A. JUDUL

Optimasi Produksi dan Penghambatan Bakteriosin dari Bakteri Asam

Laktat yang Diisolasi dari Air Susu Ibu (ASI) Terhadap Bakteri Escherichia

coli ATCC 25922.

B. LATAR BELAKANG

Kebutuhan manusia akan pangan terus meningkat. Kebutuhan ini tidak

akan pernah berhenti dalam kehidupan makhluk hidup. Selain kebutuhan terhadap

pangan, kebutuhan terhadap mutu pangan pun terus meningkat. Kontaminan

mikrobiologis merupakan salah satu penyebab mutu pangan berkurang dan

menjadi tidak aman untuk dikonsumsi. Mutu pangan dapat dinilai dari tingkat

kontaminan mikroba patogen.

Escherichia coli pertama kali diidentifikasikan oleh dokter hewan Jerman,

Theodor Escherich dalam studinya mengenai sistem pencernaan pada bayi hewan.

Pada tahun 1885, beliau menggambarkan organisme ini sebagai komunitas bakteri

coli (Escherich 1885) dengan membangun segala perlengkapan patogenitasnya di

infeksi saluran pencernaan. Escherichia coli merupakan bakteri yang banyak

dijumpai pada pangan terutama pada pangan yang memiliki kandungan protein

tinggi seperti daging segar. Strain pathogen Escherichia coli dapat menimbulkan

penyakit diare berdarah , pembengkakan dan kelainan ginjal, demam, kelainan

saraf, bahkan kematian (Velcerc et al., 2002 dalam Usmiati dan Marwati, 2007).

Escherichia coli ATCC 25922 merupakan strain Escherichia coli yang sering

digunakan utnuk tes kerentanan antibiotik. Strain Escherichia coli ATCC 25922

tidak menghasilkan racun Shiga like toxin yang dapat menyebabkan diare akut

pada manusia.

2

Bakteri Asam Laktat (BAL) merupakan bakteri kelompok gram positif,

tidak berbentuk spora, dan dapat membentuk kokus maupun batang, yang

memproduksi asam laktat sebagai produk akhir dalam fermentasi karbohidrat.

BAL dapat bersumber dari makanan, feses, maupun air susu ibu (ASI).

Berdasarkan penelitian yang dilakukan Puspawati & Nocianitri, 2012, diperoleh

28 isolat bakteri asam laktat dari ASI. Dari 28 isolat BAL tersebut, terdapat 9

isolat BAL yang memiliki karatkeristik sebagai probiotik. Karakteristik dari 9

isolat BAL tersebut adalah memiliki karakteristik gram positif, katalase negatif,

bentuk koloni bulat, batang pendek dan seperti huruf Y, mampu tumbuh pada

suhu 10oC sampai suhu 45oC, tahan dan mampu tumbuh pada media yang

mengandung garam NaCl, bersifat homofermentatif (tidak memproduksi gas CO2

dari glukosa), tidak membentuk dekstran dari sukrosa, tahan dan mampu tumbuh

pada pH 2 sampai pH 6, mampu tumbuh pada kondisi lingkungan yang

mengandung garam empedu dari konsentrasi 0,2 mM sampai 0,6 mM.

BAL dapat digunakan sebagai probiotik. Salah satu sifat bakteri probiotik

adalah memiki kemampuan (aktivitas) antimikroba terhadap mikroba patogen.

Aktivitas antimikroba disebabkan oleh senyawa-senyawa metabolit yang

dihasilkan seperti asam organik, CO2, H2O2, diasetil, dan bakteriosin. Beberapa

strain bakteri asam laktat dapat memproduksi protein bakteriosin yang dapat

mencegah mikroba pembusuk dan patogen (Anon, 2009 dalam Ruzanna, 2011).

Bakteriosin merupakan peptida yang bersifat antimikroba yang diproduksi

oleh bakteri yang bersifat menghambat pertumbuhan bakteri lain. Beberapa galur

BAL dapat menghasilkan senyawa protein yang disebut bakteriosin, dan bersifat

3

bakterisidal terhadap bakteri gram positif dan gram negatif (Tahara et al., 1996

dalam Usmiati dan Marwati, 2007).

Pemakaian bakteriosin komersial sebagai pengawet sudah dilakukan di

beberapa negara dan diaplikasikan pada beberapa jenis makanan. Bakteriosin

merupakan senyawa protein yang dieksresikan oleh bakteri yang bersifat

menghambat pertumbuhan bakteri lain. Bakteriosin banyak diteliti karena

berpotensi sebagai pengawet makanan alami dan dapat diaplikasikan di bidang

farmasi.

Dari penelitian yang dilakukan Sundari (2014), diketahui bahwa BAL

yang diisolasi dari ASI memiliki aktivitas antimikroba yang berasal dari

bakteriosin. Namun belum diketahui waktu optimum dan daya penghambatannya.

