BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. SINTESIS DAN … DNA dikatakan spesifik dan berhasil diamplifikasi...

41

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. SINTESIS DAN AMPLIFIKASI FRAGMEN GEN tat HIV-1 MELALUI

TEKNIK PCR OVERLAPPING

1. Sintesis dan amplifikasi fragmen ekson 1 dan 2 gen tat HIV-1

Visualisasi gel elektroforesis 1,5% (b/v) selama 45 menit dengan

voltase 100 V terhadap produk PCR tahap pertama menunjukkan

terbentuknya pita DNA tunggal berukuran 236 pb untuk ekson 1 dan 110 pb

untuk ekson 2 (Gambar 11). Hasil visualisasi tersebut (Gambar 11) sesuai

dengan analisis pendahuluan terhadap panjang fragmen gen tat HIV-1 yang

akan disintesis (lihat Cara Kerja 2; Gambar 8). Berdasarkan visualisasi

tersebut, maka fragmen DNA target diperkirakan telah berhasil disintesis

secara spesifik. Settanni dkk. (2006: 3794) menyatakan bahwa suatu sampel

DNA dikatakan spesifik dan berhasil diamplifikasi apabila hasil analisis

elektroforesis menunjukkan terdapatnya pita tunggal DNA dengan ukuran

sesuai berdasarkan penanda yang telah diketahui sebelumnya.

Pasangan primer untuk sintesis fragmen gen tat HIV-1 dirancang

dengan tambahan situs restriksi. Primer Ex1-TatpNL4 dirancang memuat

situs restriksi XmaI pada ujung 5’ OH, sedangkan pada ujung 5’ OH primer

Ex2-TatpNL4C memuat situs restriksi SalI. Penambahan situs restriksi pada

fragmen gen tat HIV-1 hasil PCR bertujuan supaya fragmen dapat disisipkan

Sintesis dan..., Ekawati Betty Pratiwi, FMIPA UI, 2008

42

ke dalam multiple cloning site (MCS) plasmid pQE-80L untuk proses

pengklonaan (Dieffenbach dkk. 1993: 32).

Sintesis fragmen gen tat HIV-1 dalam penelitian dilakukan

menggunakan cetakan DNA pNL43 [accession number M19921.1] (koleksi

Departemen Mikrobiologi FKUI). Penggunaan klona molekular pNL43

berdasarkan Pavlakis & Felber (1999: 1) bahwa bahwa klona molekular

pNL43 memiliki similaritas dengan strain referensi standar HIV-1, yaitu strain

HXB2 [accession number K03455.1]. Strain HXB2 merupakan strain HIV-1

subtipe B pertama yang berhasil diidentifikasi dan dijadikan strain standar

referensi (strandard reference strain) dalam penelitian terhadap HIV-1

(Korber dkk. 2001: 25). Berdasarkan hal tersebut maka diperkirakan protein

Tat yang dihasilkan dapat digunakan untuk identifikasi HIV-1 di Indonesia.

Produk PCR pertama yang akan digunakan sebagai cetakan untuk

PCR overlapping tidak dipurifikasi terlebih dahulu. Kanoksilapatham dkk.

(2007: 7) menyatakan bahwa purifikasi produk PCR pertama sebagai DNA

cetakan dalam PCR overlapping diperlukan untuk menghilangkan sisa-sisa

komponen reaksi pada PCR pertama yang mungkin mengganggu reaksi

amplifikasi pada PCR overlapping. Hal tersebut dianggap tidak perlu untuk

dilakukan pada penelitian sebab hanya diperoleh pita tunggal dengan ukuran

yang sesuai pada hasil PCR masing-masing ekson (Gambar 11). Produk

PCR pertama yang tidak dipurifikasi dapat memperbesar kemungkinan

terbentuknya pita non-spesifik sebagai hasil PCR overlapping. Hasil tersebut

dapat diperoleh karena masih adanya primer overlap yang tersisa, sehingga


43

pada reaksi PCR berikutnya tidak diperoleh produk full-length, melainkan

produk dengan ukuran yang sama atau lebih besar dari yang diharapkan.

