BIOTEKNOLOGI MACAM-MACAM PANDANGAN BIOTEKNOLOGI

Wiseman: Principle of BiotechnologySmith, J.E.: Biotechnology PrincipleThorwald,E.: BiotechnologyBrown: Gene Clonning

PENDAHULUANBIOTEKNOLOGI : Kesepakatan para ahli diberikan untuk / sinonim dengan : REKAYASA GENETIKA (genetic enggineering).Tetapi lebih dari itu ada 3 pengertian tambahan :Isolasi dari makhluk hidup2. Ekstraksi Produk Metabolisme hasil manipulasi gen, misal esktraksi produk hormon3. Studi Biologi (biomolekuler) dan Biokimia pada sel hidup atau komponen sel atau keduanya dengan bantuan enzimREKAYASA GENETIKA :Usaha memilih gen khusus kemudian merekombinasikan sebagai DNA primer kemudian diinsersikan dan digandakan sebagai rekombinan DNA dalam sel (sel target)

BIOTEKNOLOGI (Definisi paling luwes)PENERAPAN PRINSIP-PRINSIP SAINS DAN REKAYASA TERHADAP PEMROSESAN BAHAN DENGAN MENGGUNAKAN AGEN BIOLOGIK UNTUK MENGHASILKAN BARANG DAN JASA

Bio(tekno)logi MolekulerPenerapan Ilmu mempelajari sifat, sifat, fungsi dan interaksi molekul-molekul yang ditemui pada organismeBiomolekul : Senyawa-senyawa kimia yang secara alami hanya ditemukan pada makhluk hidup.Komposisi Biomolekul suatu organisme akan menentukan suatu organisme Fungsi-fungsi kehidupan life functions pada dasarnya merupakan manifestasi interaksi biomolekul

BIOTEKNOLOGI MODERN Sama artinya dengan Manipulasi Gen = DNA RekombinanMenetapkan Peranan Gen Dalam SelDNA merupakan molekul utama kehidupanDNA pemberi kode untuk tumbuh dan berbiakDNA otak semua sel, dari DNA keluar perintah mengatur sifat dan jumlah jenis molekulDNA pembuka rahasia cetak biru genetik makhluk hidup DNA merupakan bahan genetik primer, terletak eksklusif pada kromosom sbg.histonDNA merupakan protein genetik,salah satu buktinya DNA pada virus

RUANG LINGKUP BIOTEKNOLOGI

Bioteknologi merpakan penerapan biosains dan teknologi penerapan organisme hidup atau komponen sub-selulernya pada industri jasa dan manufaktur serta pengelolaan lingkunganCakupan :Transformasi kimiaProduksi sel/biomassa

1. Transformasi kimia :a. Pembentukan produk akhir : enzim, antibiotik, asam organik, steroidb. Penguraian bahan baku : dekstruksi buangan industri, degradasi tumpahan minyak2. Produksi Sel/Biomassa :Produksi protein sel tunggal, produksi khamir makanan (Food yeasts).Reaksi-reaksi kimia proses bioteknologi, bersifatKatabolik : kompleks sederhanaAnabolik : sederhana kompleks

Keuntungan Proses BioteknologiCenderung lebih ekonomisPemakaian energi lebih sedikitLebih aman >< proses tradisionalResidu dapat terurai, hingga tak beracun5. Jangka panjang memberikan harapan pemecahan masalah utama dunia : pangan, polusi, obat2an, sumber enersi baru.

Sejarah Evolusi Bioteknologi

1. Proses Bioteknologi Tidak steril2. Proses Bioteknologi steril3. Bioteknologi Makanan Minuman Kuno (zaman Louis Pasteur)4 Bioteknologi Moderna. Rekombinan DNA/Rekayasa genetika b. Teknologi Enzim (amobilisasi enzim)c. Rekayasa Biokimia ( Bioreaktor dengan Komputerisasi )d. Rekayasa Sistem Produksi (Sensor baru)

REPLIKASI,TRANSKRIPSI,DAN TRANSLASIReplikasi : Proses pembelahan asam nukleat untai ganda manjadi untai tunggal.Proses pembelahan untai gandamenjadi tunggal yang identik melalui proses replikasi semi konservatifModel replikasi :bentuk O,bentuk Y, D-loop,DNA sirkul;er, sirkuler berulang,

Garpu ReplikasiGarpu replikasi (Replication fork)Melibatkan enzim-enzimTopoisomerase I (Gyrase)HelikaseSingle strand binding protein (SSBP)Primase DNA polimerase III partikel OkazakiDNA polimerase I lagging strandDNA ligase

Penjelasan1.Primase :Sintesis RNA primer2.DNA Pol III: Sintesis untaianDNA baru3. DNA Pol I : Memindahkan primer RNA4. Helikase: Menyusunbentukan heliks5. SSBP: Stabilisasi untaian tunggal6. DNA ligase: Menggabungkan yang masih terjadi gap7. Topoisomerase: mengurangi terjadinya supercoils (bentukan seperti spiral yang mengganggu)