Berdasarkan hal tersebut, maka perlu dilakukan peneelitian untuk mengetahui

waktu produksi bakteriosin yang optimum yang dihasilkan oleh bakteri asam

laktat dan daya penghambatannya terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922.

C. RUMUSAN MASALAH

1. Kapan waktu optimum produksi bakteriosin dari BAL yang diisolasi

dari ASI?

2. Bagaimana daya penghambatan bakteriosin dari bakteri asam laktat

yang disolasi dari ASI terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922?

D. HIPOTESIS

1. BAL yang diisolasi dari ASI akan memproduksi bakteriosin pada

waktu tertentu.

2. Bakteriosin yang dihasilkan BAL yang diisolasi dari ASI memiliki

daya penghambatan terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922.

4

E. TUJUAN PENELITIAN

Penelitian ini bertujuan untuk :

1. Mengetahui waktu optimum produksi bakteriosin dari BAL yang

diisolasi dari ASI.

2. Mengetahui daya penghambatan bakteriosin dari BAL yang diisolasi

dari ASI terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922.

F. MANFAAT PENELITIAN

Manfaat dari penelitian ini adalah :

1. Sebagai informasi untuk mengetahui waktu optimum produksi

bakteriosin dari BAL yang diisolasi dari ASI serta daya

penghambatannya terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922..

2. Bakteriosin dari BAL yang diisolasi dari ASI dapat diaplikasikan pada

produk pangan sebagai pengawet.

G. TINJAUAN PUSTAKA

G.1. Bakteriosin

Bakteriosin merupakan peptida antimikroba yang diproduksi oleh bakteri

yang bersifat menghambat pertumbuhan bakteri lain. Beberapa galur BAL dapat

menghasilkan senyawa protein yang disebut bakteriosin, dan bersifat bakterisidal

terhadap bakteri gram positif dan gram negatif (Tahara et al., 1996 dalam Usmiati

dan Marwati, 2007). Umumnya ukuran peptida bakteriosin berkisar antara 3

hingga 6 kDa.

Bakteriosin pertama kali ditemukan oleh A. Gratia pada tahun 1925,

dengan senyawa yang dikenal sebagai colicin yang berasal dari Eschericia coli V

dan dapat menghambat pertumbuhan Eschericia coli S. Bakteriosin dapat

5

membunuh bakteri dengan cara menghambat sintesis dinding sel bakteri (Jack, et

al, 1995; Fimland, et al, 2002; Quadri, 2002; dalam Evelina, 2012)

Pemakaian bakteriosin komersial sebagai pengawet sudah dilakukan di

beberapa negara dan diaplikasikan pada beberapa jenis makanan. Bakteriosin

dapat diproduksi oleh Lactococcus, Lactobacillus, dan Pediococcus yang diisolasi

dari berbagai bahan makanan, misalnya nisin diproduksi oleh Lactococcus lactis,

pediosin AcH dihasilkan oleh Pediococcus acidilactic. Beberapa kelebihan

bakteriosin sehingga potensial digunakan sebagai pengawet yaitu :

1. Bukan bahan toksik dan mudah mengalami degradasi oleh enzim

proteolitik karena merupakan senyawa protein.

2. Tidak membahayakan mikroflora usus karena mudah dicarna oleh

enzim saluran pencernaan.

3. Dapat mengurangi penggunaan bahan kimia sebagai pengawet

pangan.

4. Stabil terhadap pH dan suhu yang cukup luas sehingga tahan terhadap

proses pengolahan yang melibatkan asam dan basa, serta kondisi

panas dan dingin (Cleveland, et al., 2001 dalam Usmiati dan Marwati,

2007).

Berdasarkan sifat kimia, struktur, dan fungsinya, bakteriosin dibagi

menjadi empat kelompok. Bakteriosin kelas I memiliki ciri – ciri yaitu

mempunyai berat molekul lebih kecil dari 5 kDa, mengandung lanthionine dan β

– methyl lanthionine. Kelompok ini dibagi lagi menjadi dua tipe, yaitu tipe A dan

tipe B berdasarkan struktur kimia dan aktivitas antimikrobanya. Tipe A berbentuk

ulir, bermuatan positif dan aktivitasnya berhubungan dengan pembentukan pori

6

pada membran sel. Contoh dari tipe ini adalah, nisin dan lacticin (Lactococcus

lactis), lactoccin (Lactococcus sake), gallidermin (Staphylococcus gallinarum),

dan epidermin (Staphylococcus epidermidis). Sedangkan tipe B berbentuk

globular, bermuatan negatif atau netral, dan aktivitas antimikrobanya terkait

dengan penghambatan enzim spesifik. Contohnya, mersacidin (Bacillus subtilis),

actagardin (Actinoplasnes sp.), dan cinnamycin (Strepomyces cinnamones) (Nes

et al., 1996; dalam Suparjo, 2008).

