dapat digunakan untuk memperkuat identifikasi yang dapat

dilakukan dengan reaksi berantai polimerase (PCR), primer yang dipakai adalah

dua primer yang melekat pada dua daerah penempelan yang berbeda. DNA

didenaturasi pada suhu tinggi untuk memisahkan untai ganda, kemudian

didinginkan untuk memungkinkan penempelan primer dan pemanjanga

nukleotida. Proses ini menghasilkan produksi DNA yang banyak sehingga dapat

terlihat pada agarose atau gel poliakrilamida; jumlah DNA yang diperlukan untuk

amplifikasi hanya sedikit karena dengan PCR maka DNA dapat ditingkatkan

jumlahnya secara eksponensial pada daerah pemotongan yang kemudian

direplikasi

e. SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

SNP adalah variasi urutan DNA yang terjadi dalam populasi. Urutan

nukleotida tunggal A, T, C, dan G dalam susunan genom memiliki perbedaan

antara spesies. Contohnya pada sampel DNA dua individu dalam spesies yang

36

sama memiliki perbedaan nukleotida tunggal yaitu CCTAGTC dan

CGTAGTC.

B. Teknik Seleksi dengan Marka Seleksi

Menurut Amadou et al., (2001), Rungnoi et al., (2012), taksonomi dari

kacang bogor pada dasarnya berbeda berdasarkan morfologinya namun sering kali

penampilannya dipengaruhi oleh lingkungan, sehingga untuk menghindari adanya

pengaruh lingkungan dalam melihat keragaman kacang bogor maka dilakukan

pelacakan keragaman kacang bogor dengan menggunakan pengujian secara

molekular, salah satunya adalah teknologi RAPD (Random Amplified

Polymorphic DNA) dan didasarkan pada marker atau penanda genetik.

Sebagian besar teknik marka molekuler adalah teknik hasil modifikasi dari

teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) dengan mengamplifikasi genom dengan

menggunakan primer acak dan menghasilkan perbedaan urutan DNA antara

sampel-sampel DNA yang diambil dari individu-individu yang diuji. Perbedaan

urutan basa pada DNA disebabkan karena pengikatan primer oligonukleotida

berbeda sehingga menyebabkan pola larik hasil amplifikasi yang berbeda pula

yang disebut polimorfisme. Polimorfisme inilah yang kemudian dijadikan

penanda adanya keragaman genetik (Kusumawaty, 2007).

Aryani dan Diah (2007) menambahkan bahwa secara umum ada tiga tahap

dalam amplifikasi yaitu denaturasi (denaturation), penempelan (annealing) dan

pemanjangan (extension).

1. Tahap denaturasi terjadi pada suhu tinggi 94oC sehingga utas ganda DNA

terpisah menjadi utas tunggal

2. Tahap penempelan sekuens primer dinamakan annealing dalam suhu

berkisar 60oC yaitu peristiwa saat primer menempel pada DNA utas

tunggal sebagai cetakan. Sintesis DNA berlangsung dari arah sekuens 5’

menuju 3’. Dalam tahap ini ditambahkan DNA polymerase contohnya Taq

polymeras dan MgCl2 dan untuk kebutuhan energi ditambahkan dNTPs

terdiri atas dTTP, dGTP, dATP dan dCTP.

3. Tahap ekstensi atau pemanjangan utas DNA terjadi pada suhu 72oC

dilakukan hingga terbentuk utas DNA ganda yang baru.

37

Teknik analisis DNA dengan marka molekuler secara umum terdiri atas

empat tahapan yaitu ekstraksi DNA, pengujian kualitas dan kuantitas DNA hasil

ekstraksi, amplifikasi DNA dengan teknik RAPD dan pengujian kualitas dan

kuantitas hasil amplifikasi

Berdasarkan Zulkifli et al., (2009), hasil DNA hasil amplifikasi kemudian

diberikan skor sebelum diproses ke dalam software untuk mengetahui kedekatan

antar sampel. Cara untuk pemberian skor adalah dengan memasukkan hasil

amplifikasi ke dalam gel agarose 2,0% dan dilakukan elektroforesis dibawah UV

transluminator dan difoto menggunakan dengan gel documentation system.

Pemberian skor dalam penilaian saat elektroforesis adalah nilai 1 jika terdapat pita

yang jelas dan 0 jika tida muncul pita yang jelas, Kusumadewi et al., (2010)

menambahkan bahwa agar pemberian skor lebih standart maka skoring dengan

berpatokan pada marker atau penanda sebagai penanda untuk menetapkan ukuran

pita DNA. Data hasil skoring kemudian dimasukkan ke dalam software dan

menghasilkan file dendrogram yang menunjukkan jarak genetik dari sampel.

