44

ACARA IVAMPLIFIKASI DNA MENGGUNAKAN PCR

A. Pendahuluan1. Latar BelakangKeragaman genetik tanaman merupakan salah satu kegiatan penting untuk mendukung pemuliaan tanaman. Perbedaan tanaman dapat dideteksi melalui beberapa penanda, antara lain dengan pola pita DNA, yang sering disebut sebagai penanda molekuler. Penanda molekuler berperan penting dalam konservasi dan pengelolaan sumber daya genetik tanaman. Salah satu cara untuk mendapatkan untaian pita DNA adalah dengan metode PCR. Reaksi berantai polimerase atau Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu metode enzimatis untuk mengamplifikasi secara eksponensial suatu urutan nukleotida tertentu secara in vitro. Proses PCR untuk mengamplifikasi DNA membutuhkan DNA cetakan yang mengandung urutan DNA target yang akan diamplifikasi, sepasang primer, enzim DNA polimerase, buffer, dan campuran monomer nukleosida trifosfat (dNTP). PCR melibatkan serangkaian siklus suhu yang berulang dan masing-masing siklus terdiri atas 3 tahapan : denaturasi pada suhu 94-960C, penempelan primer pada suhu 45-600C (annealing) dan perpanjangan primer pada suhu 72oC (Ratnayani K 2009).Pada praktikum kali ini prosedur amplifikasi dijelaskan melalui video dan tayangan slide dikarenakan fasilitas yang masih kurang lengkap. Tujuan dari praktikum kali ini adalah untuk mengetahui proses amplifikasi dengan menggunakan PCR. Diharapkan mahasiswa mampu memahami dan melakukan prosedur dalam proses amplifikasi DNA dengan menggunakan PCR, dan tertarik untuk melakukan penelitian lebih lanjut dalam bidang ini. 2. Tujuan PraktikumTujuan pada praktikum amplifikasi DNA menggunakan PCR adalah untuk mengetahui prosedur amplifikasi DNA menggunakan PCR.