Bakteriosin kelas II, mempunyai berat molekul lebih kecil dari 10 kDa,

heat stable, dan tidak mengandung asam amino lantionin. Kelas ini dibagi

menjadi tiga subkelas, yaitu bakteriosin yang mempunyai efek anti-listerial (IIa)

contohnya sakacin A dari bakteri Lactobacillus sake LB706, bakteriosin dengan

dua peptida (IIb) contohnya lactococcin M dari bakteri Lactococcus lactis, dan

bakteriosin yang disekresikan melalui sec-dependent contohnya acidocin B dari

bakteri Lactobacillus acidophilus M46 (Martinez et al., 2000; Oscarriz and

Pisabarro, 2001; dalam Suparjo, 2008).

Bakteriosin kelas III ciri – cirinya mempunyai berat molekul lebih dari 30

kDa dan heat labile. Sedangkan bakteriosin Kelompok IV, terdiri dari satu atau

lebih non proteinaceous tambahan, lipid atau kelompok-kelompok karbohidrat

yang diperlukan untuk aktivitas (Oscarriz dan Pisabarro, 2001; dalam Suparjo,

2008).

Struktur kimia yang beragam menyebabkan bakteriosin mempunyai

pengaruh yang berbeda terhadap fungsi – fungsi sel. Bakteriosin gram-positif

merupakan senyawa aktif membran yang bekerja melalui pembentukan pori pada

sel target, menghambat aktivitas enzim, pertumbuhan spora, atau pembentukan

7

septum (Jack et al., 1995; dalam Evelina, 2012). Secara umum, bakteriosin juga

dapat mengganggu pembentukan asam nukleat, menyebabkan terganggunya

transfer informasi genetik yang selanjutnya akan menginaktivasi atau merusak

materi genetik sehingga terganggunya proses pembelahan sel untuk pembiakan

(Suparjo, 2008).

Beberapa bakteriosin menjadi sangat sensitif dan menjadi inaktif dengan

perubahan pH. Bakteriosin sangat lebih toleran pada asam dibanding dengan pH

alkalis yang ekstrim. Kriteria kestabilan panas pada bakteriosin sangat sulit

ditetapkan, hal ini tergantung keadaan pemurnian (Suarsana, 2000; dalam

Suparjo, 2008).

G.2. Bakteri Asam Laktat

Bakteri asam laktat (BAL) secara luas digunakan sebagai starter untuk

fermentasi minuman, daging, dan sayuran. BAL merupakan bakteri kelompok

gram positif, tidak membentuk spora, dan dapat membentuk kokus maupun

batang, serta memproduksi asam laktat sebagai produk akhir dalam fermentasi

karbohidrat. BAL berhubungan dengan fermentasi makanan dan pakan ternak, dan

juga merupakan bakteri yag secara normal berhubungan dengan kesehatan

permukaan mukosa manusia dan hewan (Salminen, et al., 2004; Nair and

Surendran, 2005 dalam Ruzanna, 2011).

Beberapa strain BAL dapat memproduksi protein bakteriosin yang dapat

lebih mencegah mikroba pembusuk dan patogen (Anon, 2009 dalam Ruzanna,

2011). Strain BAL yang dapat digunakan sebagai probiotik antara lain berasal dari

genus Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Lactococcus, dan Streptococcus

(Hutkins, 2006).

8

Genus Lactobacillus berbentuk batang yang bervariasi dari batang yang

sangat pendek sampai batang yang panjang. Genus bakteri ini juga bersifat

mikroaerofilik, katalase negatif, dan gram positif. Salah satu spesies dari

Lactobacillus adalah Lactobacillus acidophilus (Hutkins, 2006). Lactobacillus

acidophilus merupakan bakteri gram positif berbentuk kokus atau batang, bersifat

non motil dan non spora yang memproduksi asam laktat sebagai produk utama

dari metabolisme fermentasi dan menggunakan laktosa sebagai sumber karbon

utama dalam memproduksi energi (Buttris, 1997). Lactobacillus acidophilus dapat

tumbuh baik dengan oksigen ataupun tanpa oksigen, dan bakteri ini dapat hidup

pada lingkungan yang sangat asam sekalipun, seperti pada pH 4-5 atau

dibawahnya (Sandine, 1979).

Genus Pediococcus berbentuk kokus berpasangan atau bergerombol, gram

positif, katalase negatif, dan bersifat mikroaerofilik (Hutkins, 2006). Salah satu

spesies dari Pediococcus adalah Pediococcus acidilactici. Pediococcus

acidilactici biasanya ditemukan dalam sayuran difermentasi , produk susu

fermentasi dan daging (Barros et al., 2001).

