Produksi Berlebih Asam Klavulanat dengan Mutagenesis UVStreptomyces clavuligerus

BAB IPENDAHULUAN

I. ABSTRAKAsam klavulanat diproduksi industri melalui fermentasi Streptomyces

clavuligerus dan penelitian telah meningkatkan produksi dengan peningkatan strain, teknologi DNA rekombinan, dan komposisi media dan optimasi kondisi pertumbuhan. Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk meningkatkan tingkat produksi asam klavulanat dari Streptomyces clavuligerus (DSM 738), menggunakan iradiasi UV. Setelah inkubasi, spora dan miselia udara itu dikerok dari piring agar-agar dengan loop steril. Setelah melewati sebuah kapas, suspensi spora serial diencerkan, tersebar di GYM-agar yang mengandung kafein. Pelat diiradiasi dengan sinar UV, dibungkus aluminium foil dan diinkubasi. Koloni disubkulturkan lagi untuk mengungkapkan mutasi. Sebuah alikuot dari suspensi spora disiapkan dari kultur yang dihasilkan. dituangkan dalam pelat agar-agar GYM dan diinkubasi . Pelat yang dilapis dengan nutrisi-agar yang mengandung penisilin G dan pneumoniae Klebsiela, dan diinkubasi. Diameter zona hambat diukur dan dibandingkan dengan koloni wild type. prosedur ini diulang, dipilih mutan overproducer . Konsentrasi asam klavulanat ditentukan dengan analisis HPLC. Disimpulkan bahwa metabolit sekunder, terutama antibiotik yang mengandung asam klavulanat, diproduksi sekitar 6-7 hari setelah pertumbuhan, dan konsentrasi asam klavulanat ditingkatkan menjadi dua kali lipat setelah mutagenesis UV.

Kata kunci: Streptomyces clavuligerus; clavulanic asam, mutagenesis UV, overproduksi, fermentasi, radiasi UV.

II. LATAR BELAKANGStreptomyces clavuligerus adalah sebuah actinomyces, yang memproduksi lebih dari 21 bioaktif metabolit sekunder. Antara lain, metabolit dengan β-laktam cincin seperti cephamycyn C, penisilin N dan cephalosponins dengan efek antibakteri, dan asam klavulanat, sebuah inhibitor β-laktamase. Asam klavulanat adalah β-laktam dengan efek antibakteri lemah dan kuat. β-laktamase inhibisi (4-6). Augmentin®, merek dagang, berisi kombinasi amoksisilin dan kalium klavulanat, adalah salah satu penjualan terbaik antibiotik. Asam klavulanat diproduksi secara industrialisasi melalui fermentasi Streptomyces clavuligerus dan penelitian telah meningkatkan konsentrasnya (sampai ≈ 1,4 g L) dengan perbaikan strain, teknologi DNA rekombinan, dan media komposisi dan optimasi kondisi pertumbuhan.

Iradiasi UV adalah salah satu strategi peningkatan regangan melalui mutasi acak. Radiasi UV dalam kisaran 200-300 nm, menghasilkan timidin dimmer dan meningkatkan kemungkinan penghapusan selama proses duplikasi (25, 26). UV adalah mutagen yang relatif aman, namun sangat sedikit peneliti yang menggunakan teknik ini untuk memproduksi asam klavulanik secara berlebih.

III. TUJUANTujuan utama dari penelitian ini adalah untuk meningkatkan tingkat produksi

asam klavulanat oleh S. clavuligerus dengan iradiasi UV.

BAB IIPEMBAHASAN

I. Metode Penelitian 1. Mikroorganisme dan Pengkulturan

Streptomyces clavuligerus (DSM 738) adalah revitalisasi pada GYM-kaldu dan dipelihara pada agar GYM. Sodium chloride solution (0.9%) Natrium klorida larutan (0,9%) mengandung tween-80 (0,2%) dituangkan ke Agar GYM-menengah, di mana S. clavuligerus ditumbuhkan selama 7 hari pada 28 ° C. Dan spora miselia udara itu dikerok dari permukaan agar-agar menggunakan loop steril. Setelah penyaringan melalui kapas wol, suspensi spora adalah serial diencerkan sampai 10 CFU mL dan 1 mL suspensi ini dituangkan dan disebar ke setiap piring kaca steril yang mengandung GYM-Agar dan kafein (0,5 gL).

