2.2 Metode

2.2.1 Alat dan Bahan

* Bahan Tanaman

Tanaman segar Sophora interrupta bedd telah dikumpulkan dari bukit

Tirumala, Andhra Pradesh, India. Materi yang dikumpulkan telah dicatat

memiliki izin oleh Dr. Jayaraman, PARC, Chennai dan Spesimen voucher

(PARC / 2011/688) dari tanaman ini disimpan di kampus, untuk referensi

lebih lanjut. Bahan tanaman dikeringkan di tempat rindang dan tanah

dengan benar. Bubuk tanaman diekstraksi dengan metanol menggunakan

alat soxhlet (MESI).

* Bahan Kimia

Semua bahan kimia, reagen yang digunakan dalam penelitian ini telah

diperoleh dari SDFine Chem. Ltd Mumbai. Quercetin telah diperoleh dari

Sigma Aldrich, USA.

2.2.2 Cara Kerja

a. Skrining Fitokimia

Sebelum dilakukan skrining fitokimia, Sopohora interrupta dibuat

menjadi crude extract dengan cara bahan tanaman dikeringkan di tempat

rindang dan tanah dengan benar. Kemudian bubuk tanaman yg telah

dibungkus dengan kertas saring diekstraksi dengan metanol menggunakan alat

soxhlet (MESI) dan ditunggu hingga terjadi sirkulasi. Selanjutnya dilakukan

skrining fitokimia dimana ekstrak methanol dari Sophora interrupta diuji

untuk mengetahui konstituen kimia yg ada.

b. Penentuan Kandungan Fenol Total

Mengikuti literatur dan hasil awal skrining kimia tanaman bagi

tumbuhan mengandung polifenol, telah diuji untuk memperkirakan kandungan

phenolic keseluruhan. Hal ini diukur kolorimetri menggunakan kuersetin dan

Reagen FC (Folin Ciocault ) (Mariela González et al., 2003). Prosedur

pengerjaan dengan metode menggunakan Folin Ciocalteu sebagai berikut :

Reagen terdiri dari 100 ml natrium tungstat dihidrat, 25 ml natrium molibdat

dihidrat, 50 ml dari 85% larutan asam fosfat dan 100 ml 36% larutan asam

klorida. Volume larutan kontrol yang digunakan berkisar antara 5 ml sampai

400 ml; 2 ml larutan Na2CO3 15% dan 0,5 ml reagen ditambahkan ke

masing-masing. Akhirnya, air suling ditambahkan sampai volume akhir 10 ml

tercapai. Persiapan dipanaskan selama lima menit dalam 50 ° C bak air

termostatik. Setelah pendinginan pada suhu kamar, absorbansi diukur pada

765 nm yg merupakan λ max dari Sophora interrupta (Mariela González et

al., 2003)..

c. Pembuatan Kurva Kalibrasi Quercetin

1 mg kuersetin ditimbang dan dilarutkan dalam 100 ml air suling dan

pengenceran berturut dilakukan untuk membuat konsentrasi 2,4,6,8 dan 10 ug

/ ml Volume dari aliquot atas diambil dan dicampur dengan 1,25 ml Reagen

FC (Folin-Ciocalteu). Hal tersebut dilakukan selama 5 menit. Kemudian 2,5

ml natrium karbonat ditambahkan dan itu dibiarkan bereaksi selama 30 menit

agar dapat bereaksi sempurna kemudian volume dibuat sampai dengan 10 ml.

Maka absorbansi diukur pada 765 nm. Kurva kalibrasi ditarik memplot

absobansi dan konsentrasi.

d. Preparasi sampel

0.5 g ekstrak metanol ditimbang dan dilarutkan dalam 100 ml air untuk

melarutkan ekstrak tersebut. Dari 0.1 ml ini dibawa ke 10 ml labu ukur dan

1.25ml dari Reagen FC ditambahkan dan biarkan bereaksi selama 5 lalu 2.5

ml natrium karbonat ditambahkan dan volume dibuat hingga 10 ml. itu

disimpan selama 30 menit agar dapat bereaksi sempurna untuk reaksi lengkap.