Genus Leuconostoc bersifat gram positif, selnya berbentuk kokus, tersusun

berpasangan atau berbentuk rantai, tidak bergerak, tidak berspora, katalase negatif,

anaerob fakultatif, bersifat non motil dan mesofil (Hutkins, 2006). Salah satu spesies

dari Leuconostoc adalah Leuconostoc mesenteroides. Leuconostoc mesenteroides

memiliki sifat khusus yaitu mampu hidup pada kadar gula, garam dan alkohol

yang tinggi serta mampu memfermentasi monosakarida dan disakarida.

Leuconostoc mesenteroides biasanya digunakan dalam proses fermentasi makanan

seperti sauerkraut, sosis, yogurt, kecap, dan acar (Hutkins, 2006).

9

Genus Streptococcus berbentuk kokus yang berpasangan atau berantai dengan

ukuran 0,7 – 0,9 μm, bersifat gram positif, tidak membentuk spora, non motil,

bersifat aerobik maupun anaerobic fakultatif (Hutkins, 2006). Salah satu spesies dari

genus ini adalah Streptococcus thermophilus. Streptococcus thermophilus merupakan

bakteri yang sering digunakan dalam proses pembuatan yoghurt, selain

Lactobacillus. Bakteri satu ini juga digunakan sebagai starter kultur bagi makanan

olahan susu lainnya, misalnya saja pada keju mozarella (Awad et al., 2005).

Genus Lactococcus bersifat anaerob fakultatif, non-mortil, dan suhu

optimal pertumbuhannya pada suhu 30oC (Hutkins, 2006). Memiliki bentuk

kokus, berpasangan atau rantai pendek. Salah satu spesies Lactococcus adalah

Lactococcus lactis. Lactococcus lactis adalah salah satu bakteri yang terlibat

dalam pembuatan yoghurt. Bakteri ini bahkan membedakan yoghurt dengan

produk olahan susu jenis lain. Bakteri ini akan bekerja sama dengan bakteri

Lactobacillus bulgaricus dalam memfermentasi susu segar untuk mengubahnya

menjadi yoghurt (Anon, 2014b). Bakteri Lactobacillus bulgaricus akan berperan

dalam pembentukan aroma yoghurt, sedangkan Lactococcus lactis berperan dalam

pembentukan rasa dari yoghurt (Anon, 2014b).

BAL termasuk mikroba yang aman jika ditambahkan dalam pangan karena

sifatnya tidak toksik dan tidak menghasilkan toksin. BAL sering juga disebut food

grade microorganism atau dikenal sebagai mikroba yang Generally Recognized

As Safe (GRAS) yaitu mikroba yang tidak berisiko terhadap kesehatan, bahkan

beberapa jenis bakteri tersebut berguna bagi kesehatan. BAL bermanfaat untuk

peningkatan kualitas higienitas dan keamanan pangan melalui penghambatan

secara alami terhadap mikroorganisme patogen. BAL dapat berfungsi sebagai

10

pengawet makanan karena mampu memproduksi asam organik, menurunkan pH

lingkungannya dan mengekskresikan senyawa yang mampu menghambat

mikroorganisme patogen seperti H2O2, diasetil, CO2, asetaldehid, isomer asam

asam-amino, dan bakteriosin (Kusmiati dan Malik, 2002).

G.3. Escherichia coli

Escherichia coli adalah bakteri gram negatif, berbentuk batang, tidak

berspora, serta tergolong dalam keluarga Enterobacteriaceae. Kebanyakan

Escherichia coli ditemukan sebagai flora normal di saluran usus manusia maupun

hewan. Selain itu Escherichia coli dapat mudah tumbuh pada berbagai media

kultur sederhana maupun sintetik sederhana dengan suhu optimum 370C dalam

kondisi aerobik (Sussman, 1997; dalam Kusuma, 2010).

Escherichia coli pertama kali diidentifikasikan oleh dokter hewan Jerman,

Theodor Escherich dalam studinya mengenai sistem pencernaan pada bayi hewan.

Pada tahun 1885, beliau menggambarkan organisme ini sebagai komunitas bakteri

coli (Escherich 1885) dengan membangun segala perlengkapan patogenitasnya di

infeksi saluran pencernaan. Nama “Bacterium coli” sering digunakan sampai pada

tahun 1991 ketika Castellani dan Chalames menemukan genus Escherichia dan

menyusun tipe spesies Escherichia coli.

Escherichia coli ATCC 25922 merupakan strain Escherichia coli yang

tidak menghasilkan racun Shiga like toxin. Keracunan Shiga like toxin pada manusia

dapat menyebabkan diare akut berdarah (Marlina dkk., 2009 dalam Juniathati, 2011).

Strain ini sering digunakan untuk tes kerentanan antibiotik dan relatif aman digunakan di

laboratorium.

Escherichia coli adalah anggota flora normal usus. Escherichia coli

berperan penting dalam sintesis vitamin K, konversi pigmen-pigmen empedu,

11

asam-asam empedu dan penyerapan zat-zat makanan. Escherichia coli menjadi

patogen jika jumlah bakteri ini dalam saluran pencernaan meningkat atau berada

di luar usus. Escherichia coli menghasilkan enterotoksin yang menyebabkan

beberapa kasus diare. Penyakit yang disebabkan oleh Escherichia coli yaitu

infeksi saluran kemih, diare, sepsis, dan meningitis.