PROSES REPLIKASI DNATahap Permulaan (Inisiasi)Tahap Pemanjangan (Elongasi, Polimeri sasi)Tahap penghentian (Terminasi)

1. Tahap INISIASI :Origin: Pemisahan dua untai DNAGelembung replikasi Garpu replikasiPenyediaan bahan dasar d-TTP,CTP,GTP,ATPPembentukan primer

. 2. Tahap Pemanjangan1. Arah pemanjangan rantai 5-32. Nukleotida tersusun mpk komplemenDNA template 3. Pasangan DNA, A dengan T, C dengan G4. Pasangan pada RNA A dengan UPemanjangan RNA primer,dengan kaidah :5. Primer RNA melekat di belakangnya.6. Replikasi berlangsung kedua arah

3.Penghentian (Terminasi)Pembuangan RNA primer pada potongan OkazakiMemanjangkan rantai DNA dengan ligase, melepas RNA primer Berhenti (stop)

TRANSKRIPSITranskripsi: Proses pembentukan RNA dari DNAAda 3 macam bentuk RNA :Messenger RNA (m-RNA)Transfer RNA (t-RNA)Ribosomal RNA (r-RNA)

Penjelasan m-RNA,t-RNA,r-RNAm-RNA: membawa sekuen pengkode a.a. dari suatu nukleotida atau lebih yang spesifik pada gen atau satu set gent-RNA: penghubung untuk membaca informasi pada m-RNA dan mentransfer ke sistem sintesis proteinR-RNA: molekul yang menyatukan diri dengan protein membentuk mesin sintesis protein. Molekul itu disebut ribosom

TRANSLASITranslasi: Penyusunan rantai polinukleotidaBerlangsung dalam ribosomUrutan a.a. disusun dengan bantuan t-RNASusunan mengacu urutan kodon m-RNAKodon pertama pada m-RNA di dekat ujung 5 berinteraksi dengan t-RNA yang telah membawa a.a. yang berada pada gugus terujung amino bebas molekul proteinDemikian seterusnya pemanjangan rantai polinukleotida

Gen, Ekspresi Gen, dan Mekanisme Kerja GenGen ??1865MendelTeori Gen1900de Vries dkk. mengujimenerimaTeori Mendel1902de Vries Teori mutasi1913Morgan Gen terdapat dlm kromosom1944Avery, Mc Leod, Mc Carty Gen = DNA1953Watson & Crick DNA heliks ganda GENENZIM1961Brenner dan JacobsDNAm-RNAProteinGen : POTONGAN URUTAN NUKLEOTIDA(BASA N) YANG MAMPU MENGKODA PEMBANTUKAN RNA PROTEIN

MEKANISME KERJA GENGARRORD (1909). Alkaptunoria (penyakit metabolik herediter, karena ketiadaan suatu enzim pemecah cincin benzena pada urineurin mengandung cincin benzena. GEN ENZIM ?BEADLE & TATUM (1942). Mutasi pada Neurospora crassa menyebabkan hilangnya enzim2 tertentu.GEN = ENZIM

LANJUTAN MEKANISME KERJA GENPAULING (1949) Sickle Cell Diseases. Adanya Hb abnormal GEN PROTEINBRENNER & JACOBS (1961) menemukan m-RNA dikukuhkan dogma sentral Gen (DNA) m-RNAProtein, penjabarannya :Urutan nukleotida DNA Urutan nukleotida RNA Urutan asam amino protein

UNSUR2 GENETIK PENGENDALI EKSPRESI GENGen-gen yang berperan dalam pengendalian ekspresi gen adalah :1. R = Represor, pengendali sistem enzim perangsang. Pada E. coli nampak adanya perangsang (inducers) timbul untuk membuat enzim -galaktosidase (bila ada laktosa sebagai sumber makanan). Adanya laktosa sangat meningkatkan kecepatan RNA polimerase mengkode gen penghasil enzim -galaktosidase

LANJUTAN UNSUR2 GENETIK PENGENDALI EKSPRESI GEN2.P = PROMOTOR. Tanda mulai (start) untuk mensintesis RNA, pada tempat ini RNA polimerase mengikat diri pada permulaan suatu operon 3. O = OPERATOR. Tempat kedudukan untuk melekatnya perangsang represor4. S = STRUKTURAL. Tempat kedudukan gen-gen untuk proses translasi (sesuai dengan kode-kode genetik yang menyusunnya)

MUTASIMutasi : Perubahan Genetik MenetapPercobaan in vitro membuktikan bahwa ada :Mutasi Titik (Point Mutation): Pengganti- an satu nukleotida dengan nukleotida lain.Delesi (Deletion):Penghapusan satu atau lebih nukleotidaInsersi (Insertion): Penambahan satu atau lebih nukleotidaUnequal Cross Over: Persilangan gen menjadi tidak seiring/sesuai dengan pasangan aslinya

PENJELASAN MUTASIMutasi Titik :Mutasi titik merupakan penggantian satu nuleotida dapat merubah satu asam amino (a.a.) pada protein atau tidakBila perubahan tsb. tidak merubah a.a., maka mutasi tsb. hanya dapat diketahui dengan menentukan urutan nukleotida pada DNA atau m-RNA disebut Mutasi tersembunyi (Silent Mutation) Contoh : UUG Leu UUA Leu