Sekarang absorbansi diukur pada 765 nm. Total kandungan fenolik dihitung

dari kurva kalibrasi kuersetin dan nilai dinyatakan dalam ekuivalen dengan

kuersetin.

PEMBAHASAN METODE

a. Skrining Fitokimia

Sebelum dilakukan skrining fitokimia, Sopohora interrupta dibuat menjadi

crude extract dengan cara bahan tanaman dikeringkan di tempat rindang dan

tanah dengan benar. Tujuan dari pengeringan dan ditempatkan di tempat yg

rindang utk memisahkan pengotornya (Zuhra,2006). Kemudian bubuk tanaman

yg telah dibungkus dengan kertas saring diekstraksi dengan metanol

menggunakan alat soxhlet (MESI) dan ditunggu hingga terjadi sirkulasi. Bubuk

tanaman Sophora interrupta diekstrasi dengan methanol menggunakan alat

soklet karena berdasarkan sifat fisiko kimia pada Sophora interrupta, memiliki

sifat tahan terhadap pemanasan sehingga ekstraksi dapat dilakukan dengan cara

soxhletasi dan Pemilihan metanol sebagai cairan penyari karena sifatnya yang

mampu melarutkan hampir semua zat, baik yang bersifat polar, hingga semi polar

serta kemampuannya untuk mengendapkan protein dan menghambat kerja enzim

sehingga dapat terhindar dari proses hidrolisis dan oksidasi (Harborne, 1996).

Selain itu sifat methanol yang mudah menguap, dengan titik didih sangat jauh

dibawah titik didih Sophora interrupta, sehingga saat melakukan metode

soxhletasi, suhu pemanasan dapat diatur agar dapat menguapkan methanol tanpa

ikut menguapkan senyawa dalam Sophora interrupta dan sirkulasi dapat terjadi.

Selanjutnya dilakukan skrining fitokimia dimana ekstrak methanol dari Sophora

interrupta diuji untuk mengetahui konstituen kimia yg ada.untuk mengetahui

konstituen yg ada dalam tanaman Sophora interrupta dapat digunakan beberapa

pereaksi kimia, alkaloid (Draggendorff ), flavonoid (reaksi Shibata), saponin (uji

buih), tanin (5% klorida), terpenoid (2,4-dinitrofenilhidrazin), glikosida (Larutan

Fehling), steroid (uji Burchard Liebermann) dan antrakuinon ( Uji Borntrager )

(Edeogal et al. 2005)