G.4. Air Susu Ibu

Air Susu Ibu (ASI) merupakan makanan alamiah yang ideal untuk bayi,

terutama pada bulan-bulan pertama, ASI mengandung semua gizi yang

dibutuhkan untuk membangun dan menyediakan energi bagi pertumbuhan dan

perkembangan bayi secara optimal. Disamping itu, ASI mengandung beberapa zat

anti terhadap penyakit-penyakit yang keberadaannya tidak diberikan melalui jalan

lain

Didalam ASI terkandung nutrisi yang diperlukan bayi untuk pertumbuhan

dan mengandung zat-zat kekebalan yang sangat penting untuk mencegah

timbulnya penyakit, serta mudah dicerna oleh pencernaan bayi. Dengan demikian

ASI adalah makanan terbaik bagi bayi, oleh karena itu setiap bayi setidaknya

memperoleh ASI.

ASI yang keluar dari kelenjar susu ibu pada dasarnya dapat dibagi menjadi

tiga macam ASI berdasarkan waktu keluarnya serta kandungan zat gizinya. ASI

yang keluar pertama kali setelah ibu melahirkan disebut kolostrum. Setelah

kolustrum tidak keluar lagi, ASI disebut sebagai ASI masa transisi dan setelah

masa itu tepatnya 10 hari kelahiran ASI disebut ASI matang ASI dewasa.

12

G.5. Komposisi ASI

ASI mengandung berbagai macam nutrisi yang sangat berguna bagi

pertumbuhan bayi. Secara garis besar ASI dibedakan dalam 3 stadium yaitu

kolostrum, air susu transisi/peralihan dan air susu matur, dimana komposisi nutrisi

ketiga stadium tersebut berbeda.

Kolostrum adalah ASI yang pertama kali keluar pada akhir kelahiran. Zat

Kolustrum mengandung tinggi protein, mineral, garam, vitamin A, nitrogen, sel

darah putih dan antibodi yang tinggi daripada ASI matur. Namun sedikit

mengandung lemak dan sedikit hidrat arang. Kolustrum dihasilkan oleh payudara

dari lima bulan pertama kehamilan pertama sampai tujuh hari setelah melahirkan.

Kolustrum berwarna kekuning-kuningan. Peralihan dari kolostrum ke susu biasa

(yang matang) membutuhkan waktu dua minggu. Komposisi ASI dapat dilihat

pada Tabel 1.

Tabel 1. Komposisi ASI (Anon, 2014a)

G.6. Mikroba Pada ASI

ASI banyak mengandung zat gizi protein, karbohidrat, lemak, vitamin,

mineral, imunnoglobulin, dan enzim. Selain zat gizi, pada ASI yang selama ini

13

Bahan :Isolat BAL dari ASI

Proses :Uji konfirmasi

Produksi bakteriosinAktivitas penghambatan terhadap

bakteri Escherichia coli ATCC 25922

Isolasi bakteriosin

Variabel yang diamati :Zona bening yang terbentuk dari berbagai waktu inkubasi

dianggap steril terdapat berbagai jenis bakteri yang dapat menstimulasi sistem

kekebalan tubuh bayi. Sejak tahun 1975, sebagian peneliti sudah menguji

keberadaan bakteri di dalam ASI. Hasil serangkaian penelitian menunjukkan

bahwa terdapat bakteri baik (prebiotik), bakteri oportunis (bakteri yang dalam

jumlah cukup tidak berbahaya namun jika jumlahnya meningkat akan

menimbulkan penyakit), dan bakteri patogen di dalam ASI. Contoh bakteri baik

yang ditemukan pada ASI adalah Lactobacilli dan beberapa tipe Bifidobacterium.

Bakteri berperan penting untuk menstimulasi daya tahan tubuh, membantu

pematangan imunitas, serta melindungi tubuh dari infeksi. Selain peran dalam

sistem daya tahan tubuh, bakteri juga membantu produksi mikronutrien seperti

vitamin.

H. KERANGKA KONSEP

Kerangka konsep dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Kerangka Konsep Penelitian

14

I. METODOLOGI PENELITIAN

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental yang bertujuan untuk

mengetahui waktu optimum produksi bakteriosin dari BAL yang diisolasi dari

ASI dan sifat penghambatannya terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922.

I.1. Tempat dan Waktu Penelitian

Tempat penelitian ini adalah di Laboratorium Mikrobiologi Pangan,

Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Udayana yang beralamat di Jalan P.B.

Sudirman, Denpasar.Waktu penelitian adalah dari bulan Juni - Juli 2014.

