PEMBAHASAN

Pada elektroforesis vertical ini digunakan metode SDS PAGE dengan gel berbahan dasar polikrilamida karena sampel yang digunakan adalah sampel protein. Pemilihan komposisi stacking gel dan separating gel didasarkan pada berat molekul protein yang akan di – running, bila sampel protein yang akan di running belum diketahui berat molekulnya, maka digunakan gel dengan komposisi 12,5% terlebih dahulu, jika kemudian saat running terjadi loss protein, maka komposisi gel dinaikkan menjadi 25% dan seterusnya.            Komposisi gel berpengaruh terhadap hasil running sampel protein. Gel berperan sebagai pori atau saringan yang akan menyaring protein berdasarkan ukuran molekul. Protein dengan berat molekul kecil akan turun terlebih dahulu dengan cepat menuju ke dasar gel dan protein dengan berat molekul besar akan tertahan di gel bagian atas. Jika komposisi gel yang digunakan tidak sesuai, jika komposisi gel terlalu kecil maka pori dari gel menjadi longgar sehingga protein dengan berat molekul kecil akan terus turun, sedangkan jika komposisi gel terlalu besar maka pori dari gel menjadi rapat sehingg protein dengan berat molekul besar akan tertahan di atas.            Penggunaan RSB sebagai tracking dye berfungsi untuk menandai protein yang tersangkut di pori gel sebagai band. Pemanasan protein dilakukan sebelum pemberian RSB dengan tujuan untuk melepaskan ikatan protein yang rumit menjadi sebuah ikatan sederhana yang akan lebih mudah untuk dilakukan proses running elektroforesis. Pemanasan dilakukan selama 5 menit di air mendidih dan tidak lebih dari 7 menit karena akan menyebabkan denaturasi protein.            Aliran listrik yang digunakan sebesar 90 – 120 V berfungsi untuk memberi muatan pada protein untuk bergerak melewati pori gel dan bergerak dari atas ke bawah gel sesuai dengan berat molekul sampel protein tersebut. Protein dengan berat molekul kecil akan bergerak terlebih dahulu dengan cepat melewati pori sampai batas di mana pori tidak cukup besar untuk melewati pori gel. Batas tersebut lah yang terlihat sebagai band pada gel. Aliran muatan listrik mengalir ke protein lewat running buffer yang diisikan pada kit elektroforesis yang berisi gel yang di running. Setelah itu dilakukan staining dengan menggunakan Coomasie Brilliant Blue dalam waterbath agar band yang timbul tampak jelas. Setelah itu dilakukan destaining agar band dapat diamati.            Berat molekul protein diidentifikasi dengan menentukan kurva baku dari marker protein dengan menggunakan Log dari berat molekul dan RF (hasil bagi tracking band dan tracking total). Setelah diketahui persamaan dari kurva baku, maka persamaan tersebut dapat digunakan untuk menghitung berat molekul dari sampel protein yang kita running.

Teknik SDS-PAGE menggunakan gel poliakrilamid. Gel poliakrilamid merupakan hasil polimerisasi akrilamid dan bisakrilamid. Poliakrilamid dihasilkan dari sebuah sistem yang menghasilkan radikal bebas yaitu dengan penambahan ammonium persulfat (APS) dan tetrametilendiamin (TEMED). Ammonium persulfat sebagai inisiator, dan tetrametilendiamin sebagai pengkatalis (Sambrook & Russell 2001: 5. 43). Detergen ionik sodium dodesilsulfat akan membuat molekul menjadi bermuatan negatif. Bromofenol yang berfungsi untuk pewarnaan sekaligus untuk mengetahui berjalan atau tidaknya proses