Melalui sumber Anonymous (2013), setelah didapatkan skor data biner

maka selanjutnya dilakukan analisis. Filogenetik adalah cabang ilmu genetik yang

berhubungan dengan penilaian kekerabatan dan kedekatan genetik antar individu

dalam satu atau lebih populasi. Organisme yang berkerabat dekat maka akan

cenderung menunjukkan sekuens yang sama lebih tinggi, sementara jika jarak

kekerabatannya jauh maka jumlah sekuens yang sama akan lebih sedikit.

Filogenetik memiliki fungsi untuk menunjukkan hubungan evolusioner spesies

divergen antar dua organisme sejak keduanya terpisah dari tetua yang sama (asal

mula). Dalam pelaksanaannya, filogenetik terbagi atas dua metode yaitu metode

fenetik yang berfungsi untuk menunjukkan pohon filogeni dengan

memperhitungkan kemiripan sekuens yang dihasilkan. Pohon filogeni disebut

dengan dendogram. Metode kedua adalah metode kladistik yaitu pembentukan

pohon filogeni dengan dihitung dengan pertimbangan adanya jalur evolusi yang

variatif. Pohon filogeninya disebut dengan cladogram.

Sekuens yang mirip diartikan sebagai sekuens yang memiliki kekerabatan

yang lebih dekat. Jarak sekuens dapat ditunjukkan dengan matriks jarak (distance

matrix) selanjutnya filogeni dilakukan kalkulasi algoritma untuk didapatkan

38

cluster. Metode filogeni dapat mengkonstruksi taxa paling jauh hingga taxa yang

paling dekat kekerabatannya. Manfaat dari pembentukan pohon filogeni salah

satunya adalah untuk menunjukkan UPGMA (Unweighted Pair Group using

Aritmathic Average).

C. Evaluasi hasil Seleksi dengan Marka Seleksi

Perkembangan kacang bogor di bidang molekular masih sedikit atau

jarang dilakukan, seperti yang dilakuan oleh Posquet et al., (1999) menggunakan

Isozim dan Amadou et al., (2001) menggunakan RAPD yang merupakan salah

contoh pengembagan penelitian kacang bogor di bidang molekular. Namun

demikian, Saleh (2012) menyebutkan bahwa hasil amplifikasi dengan

menggunakan RAPD dalam Amadou et al., (2001) menunjukkan polimorfisme

yang lebih tinggi jika dibandingkan amplifikasi dengan metode AFLP (Amplified

Fragment Length Polymorphisms) dalam Massawe et al., (2002) dan dengan

metode isozyme dalam Pasquet et al., (1999).

Molosiwa (2012) juga melakukan penelitian mengeai kacang bambara,

dalam penelitiannya menunjukkan bahwa persentase polimorfisme dengan

menggunakan teknik RAPD berkisar antara 57% hingga 100% dengan rata-rata

dari 7 primer 85%, sementara dengan mikrosatelit menunjukkan polimorfisme

antara 0% hingga 100% dengan rata-rata 29% polimorfis, hal ini menunjukkan

bahwa RAPD memiliki tingkat polimorfis tinggi dan banyak digunakan karena

lebih mudah.

Keunggulan RAPD dibandingkan dengan teknik yang lainnya seperti

misalkan teknik mikrosatelit seperti yang pernah diteliti oleh Mukakalisa (2010)

terletak pada persentase polimorfiknya. Mukakalisa menunjukkan bahwa dari 7

primer RAPD yang digunakan yaitu OPA07 100%, OPAI15 68%, OPB08 100%,

OPL12 75%, OPP04 57%, OPP15 100%, dan OPP19 100%, sehingga didapatkan

rata-rata persentase polimorfisme 85%. Mukakalisa juga menunjukkan dalam

penelitian yang sama menggunakan bahan kacang bogor menggunakan primer

mikrosatelit persentase polimorfik yaitu MARA001 0%, MARA020 0%,

MARA037 100%, MARA038 14%, MARA043 14%, MARA046 0%, MARA052

0%, dan MARA065 50%, sehingga rata-rata persentase polimorfisme 29%. Hasil

persentase polimorfisme dari dua teknik tersebut, RAPD dan mikrosatelit

39

menunjukkan bahwa polimorfisme yang paling besar ditunjukkan oleh teknik

RAPD sehingga teknik tersebut menurut pendapat Mukakalisa (2010) merupakan

teknik yang cocok untuk dijadikan sebagai marker untuk kacang bambara.