I.2. Bahan

Bahan yang digunakan adalah isolat BAL dari ASI, isolat Escherichia coli

ATCC 25922, Nutrient Agar (NA), de Man Regosa Sharpe Broth (MRSB)

(Oxoid), de Man Regosa Sharpe Agar (MRSA) (Oxoid), alkohol, aquades, NaOH,

EMBA (Eosine Methylene Blue Agar), Lactose Broth (LB) , ammonium sulfat,

dan Tween 80.

I.3. Peralatan

Alat yang digunakan adalah jarum ose, cawan petri, tabung reaksi, vortex,

inkubator, laminar flow, spritus, korek api, tip, pipet mikro, pipet volume,

Erlenmeyer, autoclave, aluminium foil, jangka sorong dan magnetic stirrer.

I.4. Rancangan Penelitian

Rancangan penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode

deksriptif yang bertujuan untuk mengetahui waktu optimum produksi bakteriosin

dari BAL yang diisolasi dari ASI serta mengetahui daya penghambatan

bakteriosin dari BAL yang diisolasi dari ASI terhadap bakteri Escherichia coli

ATCC 25922. Data hasil penelitian disajikan dalam bentuk tabel.

15

I.5. Variabel yang Diamati

Variabel yang diamati dalam penelitian ini adalah besarnya zona bening yang

dibentuk dengan berbagai waktu inkubasi dari masing-masing isolat BAL. Zona bening

merupakan daerah penghambatan yang muncul di sekeliling sumur dan diukur dengan

jangka sorong. Setiap zona bening diukur diameternya sebanyak empat kali di tempat

berbeda dan hasilnya dirata-ratakan kemudian dikurangi dengan diameter lubang

(Amanah, 2011). Metode pengukuran zona bening dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2. Pengukuran Zona Bening

Keterangan gambar :

A : Sumur untuk SBS

B : Zona bening

C : Cawan petri (Media NA)

Garis Pengukuran diameter zona bening

I.6. Tahapan Penelitian

Penelitian ini terdiri dari empat tahap yaitu tahap pertama adalah persiapan

kultur kerja BAL dan bakteri patogen Escherichia coli ATCC 25922, tahap kedua

adalah uji konfirmasi isolat BAL dari air susu ibu dan bakteri patogen Escherichia

coli ATCC 25922, tahap ketiga adalah produksi bakteriosin dengan variasi waktu

inkubasi, dan tahap keempat adalah isolasi bakteriosin. Secara garis besar tahapan

penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 3.

16

Isolat BAL dari ASI Bakteri Escherichia coli

Konfirmasi BAL dari ASI :Pewarnaan Gram

Bentuk dan MorfologiUji Katalase

Konfirmasi Bakteri Escherichia coli :

Pewarnaan GramBentuk dan Morfologi

Terkonfirmasi Terkonfirmasi

Produksi bakteriosin dari BAL dengan variasi waktu inkubasi : 12, 24, 36, 48, 60 jam

Pengujian aktivitas SBS yang mengandung bakteriosin

terhadap mikroba patogen Escherichia coli ATCC

25922

Isolasi bakteriosin

Pengujian aktivitas bakteriosin terhadap mikroba

patogen Escherichia coli ATCC 25922

Gambar 3. Skema Tahapan Penelitian

17

1.6.1. Penelitian Tahap I adalah Persiapan Kultur Kerja BAL dan Bakteri Patogen Escherichia coli ATCC 25922.

Tahap ini dilakukan untuk meremajakan mikroba yang digunakan dalam

penelitian ini. Hal yang dilakukan antara lain :

a. Penyegaran Isolat Bakteri Asam Laktat dari Stok Kultur pada Media MRSB (Juniarthati, 2011).

Penyegaran BAL dilakukan dengan cara menginokuloasi 1 ose biakan dari

kultur stok gliserol kedalam 5 mL media MRS broth steril. Kemudian media yang

telah disuspensikan dengan isolat diinkubasi pada suhu 37oC selama 24-48 jam.

Pertumbuhan BAL pada media ditandai dengan adanya kekeruhan pada media

MRS broth.

b. Penyegaran Isolat Bakteri Patogen Escherichia coli ATCC 25922 pada Media Lactose Broth (Juniarthati, 2011).

Isolat bakteri Escherichia coli ATCC 25922 dalam gliserol yang disimpan

pada suhu -20oC, diinokulasi dengan menggunakan jarum ose pada tabung reaksi

yang sudah berisi 5 mL medium lactosa broth steril kemudian diinkubasikan pada

temperatur 37oC selama 24 jam. Pertumbuhan Escherichia coli ATCC 25922 pada

media ditandai dengan adanya kekeruhan pada media LB.

c. Pembuatan Stok Bakteri Patogen Escherichia coli ATCC 25922 (Juniarthati, 2011).