running. (Boyer 1993: 118 & 119). SDS berfungsi untuk mendenaturasi protein, dan mengubah protein menjadi bermuatan negatif. . Stacking gel berfungsi untuk menahan sementara agar sampel bermigrasi pada waktu yang bersamaan. Resolving gel berfungsi untuk memisahkan molekul-molekul yang ada berdasarkan berat molekulnya. Kemudian ada komponen pewarnaan (staining) yang terdiri dari commasie blue staining dan silver salt straining. Berikutnya destaining yang digunakan untuk membersihkan gel dari pewarna sehingga pita dapat terlihat. (Boyer 1993: 139). Alat yang digunakan adalah comb yang berfungsi untuk membentuk well pada gel. Casting frame digunakan sebagai tempat untuk glass plates. Casting stand adalah sebagai tempat dipasangnya casting frame. Stanks sebagai wadah meletakkan perangkat elektroforesis. Micropipette dan tips digunakan untuk mengambil , mencampurkan dan memindahkan sampel ke dalam well. Gel yang digunakan pada SDS PAGE terdiri dari stacking gel yang memiliki pori dengan ukuran besar, dan memilki perbedaan pH dengan resolving gel (Boyer 1993: 118 & 119). Isopropanol digunakan untuk meratakan permukaan, menghambat polimerisasi dan mencegah difusi O2. Fungsi dari penambahan akuades untuk meratakan permukaan gel. (Boyer 1993: 12). Zat pewarna berfungsi untuk memperjelas pergerakan. Tujuan perendaman gel dalam destaining solution untuk memudahkan pegamatan (Boyer 1993: 139).

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan

listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan

ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti

protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan

pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah

terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan

agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam

nukleat. Elektroforesis yang dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel

poliakrilamida (PAGE = polyacrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein.

Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi

medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik,

molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi keelektroda negatif dan sebaliknya.

Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekulmolekul berdasarkan

muatannya.

Cara kerja menggunakan metode elktroforesis adalah: 1) Ektraksi enzim, 2) Pembuatan

gel, 3) Penempatan sampel, 4) Proses Elektroforesis, 5) Visualisasi system enzim dan 6) Metode

Analisis.

Pada praktikum ini dilakukan pembuatan dua jenis gel berbeda, yaitu separating gel dan stacking gel. Separating gel ini berfungsi untuk memisahkan atau menseparasi protein berdasarkan berat molekulnya, bahan yang digunakan dalam praktikum yaitu akrilamid 30% sebagai bahan untuk membentuk pori-pori dalam gel agar protein dapat terpisah berdasarkan ukurannya, 1M Tris pH 8,8 untuk menstabilkan pH buffer agar muatan dari protein tidak berubah, aquades digunakan sebagai pelarut polar dan sebagai media polar untuk aliran listrik dalam gel, SDS digunakan untuk memutuskan ikatan disulfida dari protein agar menjadi unfolding dan menyelubungi protein dengan muatan negatif, APS digunakan sebagai katalisator dalam polimerasi gel poliakrilamid, dan TEMED digunakan sebagai katalisator pembentukan radikal bebas dari ammonium persulfat dan sebagai pemadat sehingga pencampurannya dilakukan terakhir agar larutan tidak menjadi padat terlebih dahulu sebelum seluruh bahan tercampur. pH yang digunakan dalam separating gel yaitu 8,8 untuk mendapatkan pori-pori yang lebih kecil sehingga protein akan terseparasi dengan baik saat running. Larutan gel yang telah dibuat dimasukkan dalam plate untuk mencetak gel, lalu pemberian aquades diatas separating gel yang setengah padat bertujuan untuk membuat permukaan separating gel datar. Setelah padat aquades diserap agar dapat dilakukan proses selanjutnya yaitu penambahan stacking gel diatas separating gel. Gel kedua yaitu stacking gel yang berfungsi untuk tempat menata sampel protein sebelum proses running dimulai. Bahan yang digunakan dalam pembuatan stacking gel ini yaitu akrilamid-bis sebagai pembentuk pori-pori untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran yang dimilikinya, Tris pH 6,8 untuk mempertahankan pH proein agar tidak berubah, aquades sebagai pengencer, pelarut, dan pemberi kondisi polar untuk melancarkan arus listrik, SDS digunakan untuk memutuskan ikatan disulfide protein agar menjadi unfolding dan dapat menyelubungi protein dengan muatan negatif, APS digunakan sebagai katalisator dalam polimerasi gel poliakrilamid, dan TEMED digunakan sebagai katalisator pembentukan radikal bebas dari ammonium persulfat dan sebagai pemadat sehingga pencampurannya dilakukan terakhir agar larutan tidak menjadi padat terlebih dahulu sebelum seluruh bahan tercampur. Setelah seluruh bahan dicampur kemudian dituang diatas separating gel yang telah memadat untuk membuat satu rangkaian gel poliakrilamid yang dapat digunakan untuk SDS PAGE. Sisir dipasang untuk mencetak sumuran tempat sampel dimasukkan dalam gel.pH yang digunakan dalam separating gel yaitu 8,8 agar didapatkan protein tetap dalam keadaan muatan negatif. pH stacking gel yang dibuat yaitu 6,8 agar kondisi pH dari stacking gel berada di bawah isoelektrik protein (pH 8) sehingga protein akan tersusun secara berjajar pada bagian bawah dari stacking gel (Janson, 1998).Dalam preparasi sampel digunakan penambahan Reducing Sample Buffer atau RSB dengan perbandingan 1:1 karena RSB ini mampu memutus ikatan disulfida protein sehingga didapatkan protein dalam bentuk linier yang nantinya akan memudahkan separasi protein tersebut dalam gel saat running. Didalam RSB terdapat kandungan 1M Tris-Cl pH 6,8 untuk menjaga kondisi pH dari sampel protein, gliserol 50% berfungsi untuk menambah berat sampel sehingga mudah turun, SDS 10% berfungsi sebagai agen pereduksi yang memutuskan ikatan disulfida sehingga protein berbentuk linier dan member muatan negatif pada protein, fungsi pembentukan muatan negatif ini untuk memudahkan