2. UV IradiasiPelat diiradiasi dengan sinar UV (200-300nm, 1.7Wm) selama 20 menit

sepanjang 8 cm. Setelah iradiasi, dalam rangka melindungi photoreactivation, pelat dibungkus dengan aluminium foil dan diinkubasi selama 7 hari. Akhirnya, koloni sub-kultur (7 hari, 28 ° C) lagi untuk mengekspresikan dan menstabilkan mutan.

3. BioassaySebuah metode bioassay diubah secara radikal, berdasarkan pada metode yang

dikembangkan oleh Lee et al, adalah menggunakan l dari suspensi spora (102 CFU mL), dibuat dari kultur yang dihasilkan, dituang ke dalam masing-masing 3 sumur (dari 4 sumur) di agar pelat GYM. Sebuah suspensi spora (102 CFU mL) dari jenis mikroorganisme liar yang telah dituangkan ke dalam 4 sumur yang baik. Setelah inkubasi, sebuah inkubasi selama jangka waktu 6 hari pada 28°C, piring itu dilapisi dengan agar-agar yang mengandung penisilin G (7 g mL) dan Klebsiela pneumoniae (105 CFU mL), dan terakhir diinkubasi lagi selama 24 jam pada suhu 37°C. Diameter zona hambat diukur dan dibandingkan dengan koloni mikroorganisme wild.

4. Produksi asam klavulanatpH dari medium biji (20 mL) yang terdiri pepton (1%), malt (1%) dan gliserol

(2%) yang disesuaikan menjadi 7,0 ± 0,1. Media diinokulasi dan diinkubasi pada suhu 28°C selama 24 jam dengan kecepatan 220 rpm dalam botol 100 mL gemetar. Media produksi (50 mL) mengandung ekstrak (3%), garam gliserol (0.5%), tepung kedelai (0,5%), FeSO4 (0,0001%), dan MnSO4 (0.0001%) yang telah diinokulasi (5%) dengan benih kultur dan diinkubasi (28°C, 220 rpm) dalam botol 250 mL gemetar.

5. Analisis HPLCAsam klavulanat dihitung dengan HPLC, menggunakan kolom fase terbalik (C-

18). Fase gerak yang mengandung K2HPO4 (50 mM; 70% ; 0,348 mL menit) dan metanol (30%; 0,157 mL min) dan pH diatur menjadi 3,2. Sampel yang diderivatisasi menggunakan imidazol. Turunan dideteksi pada 311 nm.

6. Analisis statistikAnalisis statistik yang dilakukan melalui uji-Whitney non Mann, menggunakan Paket statistik SPSS untuk versi Windows 13.0 (SPSS Inc, Illinois)

II. HASILSelama subkultur S. Clavuligerus Produksi berlebih asam klavulanat dengan

mutagenesis UV Streptomyces clavuligerus pada agar GYM untuk sporulasi, diamati

dengan menggunakan media agar-agar yang lebih padat dengan ketebalan 8 mm maka pelat koloni muncul dengan pigmen lebih abu-abu.

Tetesan kuning pucat disekresikan 6-7 hari setelah pertumbuhan, yang menghilang setelah meninggalkan lubang pada permukaan S. clavuligerus koloni untuk jangka waktu 24 jam Prosedur ini belum dijelaskan sebelumnya.Tampaknya lapisan tebal dari agar-agar di pelat, menghasilkan populasi yang lebih besar dari mikroorganisme, dan dapat menyebabkan produksi metabolit sekunder lebih tinggi dan lebih cepat, kemungkinan hasil percobaan tersebut mengandung antibiotik dan asam klavulanat. Setelah beberapa saat, tetesan tersebut kemudian

disebarkan di piring. 1. Pengembangan uji hayati untuk asam klavulanat

Untuk produksi kelebihan mutan, yang lebih murah, cepat dan cukup handal yang menggunakan metode bioassay dengan mempertimbangkan S. clavuligerus sebagai produsen asam klavulanat dan K. pneumonia sebagai mikroorganisme sensitif. Metode tersebut dilakukan sekitar 4 hari setelah pertumbuhan S. Clavuligerus. tidak hanya zona hambat K. Pneumonia yang tidak teramati, tetapi juga zona signifikan berlebih. Namun, ketika pengujian ini dilakukan setelah 6 hari, zona hambatan jelas teramati (Gambar 1).