373. Waktu dan Tempat PraktikumPraktikum acara amplifikasi DNA dengan PCR dilaksanakan pada tanggal 20 Maret 2014 betempat di laboratorium Fisiologi Tumbuhan dan Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sebelas maret Surakarta.B. Tinjauan PustakaReaksi berantai polimerase atau Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu metode enzimatis untuk mengamplifikasi secara eksponensial suatu urutan nukleotida tertentu secara in vitro. Proses PCR untuk mengamplifikasi DNA membutuhkan DNA cetakan yang mengandung urutan DNA target yang akan diamplifikasi, sepasang primer, enzim DNA polimerase, buffer, dan campuranmonomer nukleosida trifosfat (dNTP). PCR melibatkan serangkaian siklus suhu yang berulang dan masing-masing siklus terdiri atas 3 tahapan : denaturasi pada suhu 94-960C, penempelan primer pada suhu 45-600C (annealing) dan perpanjangan primer pada suhu 720C. Metode ini sekarang telah banyak diaplikasikan dalam bidang riset yang menunjang ilmu dasar dan untuk aplikasi di bidang kriminologi, antropologi, dan kedokteran karena metode PCR sangat sensitif dan dapat mengamplifikasi segmen DNA hanya dengan menggunakan sejumlah kecil sampel biologis (Ratnayani 2009).Suhu penempelan primer merupakan peubah kunci dalam menentukan kekhasan reaksi PCR. Penggunaan suhu penempelan primer yang sesuai, memungkinkan masingmasing primer dapat menempel pada kedua ujung DNA cetakan. Suhu penempelan primer dapat dihitung berdasarkan urutan nukleotida primer yang digunakan. Umumnya suhu penempelan primer optimum berkisar 50C dari suhu perhitungan penempelan primer. Jika suhu penempelan primer terlalu tinggi dari suhu optimum, menyebabkan primer tidak menempel dengan DNA cetakan. Sedangkan, jika suhu penempelan primer terlalu rendah dari suhu penempelan primer optimum menyebabkan mispriming, yaitu penempelan primer pada tempat yang salah pada DNA cetakan sehingga dihasilkan produk non spesifik. Oleh karena itu dilakukan optimasi terhadap suhu penempelan primer (Yuwono 2006).Proses amplifikasi melalui PCR dimulai dari denaturasi, yaitu pada tahap ini molekul DNA dipanaskan sampai suhu 94oC yang mnyebabkan terjadinya pemisahan untai ganda DNA menjadi untai DNA tunggal. Untai DNA tunggal inilah yang menjadi cetakan bagi untai DNA baru yang akan dibuat. Proses selanjutnya adalah annealing (penempelan) yaitu Enzim Taq polimerase dapat memulai pembentukan suatu untai DNA baru jika ada seuntai DNA berukuran pendek (DNA yang mempunyai panjang sekitar 10 sampai 30 pasang basa) yang menempel pada untai DNA target yang telah terpisah. DNA yang pendek ini disebut primer. Agar suatu primer dapat menempel dengan tepat pada target, diperlukan suhu yang rendah sekitar 55 0C selama 30-60 detik. Proses terakhir adalah elongation (pemanjangan) yaitu enzim DNA polymerase akan memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru dari gabungan antara primer, DNA cetakan dan nukleotida (Kusuma 2010).Macam macam metode PCR adalah Real-Time PCR adalah suatu metode analisa yang dikembangkandari reaksi PCR. Real time ini juga dikenal sebagai quantitative real timepolymerasechainreactionatauQ-PCR, dimana teknik ini digunakanuntuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung(kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut. Reverse Transcriptase-PCR juga sering dikenal dengan kineticpolymerase chain reaction. RT-PCR merupakan modifikasi dari PCR,dimana yang diamplifikasi berupa m-RNA. Pada metode PCR biasasumber sampel yang digunakan adalah DNA yang diekstrak dari sel ataujaringan.PadaRT-PCRsampel yang digunakan bukan DNA melainkan RNA. Sebagaimana kita ketahui, RNAmerupakan asam ribonukleat rantaitunggal, sedangkan DNA adalah asam ribonuleat rantai ganda. Nested PCRadalah suatu teknik perbanyakan (replikasi)sampel DNAmenggunakan bantuan enzim DNA polymerase yang menggunakan dua pasang primer untuk mengamplifikasi fragmen. Multiplex PCR merupakan beberapa set primer dalam campuran PCR tunggal untuk menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yangspesifik untuk sekuens DNA yang berbeda. PCR-ELISA merupakan metode yang digunakan untukmenangkapasam nukleat yang meniru prinsip dari enzim linked immunosorbant yang terkait, dimana dalam sebuah pengujian hibridisasi hasil produk dari PCR akan terdeteksi dengan metode ini (Shanda 2012).DNA Primer adalah suatu oligonukleotida yang memiliki 10 sampai 40 pb (pb = pasangan basa) dan merupakan komplementer dari DNA target. Pemilihan primer yang tidak sesuai dapat menyebabkan tidak terjadinya reaksi polimerasi antara gen target dengan primer. Berikut adalah kriteria pemilihan primer, yaitu panjang primer : 15-30 pb, kandungan GC sekitar 50%, temperatur penempelan kedua primer tidak jauh berbeda, urutan nukleotida yang sama harus dihindari, tidak boleh terjadi self dimmer, pair dimmer, atau hairpin (Jawets 2006).C. Alat, Bahan, dan Cara Kerja1. Alata. Mikrotubeb. Mikropipetc. PCR2. Bahana. Taq DNA polymeraseb. MgCl2c. DNA cetakand. DNTPS3. Cara Kerjaa. Mencampur komponen buffer PCR, stok d NTP, Primer 1, Primer 2 masing-masing 5l, dan Taq DNA polymerase 2,5 l secara berurutan dan ditambah air hingga mencapai volume total 50l.b. Menambahkan 50l lisat sel dan mencampurkan sampai homogen, kemudian ditambah 50l minyak paraffin ke atas campuran PCR.c. Melakukan amplifikasi secara manual atau dengan menggunakan thermlcycler otomatis yaitu dengan menginkubasikan pada suhu 95oC selama 1 menit, suhu 55oC selama 1 menit, dan suhu 72oC selama 1 menit.d. Mengulangi langkah 3a-3c sampai 35 siklus.e. Setelah siklus 35, menginikubasi tabung pada suhu 72oC selama 5 menit.f. Mengambil 2l sampel DNA hasil amplifikasi kemudian melakukan elektroforesis pada gel agarose untuk mengetahui hasilnya.