Isolat bakteri Escherichia coli ATCC 25922 yang telah disegarkan,

dibiakan pada media EMBA dengan metode streak for single colony untuk

memperoleh koloni tunggal yang terpisah. Koloni tunggal diambil kemudian

dimasukan kedalam masing-masing 5 ml media LB dan diinkubasi 24 jam.

Kemudian dibuat stok patogen dengan menginokulasikan bakteri yang telah

18

dibiakkan pada media LB ke media NA agar miring dan diinkubasi pada suhu

37oC selama 24 jam.

1.6.2. Penelitian Tahap II adalah Uji Konfirmasi Isolat BAL dari Air Susu Ibu dan Bakteri Patogen Escherichia coli ATCC 25922.

Penelitian tahap kedua ini dilakukan untuk mengetahui karakterisasi fisik

dari BAL dan bakteri patogen Escherichia coli ATCC 25922. Hal yang dilakukan

antara lain :

a. Pewarnaan Gram dan Pengamatan Bentuk (Harrigan dan McCance, 1998 dalam Puspawati dan Nociantri, 2012).

Isolat bakteri dihapuskan pada kaca objek yang bersih dan difiksasi ± 20

cm di atas nyala api bunsen. Preparat ditetesi dengan pewarna kristal violet,

didiamkan selama 1 menit dan dicuci menggunakan air mengalir dalam keadaan

terbalik dan dikeringkan. Preparat ditetesi dengan larutan lugol dan didiamkan

selama 2 menit, selanjutnya dibilas dengan air mengalir kemudian dikeringkan

dengan kertas tisu. Preparat ditetesi dengan etanol 95% dan didiamkan selama 10-

20 detik. Sediaan dicuci lagi dengan air dalam keadaan terbalik. Selanjutnya

diwarnai dengan safranin selama 10-20 menit. Sediaan dicuci lagi dengan air dan

kelebihan air dihilangkan dengan menggunakan kertas hisap tanpa menggosok

sediaan. Lalu diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran 1000x dan

digunakan minyak imersi.

Uji gram positif jika sel berwarna ungu dan gram negatif jika sel berwarna

merah. Dimana, bakteri asam laktat pada pewarnaan gram akan menunjukkan

warna ungu karena tergolong bakteri gram positif. Sedangkan bakteri patogen

Escherichia coli ATCC 25922 akan menunjukkan warna merah karena tergolong

bakteri gram negatif.

19

b. Uji Katalase (Harrigan dan McCance, 1998 dalam Puspawati dan Nociantri, 2012).Isolat bakteri asam laktat dari ASI diambil satu ose, kemudian dioleskan

pada gelas obyek yang telah diberi alkohol. Gelas benda ditetesi 2 tetes larutan

H2O2 10%. Diamati terbentuknya gelembung gas pada preparat. Uji katalase

positif ditandai dengan adanya gelembung gas oksigen yang dihasilkan dari

degradasi H2O2 oleh enzim katalase. Dimana, bakteri asam laktat akan

menunjukkan hasil negatif pada uji katalase ini.

1.6.3. Penelitian Tahap III adalah Produksi Bakteriosin dengan Variasi Waktu Inkubasi.

Penelitian tahap ketiga dilakukan untuk mengetahui waktu optimum

produksi bakteriosin dan daya penghambatan SBS yang mengandung bakteriosin

terhadap bakteri patogen Escherichia coli ATCC 25922. Hal yang dilakukan

antara lain :

a. Produksi Bakteriosin dari BAL dengan Variasi Waktu Inkubasi (Juniartati, 2011).

Isolat BAL dari working culture dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang

berisi MRS broth masing-masing sebanyak 5 mL dan diinkubasi selama 24 jam.

Selanjutnya, diambil masing-masing 1000 μL suspensi bakteri yang telah tumbuh

dan diinokulasi ke dalam 5 buah tabung reaksi yang masing-masing telah berisi

9ml MRS broth kemudian diinkubasi selama 12, 24, 36, 48, dan 60 jam pada suhu

370C. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama ± 15 menit.

Supernatan Bebas Sel (SBS) hasil sentrifugasi kemudian dinetralkan dengan

NaOH 0,1% dan dipanaskan dengan suhu 100oC selama 15 menit. Tujuan

penetralan adalah untuk menghilangkan asam-asam organik, sedangkan tujuan

20

proses pemanasan adalah untuk menghilangkan H2O2, CO2, dan diasetil. Sehingga

yang diperoleh hanya SBS yang mengandung bakteriosin.

b. Uji Aktivitas Antimikrobial SBS yang mengandung Bakteriosin Isolat BAL dengan Variasi Waktu Inkubasi terhadap Escherichia coli (Juniartati, 2011).