Mungkin diartikan bahwa beberapa metabolit primer merangsang pertumbuhan yang disekresikan oleh koloni S. Clavuligerus selama 4 hari, yang dapat menyebabkan pertumbuhan yang lebih cepat dari K. pneumonia. Di sisi lain, setelah 6 hari, metabolit sekunder (misalnya asam klavulanat), menghambat pertumbuhan, mungkin telah diproduksi.

2. Penyaringan produksi berlebih mutan Metode bioassay telah digunakan untuk media produsen kelebihan mutan.

Empat belas dari 105 mutan menunjukkan zonahambat kontrol lebih dari wild type, dengan nilai mutan yang paling tinggi yaitu M60, M23 dan M61 (Gambar 2).

Berdasarkan uji statistik Mann-Whitney , perbedaan antara kelompok tersebut ditemukan nilai signifikan (P <0,001)

3. Penentuan asam klavulanat secara HPLC Penggunaan metode bioassay tidak membuktikan produksi asam klavulanat

dari mutan saringan. Oleh karena itu, kami perlu mengkonfirmasi hal ini dan menentukan konsentrasi asam klavulanat. Produksi berlebih asam klavulanat oleh mutan saringan telah diverifikasi oleh HPLC (Gambar 3 dan 4). Hasil dari variasi Intra-day dan inter-day dalam presisi (CV%) dan akurasi (Error%) dapat diterima.

Membandingkan konsentrasi yang dihasilkan asam klavulanat dengan biomasa yang terkait mutan, konsentrasi asam klavulanat yang ditemukan berbeda diantara berbagai mutan. Namun, tidak ada perbedaan yang cukup besar pada konsentrasi biomassa (Gambar 4). Ini mungkin diartikan bahwa kelebihan asam klavulanat diikuti hasil mutasi yang tidak terlalu cepat. Hal ini bisa disebabkan karenaperubahan jalur metabolik dari mikroorganisme, menghasilkan produksi berlebih asam klavulanat.

Ada suatu analogi antara metode bioassay dan metode HPLC (Gambar. 5), kecuali dalam beberapa kasus, mungkin karena faktor pembatas produksi berlebih pertumbuhan lainnya. Produktivitas dari mutan yang dipilih juga dihitung (Tabel 1).

III. DISKUSIProduksi asam klavulanat berhasil ditingkatkan 1,8 kali dengan mutagenesis

UV.Tampaknya bahwa mutasi terjadi pada gen yang terlibat dalam jalur metabolic produksi asam klavulanat, tetapi tidak bertanggung jawab pada pertumbuhan metabolit primer. Mutan ini dapat digunakan secara industri untuk produksi asam klavulanat.

Sekelompok penelitian meningkatkan produksi asam clavulanic sampai dengan 8 kali dengan mutagenesis UV dan optimasi menengah. Kami meningkat kan itu menjadi

1,8 kali dengan menggunakan mutagenesis acak, yang dapat dilanjutkan mengingat fakta bahwa"Mutasi adalah sebuah peristiwa kebetulan". Di lain penilitian, kita juga memasukkan gen claR dalam E. coli XLI biru, menggunakan PZSclaR plasmid, sebagai vektor untuk meningkatkan produksi asam klavulanat. Di masa depan kita akan menggabungkan metode ini, dan dengan menggunakan optimasi medium, diharapkan untuk meningkatkan produktivitas.

IV. Referensi

1. Muth G, Brolle DF and Wohlleben W. Genetics of Streptomyces. In: Demain AL and Davais J. (eds.) Manual of Industrial Microbiology and Bacteriology. ASM Press, Washington DC (1998) 353-67.

2. Williams ST, Goodfellow M and Alderson G. Genus Streptomyces. In: Williams ST, Sharpe ME and Holt JG. (eds.) Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. 4th ed. Springer, New York (1998) 2452-92.

3. Gouveia ER, Baptista-Neto A, Badino AC and Hokka CO. Optimization of medium composition for clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus. Bacteriol. Lett. (2001) 23: 157-61.

4. Liras P and Rodryiguez-Garcyia A. Clavulanic acid, a beta lactamase inhibitor: biosynthesis and molecular genetics. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2000) 54: 467-75.

5. Tahlan K, Anders C and Jensen SE. The paralogous pairs of genes involved in clavulanic acid and clavam metabolite biosynthesis are differently regulated in. Dan lain-lain

This article is available online at http://www.ijpr-online.com