LANJUTAN PENJELASAN MUTASI TITIKBila penggantian nukleotida merubah asam amino :UUGleuUUGleuUUGleu UUCpheUCGserGUGvalada 3 macam akibat :Fungsi protein tak tergangguFungsi ptoein menurunProtein tak berfungsiTerminasi prematur, Contoh : CAAUAA stop

PENJELASAN DELESI dan INSERSI Delesi: Terhapusnya satu atau lebih nukleotida menyebabkan terjadinya pergeseran tanda baca.Protein menjadi tidak berfungsiTanda baca tak berubah bila delesi meliputi 3 nukleotida secara berurutanInsersi : Penambahan nukleotida juga menyebabkan pergeseran tanda baca Protein tak berfungsiTerminasi prematurUnequal Cross Over : Sudah jelas di pel. Genetika SLTA/SMU

KL0NING (1)Latar Belakang Pentingnya Kloning (DNA Rekombinan):- Belum jelasnya transkripsi dan translasi, dan kode genetik pada gen-genTuntutan: Sifat gen harus dapat diwariskanTuntutan: Mekanisme kerja gen harus dapat diramalkan hasilnyaTuntutan: Peningkatan kualitas dan uantitas pada dunia aplikasi

KLONING (2)Pengertian Kloning Gen :1 Fragmen DNA diinsersikan pada DNA sirkuler sebagai vektor sbg. Wahana,2 Vektor pembawa gen masuk ke dalam tuan rumah (host), biasanya baketri,3 Vektor berreplikasi4 Sel tuan rumah membelahreplikasi vektor selanjutnya5 Klon sel host yang identikklon mengandung 1 atau lebih mol DNA rekombinan

Langkah2 Dasar dlm Kloning GenMemotong GenMenyisipkan Gen pada VektorMenata Mol. DNA RekombinanMemasukkan ke dlm sel tuan rumahMultiplikasi Mol. DNA Rekombinan dlm. Sel tuan rumahPerbanyakan SelPengujian klon2 sel yang yang mengandung DNA rekombinan di media agar (padat)

Pengamatan dengan Elektroforesis

Southern Blotting

Agrobacterium

Wahana/Vektor/VehicleWahana: Pembawa gen masuk ke dlm. Sel tuan rumahHarus memiliki sifat:Mampu memasuki sel tuan rumahMengadakan replikasi utk. Menghasilkan kopi (bertanggung jawab atas hasil replikasinya)Ada 2 mol alamiah wahana :PlasmidKromosom virus/bakteriofaga

Ciri2 Dasar PlasmidCiri dasar plasmid :DNA sirkuler yang terdapat bebas dalam sel bakteriMembawa satu gen atau lebih yang mempunyai ciri-ciri pentingSemua plasmid memiliki paling sedikit satu urutan DNA yg. bertindak sbg. asal replikasiBerapa plasmid dpt. Mengadakan replikasi Contoh:* Kemampuan hidup bakteri dlm antibotik disebabkan permbawa gen resisten antibiotik

Kopi PlasmidFaktor yang berpengaruh thd. jumlah molekul plasmid dlm. bakteri blm. diketahui Jumlah kopi tiap plasmid khas 1-50Kopi plasmid bermampuan terhadap sifat resistensi thd. antibiotik Ukuran molekul kecil < 10 kilobasa (Molekul besar cenderung pecah waktu pemurnian & Lebih sulit dimanipulasi

Klasifikasi PlasmidAda 5 jenis utama:Plasmid fertilitas (F), hanya membawa gen tra, hanya melakukan transfer gen dgn. cara konjugasi. Contoh: Plasmid F. E.coli.Plasmid Resistensi (R), membawa gen penyebab resistensi bakteri. Contoh: RP4Plasmid Col.: Mengkode Kolisin.Contoh: Pada E.coli.Plasmid Degradatif. Memetabolisme mol. Yang tidak biasa. Contoh: Plasmid. Tol.Plasmid Virulensi. Penyebab patogenitas pada bakteri tuan rumah. Contoh: Plasmid Ti

Gambar-gambar Plasmid (1)

Gambar-gambar Plasmid(2)

Gambar-gambar Plasmid (3)

Mikroba mengandung plasmid (4)

Gambar Plasmid pBR322

Gambar Plasmid pUC18/19

Plasmid makhluk tk. rendah - tk.tinggi Pada Saccharomyces cerevisiae 2m circlePencarian plasmid pada eukariota (filamentosa, tanaman, hewan) selalu gagal, diperkiranakan pada organisme tingkat tinggi memang tidak punya plasmid.

BakteriofagaBakteriofaga: virus yang menginfeksi bakteriStruktur: Sederhana t.d. 1 mol. DNA (kadang-kadang RNA) membawa sejumlah gen, tubuhnya dikelilingi kapsid.

Microinjection

Melakukan Microinjection