NAMA : NURUL MUSDALIFAH APRILIANIM : 1413015024KELAS : S1 A 2014MATA KULIAH : BIOTEKNOLOGI FARMASI

Pengertian dan Perkembangan PCRPolymerase Chain Reaction (PCR) atau reaksi berantai polimerase adalah metode

enzimatis untuk melipatgandakan (amplification) secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu secara in vitro. Metode ini ditemukan oleh Kary B. Mullis pada tahun 1985, seorang saintis dari perusahaan CETUS Corporation. Metode PCR ini pada awalnya hanya digunakan untuk melipatgandakan molekul DNA, akan tetapi dalam perkembangannya dapat digunakan untuk melipatgandakan molekul mRNA. Metode PCR dapat melipatgandakan (amplification) suatu fragmen molekul DNA menjadi molekul DNA (110 bp/5x10-19) sebesar 200.000 kali setelah dilakukan 20 siklus reaksi selama 220 menit. Kelebihan dari metode PCR adalah DNA cetakan yang digunakan juga tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu sehingga metode PCR dapat digunakan untuk melipatgandakan suatu sekuen DNA dalam genom bakteri hanya dengan mencampurkan kultur bakteri di dalam tabung PCR.

Penggunaan PCR telah berkembang secara cepat seirama dengan perkembangan biologi molekuler. PCR digunakan untuk identifikasi penyakit genetik, infeksi oleh virus, diagnosis dini penyakit seperti AIDS, Genetic profiling in forensic, legal and bio-diversity applications, biologi evolusi, Site-directed mutagenesis of genes dan mRNA Quantitation di sel ataupun jaringan.

Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat digunakan untuk:1. amplifikasi urutan nukleotida.2. menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi.3. bidang kedokteran forensik.4. melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan “finger print”.

Adapun macam-macam tipe dan modifikasi dari PCR adalah sebagai berikut:1. Real-Time PCR

Real-Time PCR adalah suatu metode analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Real time ini juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction atau Q-PCR. Teknik ini dapat digunakan untuk mengamplifikasi(memperbanyak) sekaligus kuantifikasi (menghitung) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut. Pada analisa PCR konversional deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah dilakukan proses elektroforesis. Sedangkan analisa menggunakan Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung, keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi fluoresensi dari probe(penanda). Pada Real Time PCR pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforensis, sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose dan penggunaan Ethidium Bromide (EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik. Cara kerja dari Real Time mengikuti prinsip umum reaksi PCR, utamanya adalah DNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesudah setiap siklus amplifikasi selesai.

2. Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)Reverse Transcriptase-PCR juga sering dikenal sengan kinetic polymerase chain reaction.

RT-PCR merupakan modifikasi dari PCR, dimana metode ini digunakan untuk mengamplifikasi RNA, berbeda dengan PCR biasa yang mengamplifikasi DNA. Proses RT-PCR dibantu oleh enzim Reverse Transcriptase, karena hanya enzim jenis ini yang dapat mensintesis DNA dengan cetakan RNA, sedangkan polimerase DNA hanya dapat mensintesis dengan menggunakan cetakan DNA. RT-PCR penting digunakan sebagai alat diagnostik untuk mendeteksi dan menentukan serotipe virus, sebagai informasi untuk studi epidemiologi.

Kelebihan metode RT-PCR adalah memiliki sensitivitas yang tinggi dalam mengamplifikasi template RNA dan sangat spesifik saat menggunakan primer yang spesifik dalam sintesis cDNA. Meskipun demikian, teknik tersebut juga memiliki kelemahan yaitu hanya dapat digunakan untuk amplifikasi DNA, tidak untuk mempelajari fungsional protein

3. Nested PCRNested PCR adalah suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNA menggunakan

bantuan enzim DNA polimerase yang menggunakan dua pasang primer untuk mengamplifikasi fragmen. Dengan menggunakan nested PCR, jika ada fragmen yang salah diamplifikasi maka kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya oleh primer yang kedua. Dengan demikian, nested PCR adalah PCR yang sangat spesifik dalam melakukan amplifikasi. Waktu yang diperlukan dalam reaksi nested PCR lebih lama daripada PCR biasa karena pada nested PCR dilakukan 2 kali reaksi PCR, sedangkan pada PCR biasa hanya 1 kali reaksi PCR. Selain itu, keuntungan nested PCR adalah meminimalkan kesalahan amplifikasi gen dengan menggunakan 2 pasang primer.

4. Multiplex PCRMultiplex PCR merupakan beberapa set primer dalam campuran PCR tunggal untuk

menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang spesifik untuk sekuens DNA yang berbeda. Dengan penargetan gen sekaligus, informasi tambahan dapat diperoleh dari lari-tes tunggal yang tidak akan membutuhkan beberapa kali reagen dan lebih banyak waktu untuk melakukan. temperatur Annealing untuk masing-masing set primer harus dioptimalkan untuk bekerja dengan benar dalam reaksi tunggal, dan ukuran amplikon. Artinya, panjangnya pasangan basa harus berbeda cukup untuk membentuk band yang berbeda ketika divisualisasikan dengan elektroforesis gel .

5. PCR-ELISAPCR-ELISA merupakan metode yang digunakan untuk menangkap asam nukleat yang

meniru prinsip dari enzim linked immunosorbant yang terkait. Dimana dalam sebuah pengujian hibridisasi hasil produk dari PCR akan terdeteksi dengan metode ini. Dengan metode inilah dapat dilakukan pengukuran sequen internal pada produk PCR. Metode ini lebih dipilih karena lebih murah dibandingkan metode Real Time PCR. PCR-ELISA telah digunakan sejak akhir 1980-an dan telah berkembang untuk mendeteksi sequen tertentu dalam produk PCR. Meskipun banyak metode yang tersedia untuk mendeteksi sequen tersebut, ELISA PCR berguna untuk mendeteksi dan membedakan antara beberapa sasaran dari sequen yang diinginkan. ELISA PCR ini juga berguna untuk screening beberapa sampel, terutama bila jumlah sampel tidak menjamin. Salah satu aspek yang paling berguna dari PCR-ELISA adalah kemampuannya dalam membedakan antara produk reaksi perubahan polimerase yang dihasilkan dari seperangkat primer yang mengandung variasi sequen, yaitu sequen yang bervariasi antar primer .