D. Hasil dan Pembahasan1. Hasil

PCR MixPrimer mixDNA templateAquadest

PCR Mix1. Menyiapkan 4 bahan utama yang disebut PCR primer yang terdiri dari taq DNA polymerase, Mgcl2, DNTPS dan buffer ekstruksi sebanyak 10 l yang dimasukkan ke dalam microtube

10 l

7 l Aquadest2. Menambahakan aquades 7 l Cold H2O CH clumer

Primer

DNA template3. Menambahkan primer sesuai yang diinginkan sebesar 1 l

4. Memasukkan microtube ke dalam PCR di dalam PCR akan terjadi 3 proses yaitu denaturasi annealing dan extension.

5. Hasil Amplifikasi DNA diperoleh

2. PembahasanPCR merupakan salah satu metode yang digunakan untuk amplifikasi DNA. Yaitu menggandakan pita DNA secara eksponensial pada suhu tertentu. PCR melalui 3 tahapan seperti yang dijelaskan oleh Ratnayani (2009) denaturasi pada suhu 94-960C, penempelan primer pada suhu 45-600C (annealing) dan perpanjangan primer pada suhu 720C. Proses amplifikasi DNA yaitu dimulai dari proses denaturasi pada suhu tinggi (94-96oC), dimana rangkaian DNA double helix menjadi rantai tunggal, rantai ini berfungsi sebagai cetakan. Proses yang kedua yaitu annealing (penempelan) pada suhu yang agak rendah daripada proses denaturasi (45-600C), dimana DNA cetakan menempel pada DNA tunggal yang telah memisah pada proses sebelumnya. Proses yang terakhir yaitu elongasi (pemanjangan) pada suhu yang lebih tinggi daripada proses penempelan (720C), dimana cetakan DNA yang telah menempel pada DNA primer akan diperpanjang sesuai cetakan DNA yang telah ada. Proses tersebut dilakukan berulang-ulang hingga mencapai panjang DNA yang diinginkan. Bahan yang digunakan yaitu taq DNA Polimerase, MgCl2, DNTPS, buffer retruksi, dan DNA template. Menurut Kusuma (2010) bahan-bahan tersebut memiliki fungsi yang spesifik pada proses amplifikasi DNA menggunakan PCR. Taq DNA polymerase merupakan enzim yang stabil dalam pemanasan dan umumnya digunakan enzim Taq DNA polimerase (Taq = Thermus aquaticus). Enzim ini tetap stabil mengamplifikasi DNA walaupun amplifikasi berjalan pada suhu mendekati titik didih air. Buffer atau dapar yang digunakan umumnya mengandung MgCl2 yang mempengaruhi stabilitas dan kerja enzim polimerase. dNTPS atau deoxynukleotide Triphosphates merupakan suatu nukleotida bebas yang berperan dalam perpanjangan primer melalui pembentukkan pasangan basa dengan nukleotida dari DNA target. DNA template adalah DNA yang digunakan sebagai cetakan.Faktor yang mempengaruhi saat proses PCR antara lain menurut Agitya (2008) adalah konsentrasi DNA sebesar 0,01-0,1 g setiap l larutan template sudah cukup baik untuk PCR namun yang paling penting adalah DNA harus bebas dari pengotor seperti protein atau bahan-bahan yang tersisa saat purifikasi seperti fenol atau alkohol. Purifikasi dapat dilakukan dengan menggunakan GFX DNA Column. Ukuran dan komposisi primer sangat mempengaruhi temperatur penempelan primer terhadap untaian DNA target. Umumnya primer sebesar 17-30 basa nukleotida dengan komposisi GC lebih dari 50%.Konsentrasi MgCl2 sangat mempengaruhi aktivitas serta kekhususan kerja enzim, penguatan primer mencapai suhu optimumnya (primer annealing) dan penguatan fungsi primer dalam sintesis pemanjangan rantai nukleotida. Konsentrasi optimumnya 1,5-4,0 mM. Namun, apabila preparasi DNA banyak menggunakan EDTA untuk pengawetnya maka MgCl2 akan lebih tinggi dari keadaan normal. Konsentrasi Enzim Polimerase yang digunakan sangat tergantung dari jenis enzim. Pada umumnya konsentrasi optimum berkisar antara 1,0-2,5 unit enzim setiap volume reaksi 50 l. Sebaiknya pemakaian enzim tidak melebihi 2,5 unit karena malah justru akan menurunkan spesifitasnya. Kualitas primer sangat tergantung pada kualitas oligoprimer dan OD (optical density). Namun demikian, konsentrasi primer sekitar 20 pmol sudah cukup memadai untuk amplifikasi PCR. .Jumlah Siklus PCR terkait dengan konsentrasi awal DNA target dan konsentrasi akhir yang diharapkan. Siklus yang terlalu banyak justru akan meningkatkan konsentrasi produk yang tidak spesifik, sedangkan siklus yang terlalu sedikit akan mengurangi kuantitas produk yang diharapkan. Deoksinukleotida triphosphate (dNTP). Konsentrasi dNTP mix yang menghasilkan keseimbangan optimal terdiri atas dATP, dCTP, dGTP, dTTP sebesar 10-20 M.