Berbeda dengan hasil persentase polimorfisme Mukakalisa (2010),

Rungnoi et al., (2012) menyatakan bahwa persentase polimorfisme dari 14 primer

RAPD adalah 70,1% lebih rendah dibandingkan dengan persentase polimorfisme

3 primer ISSR yaitu 72,37%, meskipun demikian, polimorfisme pada teknik

RAPD sangat ditentukan oleh kesesuaian antra nomer primer yang digunakan

dengan sampel, sehingga pada nomer primer yang tidak sesuai akan menunjukkan

polimorfisme yang lebih rendah. Sementara Amadou et al., (2001) dalam

penelitiannya tentang eksplorasi keragaman plasma nutfah kacang bogor

menggunakan teknik RAPD menunjukkan bahwa persentase polimorfisme dari 17

primer RAPD yang digunakan menunjukkan persentase 51% dan telah mampu

menghasilkan informasi mengenai keragaman beberapa aksesi kacang bogor yang

ditelitinya, sehingga RAPD dapat dijadikan sebagai teknik marker untuk kacang

bogor seperti yang dikemukakan oleh Mukakalisa (2010).

D. Penutup

a. Kesimpulan

Marka molekuler dapat digunakan sebagai salah satu metode untuk

mengetahui kekerabatan dalam spesies itu sendiri, selain itu hal ini untuk

memudahkan pengelompokan karena dimungkinkan selama identifikasi morfologi

terjadi bias karena adanya pengaruh lingkungan.

b. Rekomendasi

Marka molekuler dapat digunakan dalam identifikasi kedekatan secara

genetik dan dibandingkan dengan hasil pengamatan secara morfologi sehingga

dapat diketahui adanya perbedaan dan kemiripan antara sampel yang diteliti.

Daftar Pustaka

Ahmad, N.,S. 2012. Genetic Analysis Of Plant Morphology In Bambara Groundnut [Vigna Subterranea (L.) Verdc.]. Degree of Doctor of Philosophy University of Nottingham. UK

40

Amadou, H.I., P.J. Bebeli, and P.J. Kaltsikes. 2001. Genetic diversity in Bambara groundnut (Vigna subterranea L.) germplasm revealed by RAPD markers. Can. J. Agric. Sci. 44 (6): 995-999

Anonymous. 2013. Principles of PCR: Phylogenetics. Available at http://www.bioline.org.br/request?ej990!7-28/03/2010-10:26

Aryani, A., dan D. Kusumawaty. 2007. Prinsip-prinsip (Polymerase Chain Reaction) PCR dan Aplikasinya. Program Studi Biologi Jurusan Pendidikan Biologi UPI. Jakarta. Pp. 71-74

Kusumadewi, Y., Y.S. Poerba, T. Partomihardjo. 2010. Keragaman Genetika Ramin [Gonystylus bancanus (Miq.) Kurz] dari Provinsi Riau Berdasarkan Profil Random Amplified Polymorphic DNA. Indoensia. J. Agric. Sci. 6(2): 173-183

Kusumawaty, D. 2007. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Program Studi Biologi Jurusan Pendidikan Biologi UPI. Jakarta

Massawe, F.J., M. Dickinson, J.A. Roberts, S.N. Azam-Ali. 2002. Genetic Diversity in Bambara Groundnut Landrace (Vigna Subterranea (L.) Verdc.) Revealed by RALF Markers. Canada. J. Agric. Sci. 45:1175-1180

Molosiwa, O.O. 2012. Genetic Diversity And Population Structure Analysis Of Bambara Groundnut [Vigna Subterranea (L.) Verdc.] Landraces Using Morpho-Agronomic Characters And Ssr Markers. Ph.D. Thesis. Division Of Plant And Crop Sciences The University Of Nottingham Sutton Bonington Campus Loughborough, Leicestershire UK

Mukakalisa, C., 2010. Molecular, Environmental And Nutritional Evaluation Of Bambara Groundnut (Vigna Subterranea (L.) Verdc.) For Food Production In Namibia. Ph.D. Thesis. The University Of Namibia. Namibia

Pasquet. R.S., S. Schwedes., and P. Gepts. 1999. Isozyme Diversity in Bambara Groundnut. Crop. Sci. 39:1228-1236

Rungnoi, O., J. Suwanprasert, P. Somta and P. Srinives. 2012. Molecular Genetic Diversity Of Bambara Groundnut (Vigna subterranea L. Verdc.) Revealed By Rapd and Issr Marker Analysis. Sabrao. J. Breed. Genet. 44 (1) 87-101

Warta Biogen. 2008. Perkembangan Marka Molekuler untuk Seleksi Tanaman.

Warta Biogen 4(1): Pp1-4

Zulkifli. Y., N.B. Alitheen, R. Son, A.R. Raha, L. Samuel, S.K. Yeap and M. Nishibuchi. 2009. Random Amplified Polymorphic DNA-PCR and ERIC-PCR Analysis on Vibrio Parahaemolyticus Isolated From Cockles In Padang, Indonesia. J. Agric. Sci. 16: 141-150

41