b. Penentuan Kandungan Fenol Total

Mengikuti literatur dan hasil awal skrining kimia tanaman bagi tumbuhan

mengandung polifenol, telah diuji untuk memperkirakan kandungan phenolic

keseluruhan. Hal ini diukur kolorimetri menggunakan kuersetin dan Reagen FC

(Folin Ciocault ) (Mariela González et al., 2003). Prosedur pengerjaan dengan

metode menggunakan Folin Ciocalteu sebagai berikut : Reagen terdiri dari 100

ml natrium tungstat dihidrat, 25 ml natrium molibdat dihidrat, 50 ml dari 85%

larutan asam fosfat dan 100 ml 36% larutan asam klorida. Volume larutan

kontrol yang digunakan berkisar antara 5 ml sampai 400 ml; 2 ml larutan

Na2CO3 15% dan 0,5 ml reagen ditambahkan ke masing-masing. Akhirnya, air

suling ditambahkan sampai volume akhir 10 ml tercapai. Persiapan dipanaskan

selama lima menit dalam 50 ° C bak air termostatik. Setelah pendinginan pada

suhu kamar, absorbansi diukur pada 765 nm yg merupakan λ max dari Sophora

interrupta (Mariela González et al., 2003).. Digunakannya reagen Folin-

Ciocalteu karena ekstrak methanol Sophora interrupta mengandung polifenol

setelah dilakukan skrining fitokimia dan merupakan metode yg paling stabil dan

reprodusibel Polifenol dalam ekstrak tumbuhan bereaksi dengan reagen redoks

tertentu (Folin Ciocalteu) untuk membentuk kompleks biru yang dapat diukur

dengan spektrofotometri cahaya tampak. Metode Folin Ciocalteu dijelaskan

dalam beberapa farmakope. Reaksi membentuk kromofor biru dibentuk oleh

kompleks phosphomolybdenum-fosfotungstat, di mana penyerapan maksimum

kromofor tergantung pada larutan alkali dan konsentrasi senyawa fenolik

(Blanski et al, 2013)

c. Pembuatan Kurva Kalibrasi Quercetin

1 mg kuersetin ditimbang dan dilarutkan dalam 100 ml air suling dan

pengenceran berturut dilakukan untuk membuat konsentrasi 2,4,6,8 dan 10 ug /

ml. Tujuan pengenceran berturut agar dapat diperoleh absorbansi dengan rentang

0,2-0,8 (Gandjar & Rohman, 2007) dan pembuatan larutan seri dilakukan untuk

membuat kurva kalibrasi. Volume dari aliquot atas diambil dan dicampur dengan

1,25 ml Reagen FC untuk membentuk kompleks biru yang dapat diukur dengan

spektrofotometri cahaya tampak. Hal tersebut dilakukan selama 5 menit.

Kemudian 2,5 ml natrium karbonat ditambahkan dan itu dibiarkan bereaksi

selama 30 menit agar dapat bereaksi sempurna kemudian volume dibuat sampai

dengan 10 ml. Maka absorbansi diukur pada 765 nm. Kurva kalibrasi ditarik

memplot absobansi dan konsentrasi.Tujuan pembuatan kurva kalibrasi adalah

untuk menetapkan kadar fenol total yg terkandung dalam sampel tanaman

d. Preparasi sampel

0.5 g ekstrak metanol ditimbang dan dilarutkan dalam 100 ml air untuk

melarutkan ekstrak tersebut. Dari 0.1 ml ini dibawa ke 10 ml labu ukur dan

1.25ml dari Reagen FC ditambahkan dan biarkan bereaksi selama 5 menit untuk

membentuk kompleks biru yang dapat diukur dengan spektrofotometri cahaya

tampak. lalu 2.5 ml natrium karbonat ditambahkan dan volume dibuat hingga 10

ml. itu disimpan selama 30 menit agar dapat bereaksi sempurna untuk reaksi

lengkap. Sekarang absorbansi diukur pada 765 nm. Total kandungan fenolik

dihitung dari kurva kalibrasi kuersetin dan nilai dinyatakan dalam ekuivalen

dengan kuersetin.

PUSTAKA

Blanski, A, G.C Lopez, J.C Pallazo De Melo. 2013. Application and Analysis of

the Folin Ciocalteu Method for the Determination of the Total Phenolic

Content from Limonium Brasiliense L. Molecules 2013, 18, 6852-6865

Gandjar, I. dan A. Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka

Pelajar.

Edeoga1, H.O., Okwu, D.E., Mbaebie, B.O., 2005. Phytochemical constituents of

some Nigerian medicinal plants. African Journal of Biotechnology 4, 685–

688.

Mariela González, Roxana Rudyk, Elida Romano, María AA. Molina.

Spectrophotometric Determination of PhenolicCompounds in Propolis. Lat.

Am. J. Pharm., 22 (3), 2003, 243-248.

Zuhra, C.F. 2006. ETANOLISIS MINYAK DEDAK PADI YANG DIEKSTRAKSI

SECARA PERENDAMAN. Jurnal Sains Kimia.Vol 10 No 1 Tahun 2006