E. Kesimpulan dan Saran1. KesimpulanKesimpulan dari praktikum amplifikasi DNA menggunakan PCR adalah prosedur amplifikasi DNA menggunakan PCR melalui 3 tahap pemisahan, penempelan, dan pemanjangan. 2. SaranSaran untuk praktikum selanjutnya mahasiswa akan lebih paham prosedur amplifikasi DNA menggunakan PCR dengan praktikum secara langsung.

DAFTAR PUSTAKA

Agitya 2008. Faktor yang menentukan keberhasilan pcr. http://bioinside.blogspot.com/2008/09/faktor-yang-menentukan-keberhasilan-pcr.htmlArdiana D W 2009. Teknik Isolasi DNA Genom Tanaman Pepaya dan Jeruk dengan Menggunakan Modifikasi Bufer CTAB. Buletin Teknik Pertanian 14 (1) : 12-16)Jawetz E., J. L. Melnick dan E. A. Adelberg, 2006, Mikrobiologi Kedokteran, Edisi 20, Penerbit Buku Kedokteran, EGC, Jakarta, h. 211-217, 249-251Kusuma S A F 2010. PCR. Makalah. Universitas Padjajaran Fakultas Farmasi.Mitokondria dan Kedokteran Forensik,dalam Mithocondrial Medicine, Lembaga Biologi molekuler Eijkman, Jakarta, p. 53-56Ratnayani K, Sagung C Y, dan Liangky S S 2009. Amplifikasi Fragmen 0,4 KB Daerah D-Loop DNA Mitokondria Lima Individu Suku Bali Tanpa Hubungan Kekerabatan dengan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR). J. Kimia 3 (1) : 14-20Santoso, P.J. 2010. Modified CTAB-based DNA isolation procedure for fruit crops. Jurnal Stigma XIV(1): 1-4.Shanda Farras 2012. Teknik Isolasi Molekuler. Universitas Brawijaya. Fakultas Kedokteran. Suryadi, H., Malik, S. G., Gustiananda, M., Sudoyo, H., 2003, Polimorfisme DNAYuwono, T., 2006, Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction, Penerbit Andi, Yogyakarta, p. 1-3; 18-21