ResiduFiltrat

FraksinasiPenentuan kadar protein

Lampiran 1. Bagan Kerja Isolasi Enzim Amilase dari Akar Rimpang Alang-Alang

29

Uji aktivitas

Akar rimpang alang-alang(sudah dipotong-potong kecil)

• Ditambahkan buffer fosfat 0,2 M pH 6,0 secukupnya

• dihancurkan • dibiarkan selama ± 30 menit• disaring

• diukur volumenya • disentrifugasi dengan kecepatan

6000 rpm (30’, 4 oC)

Supernatan (ekstrak enzim amilase)

Ampas akar rimpang alang-alang

dilarutkan ke dalam 100 mL akuadesdiaduk dipanaskan

substratlarutan pati 2%

diambil masing-masing 1 mL ke dalam 6 tabung reaksiditambahkan 0,5 mL larutan ekstrak amilasediinkubasi pada suhu 35 oC, masing- masing diinkubasi selama 10; 20; 30; 40; 50; dan 60 menit didinginkanditambahkan 2 tetes larutan iodin 1%

Data

2 g pati

Lampiran 2. Bagan Kerja Uji Aktivitas Enzim Amilase secara Kualitatif menggunakan Larutan I2

30

diambil 1 mLdimasukkan ke tabung reaksidi+ 1 mL larutan pati 2% dan 1 mL larutan buffer fosfat 0,2 M pH 6,0diinkubasi pada suhu 35oC selama waktu optimumdinonaktifkan pada suhu 100oC selama 5-10’didinginkan

Larutan Campuran**

diambil 1 mLdi+ 1 mL Nelson-SomogyiDididihkan 5’didinginkandi+ 1 mL arsenomolibdat dan 7 mL air suling dihomogenkandiukur absorbansinya pada λmaks

Data

Ekstrak Enzim dari akarRimpang alang-alang*

Lampiran 3. Bagan Kerja Uji Aktivitas Amilase secara Kuantitatif Metode Nelson-Somogyi

Ket.: dilakukan juga perlakuan yang sama untuk larutan blanko* dan larutan standar glukosa**

31

diambil 1 mLdimasukkan dalam tabung reaksidi+ 5 mL pereaksi Lowry B dihomogenkandidiamkan pada suhu kamar (10’-15’)di+ 1 mL pereaksi Lowry Adihomogenkandidiamkan pada suhu kamar (30 ‘)di+ 3 mL akuades diukur absorbansinya pada λmaks

Data

Larutan Ekstrak Enzim dari akar rimpang alang-alang

Lampiran 4, Bagan Kerja Penentuan Kadar Protein Enzim Amilase dari Akar Rimpang Alang-Alang Metode Lowry

Ket.: dilakukan juga perlakuan yang sama untuk larutan blanko dan larutan standar BSA

32

Lampiran 5. Bagan Kerja Fraksinasi dengan Amonium Sulfat Metode Bollag dan Edelstein

33

ekstrak enzim amilase dari akar rimpang alang-alang

dilarutkan ke dalam larutan buffer fosfat 0,2 M pH 6,0 (secukupnya)di masukkan dalam membran selofan

Larutan enzim dalam membran selofan

Fraksi enzim(fraksi dengan aktivitas tertinggi)

di dialisis dalam buffer fosfat 0,05 M pH 6,0 diaduk dengan magnetik stirer pada suhu 5 oC buffernya diganti setiap 3 jam dialisis berakhir jika buffer sudah tidak berwarna lagi Membran selofan dikeluarkan dari buffer larutan enzim dikeluarkan dari membran selofan lalu dimasukkan ke dalam vial

Enzim amilase murni

diuji aktivitasnya dihitung kadar proteinnya

Data

Lampiran 6. Bagan Kerja Dialisis dalam Membran Selofan

34

• di+ amonium sulfat dengan tingkat kejenuhan 0-20%

• disentrifugasi dengan kecepatan 10000rpm pada suhu 4oC

Fraksi enzim (F1)

• di+ amonium sulfat dengan tingkat kejenuhan 20-40%• disentrifugasi dengan kecepatan 10000rpm

pada suhu 4oC

Supernatan (S1)

Fraksi enzim (F2)Supernatan (S2)

• di+ amonium sulfat dengan tingkat kejenuhan 40-60%

• disentrifugasi dengan kecepatan 10000rpm pada suhu 4oC

Fraksi enzim (F3)Supernatan (S3)

• di+ amonium sulfat dengan tingkat kejenuhan 60-80%

• disentrifugasi dengan kecepatan 10000rpm pada suhu 4oC

Fraksi enzim (F4)Supernatan (S4)

• Tiap fraksi dilarutkan dalam buffer fosfat 0,1 M pH 6,0

• diuji aktivitasnya

Fraksi dengan aktivitas tertinggi di dialisis

Lampiran 7. Bagan Kerja Karakterisasi Enzim Amilase Hasil Dialisis

35

Enzim Amilase

1 2 3

Dilakukan uji aktivitas pada

variasi konsentrasi substrat yaitu: 1,5-

4,0 mg/mL

Dilakukan uji aktivitas pada variasi suhu yaitu: 25, 30, 35,40,45 oC

Dilakukan uji aktivitas pada

variasi pH buffer fosfat 0,2 M yaitu:

pH 5,2-7

Konsentrasi substrat optimum

Suhu optimum pH optimum

Lampiran 8. Tabel Kejenuhan Amonium Sulfat

36