Bakteri patogen Escherichia coli ATCC 25922 dalam stok NA agar miring

kemudian diinokulasi ke dalam media lactosa broth dan diinkubasi selama 24

jam. Bakteri patogen uji sebanyak 100 µL disebar menggunakan hoky

streak/batang bengkok ke dalam cawan petri yang berisi media NA yang

sebelumnya telah disterilisasi dan telah memadat. Setelah ± 15 menit, media

tersebut kemudian dilubangi dengan pipet Pasteur. Lubang tersebut kemudian

diisi dengan SBS yang telah dinetralkan dan dipanaskan sebanyak 20 μL dan

diinkubasi pada suhu 37ºC selama ± 24 jam. Zona bening yang terbentuk dengan

berbagai variasi waktu inkubasi dari masing-masing isolat BAL diamati dan

diukur. Zona bening yang terbentuk menunjukan daya penghambatan bakteriosin

terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922.

1.6.4. Penelitian Tahap IV adalah Isolasi Bakteriosin

Penelitian pada tahap keempat dilakukan pada isolat BAL yang

menunjukkan hasil positif dan penghambatan terbesar terhadap bakteri patogen

Escherichia coli ATCC 25922 pada SBS netral yang dipanaskan. Isolasi

bakteriosin ini dilakukan dengan pengendapan SBS menggunakan garam

ammonium sulfat. Setelah diisolasi, dilakukan kembali pengujian aktivitas

bakteriosin terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922 untuk mengetahui

daya hambat bakteriosin yang telah diisolasi terhadap bakteri Eschericia coli

ATCC 25922. Hal yang dilakukan pada tahap ini antara lain :

21

a. Isolasi Bakteriosin (Juniartati, 2011).

Isolasi bakteriosin dilakukan pada isolat BAL yang menunjukkan hasil

positif dan penghambatan terbesar terhadap bakteri patogen Escherichia coli

ATCC 25922 pada SBS netral yang dipanaskan. Isolasi ini dilakukan dengan

pengendapan menggunakan garam ammonium sulfat.

Tahapan ini diawali dengan sentrifugasi bakteri yang telah diinokulasi ke

dalam MRS broth kemudian diinkubasi selama waktu terbaik yang telah diperoleh

dengan kecepatan 3000 rpm selama ± 15 menit. Tiap 1 mL SBS dipindahkan ke

dalam effendorf, dipanaskan selama ± 15 menit pada suhu 100ºC kemudian

didiamkan selama 10 menit. Ke dalam SBS tadi ditambahkan amonium sulfat

sebanyak 0,52 gram dan divortex hingga homogen. SBS yang telah tercampur

homogen dengan ammonium sulfat disimpan selama 24 jam pada suhu 5oC dan

disentrifugasi kembali dengan kecepatan 15.000 rpm selama ± 30 menit pada suhu

4oC. SBS hasil sentrifugasi kemudian dibuang dan filtrat yang diperoleh dibilas

dengan air steril. Air steril hasil bilasan dibuang, kemudian filtrat ditambah

dengan air steril kembali sebanyak 50 µL dan divortex hingga homogen. Larutan

bakteriosin tersebut digunakan untuk uji antimikroba terhadap bakteri patogen

Escherichia coli ATCC 25922.

b. Uji Aktivitas Antimikrobial Bakteriosin Isolat BAL dengan Variasi Waktu Inkubasi terhadap Escherichia coli ATCC 25922 (Juniartati, 2011).

Bakteri patogen Escherichia coli ATCC 25922 dalam stok NA agar miring

kemudian diinokulasi ke dalam media lactosa broth dan diinkubasi selama 24

jam. Bakteri patogen uji sebanyak 100 µL disebar menggunakan swab steril ke

dalam cawan petri yang berisi media NA yang sebelumnya telah disterilisasi dan

22

telah memadat. Setelah ± 15 menit, media tersebut kemudian dilubangi dengan

pipet Pasteur. Lubang tersebut kemudian diisi dengan dengan larutan bakteriosin

yang telah diisolasi dari SBS netral yang dipanaskan sebanyak 20 μL dan

diinkubasi pada suhu 37ºC selama ± 24 jam. Zona bening yang terbentuk dengan

berbagai variasi waktu inkubasi dari masing-masing isolat BAL diamati dan

diukur.

J. JADWAL PENELITIAN

No Kegiatan Waktu Penelitian

April Mei Juni Juli Agustus

1 Pembuatan

Proposal

UP

2 Seminar

UP

3 Revisi

Proposal

UP

4 Penelitian

5 Analisis

Data dan

Penyusunan

Laporan

6 Seminar

Hsil

7 Skripsi

23

K. BIAYA PENELITIAN

K.1 Dana Awal

a. Pembuatan proposal Rp 150.000

b. Fotocopy Rp 50.000

K.2 Dana Penelitian

a. Bahan penelitian Rp 100.000

b. Konsumsi seminar UP Rp 100.000

c. Penelitian di laboratorium Rp 1.500.000

d. Analisis data Rp 100.000

e. Penyusunan laporan Rp 200.000

f. Biaya tidak terduga Rp 500.000

Rp 2.700.000

24