separasi menuju kutub positif saat dilewatkan arus (Janson, 1998). Kandungan yang lain yaitu terdapat 2-merkaptoethanol yang berfungsi untuk membantu reaksi SDS dalam memecah ikatan disulfida dari protein, dan bromophenol Blue 1% sebagai penanda atau sebagai tracking dye yang memudahkan dalam mengamati pergerakan protein saat running (janson, 1998). Tetapi RSB yang digunaka dalam sampel tanaman sedikit berbeda dari sampel non tanaman, yaitu pada RSB untuk tanaman perlu ditambahkan DTT dan EDTA. Penambahan DTT ini untuk memecah ikatan disulfide dengan mendegradasi ikatan alifatik disulfide menjadi rantai polipeptida tunggal. Pada tanaman banyak terdapat jenis metabolit sekunder, sehingga untuk memaksimalkan pemecahan disulfida yang dilakukan oleh SDS dan 2-merkaptoethanol diperlukan penambahan DTT dan EDTA (Janson, 1998). Setelah penambahan RSB, sampel protein dipanaskan pada suhu 1000C bertujuan untuk mengoptimalkan pendenaturasian protein.Running yang dilakukan pada praktikum digunakan arus 30 mA selama 3-4 jam untuk mendapatkan hasil yang baik karena digunakan arus yang lebih kecil sehingga protein dapat terseparasi dengan baik. Running ini dilakukan untuk menseparasi protein berdasarkan berat molekul yang dimilikinya. Running buffer dengan pH 8,3 untuk menjaga kondisi fisiologis dari protein dan gel agar tetap bermuatan negatif karena berada diatas titik isoelektrik. Bagian atas dan bawah gel harus terendam running buffer karena system yang digunakan dalam elektroforesis yaitu wet sistem dan digunakan arus listrik, jika salah satu bagiannya tidak terendam maka arus listrik tidak dapat mengalir. Setelah running selesai, yang selanjutnya digunakan untuk analisis hanya separating gelnya saja sedangkan stacking gelnya dibuang karena band-band protein hanya terdapat pada separating gel saja.Langkah selanjutnya yaitu staining atau pewarnaan. Pewarnaan ini perlu untuk dilakukan untuk membantu dalam pengamatan band protein yang terseparasi. Larutan staining yang digunakan dalam praktikum ini yaitu CBB R-250 (Coomasie Brilliant Blue), CBB ini sensitif terhadap protein yang memiliki ukuran yang beriksar antara 0,5 hingga 20 mikrogram (Heidsamp, 2008). Penggoyangan perlu dilakukan untuk megoptimalkan reaksi staining yang dilakukan oleh CBB. Pencucian dengan aquades berfungsi untuk membilas dan menghilangkan CBB yang mungkin masih tersisa pada gel. Selanjutnya dilakukan perendaman pada larutan destaining untuk menghilangkan CBB yang tersisa dan memperjelas band protein yang terbentuk serta untuk menghilangkan CBB yang tidak berada pada band protein. Pemberian kertas saring saat perendaman pada larutan destaining bertujuan untuk memaksimalkan pembersihan larutan CBB. Setelah itu dilakukan pencucian lagi dengan aquades untuk menghilangkan sisa larutan destaining dan menghentikan pewarnaan yang dilakukan oleh larutan destaining. Selanjutnya gel dapat discan untuk mendapatkan visualisasi lebih baik untuk analisis selanjutnya.