2. Sintesis fragmen gen tat HIV-1 full-length

Visualisasi hasil optimasi produk PCR overlapping pada gel agarosa

1,5% menunjukkan bahwa suhu annealing optimum adalah 64° C (Gambar

12.a). Hal tersebut ditentukan berdasarkan perbandingan ketebalan pita

DNA hasil elektroforesis. Visualisasi gel elektroforesis (Gambar 12.a)

memperlihatkan bahwa di antara 4 suhu annealing yang dioptimasi, pita

tunggal DNA berukuran sekitar 316 pb yang paling tebal terbentuk pada suhu

64° C. Sauer dkk. (1998: 25) menyatakan bahwa kuantitas dan kualitas

produk DNA dapat diketahui secara langsung dan mudah melalui

elektroforesis. Ketebalan pola pita DNA yang terbentuk merupakan

parameter untuk menentukan hal tersebut, pola pita DNA tebal dan spesifik

menunjukkan bahwa produk PCR telah diamplifikasi dengan baik. Fragmen

ekson 1 gen tat HIV-1 berukuran 236 pb dan ekson 2 berukuran 110 pb

dengan masing-masing fragmen memiliki 10 basa yang overlap, sehingga

saat terjadi proses PCR overlapping diharapkan terbentuk fragmen gen tat

HIV-1 dengan ukuran sekitar 326 pb.

Temperature of melting (Tm) dari dua primer overlap dalam sintesis

fragmen gen tat HIV-1 adalah 64° C. Sambrook & Russell (2001b: 8.8)

menyatakan bahwa suhu annealing PCR umumnya 3--5° C di bawah suhu

Tm. Menurut Young & Dong (2004: 1) PCR overlapping dapat terjadi jika


44

selisih titik leleh antara dua primer overlap tidak terlalu jauh atau bahkan

sama, sehingga kedua daerah overlap pada masing-masing untai DNA dapat

saling melekat. Penelitian pendahuluan menggunakan suhu annealing 62° C

selama 30 detik menunjukkan terbentuknya pita DNA non spesifik.

Berdasarkan pernyataan tersebut maka optimasi kondisi annealing terhadap

PCR overlapping fragmen gen tat HIV-1 dilakukan pada suhu di atas Tm

kedua primer overlap yaitu pada 64° C, 66° C, dan 68° C. Menurut Ahmed

(2006: 118) optimasi kondisi PCR perlu dilakukan terlebih dahulu untuk

mendapatkan kondisi PCR yang tepat. Optimasi kondisi annealing PCR

overlapping dilakukan untuk mendapatkan produk PCR spesifik.

Kondisi annealing yang tepat untuk PCR overlapping adalah pada

suhu 64° C selama 45 menit. Hal tersebut dapat diketahui dari terbentuknya

pita DNA paling tebal pada kondisi PCR tersebut (Gambar 12.b) . Optimasi

waktu annealing dilakukan pada kisaran 15 detik, 30 detik, 45 detik, dan 1

menit. Pemilihan kisaran waktu tersebut dilakukan berdasarkan pernyataan

Ahmed (2006: 119) bahwa waktu annealing yang tepat untuk PCR berkisar

antara 30--60 detik.

Gambar 12a & 12b menunjukkan perbedaan intensitas pendaran

warna pita DNA dari hasil PCR. Kedua produk PCR tidak dielektroforesis

pada waktu bersamaan dan gel yang digunakan pun tidak dibuat pada saat

yang sama. Hal tersebut kemungkinan menjadi penyebab perbedaan

intensitas pita DNA antara kedua produk PCR, walaupun DNA cetakan yang

digunakan sama. Gel agarosa dari Gambar 12a mengalami proses


45

pewarnaan yang lebih lama dibandingkan Gambar 12b. Perbedaan lamanya

waktu pewarnaan gel pada larutan etidium bromida juga menjadi sebab

terjadinya perbedaan intensitas pita DNA. Konsentrasi marka DNA yang

digunakan pada kedua gel agarosa (Gambar 12a & 12b) adalah sama,

sehingga kemungkinan kedua produk PCR akan memperlihatkan intensitas

pita DNA yang sama jika dielektroforesis secara bersamaan menggunakan

satu gel saja.

Visualisasi produk PCR overlapping melalui elektroforesis gel agarosa

menunjukkan terbentuknya pita tunggal DNA berukuran sekitar 326 pb

(Gambar 13). Hasil analisis elektroforesis tersebut menunjukkan bahwa

diperkirakan fragmen gen tat HIV-1 telah berhasil disintesis dan diamplifikasi

secara spesifik. Hasil PCR overlapping yang spesifik dapat dipengaruhi oleh

rancangan daerah overlap pada primer. Sejumlah 20 basa pada pasangan

primer Ex1-TatpNL4C dan Ex2-TatpNL4 dirancang overlap terhadap fragmen

gen tat HIV-1 yang akan digabungkan (Tabel 1). Hal tersebut sesuai dengan

penelitian An dkk. (2007: 3) yang melaporkan bahwa pasangan primer

optimal untuk overlapping PCR memiliki panjang antara 27--39 pb, dengan

daerah overlap minimal 15 basa. Daerah overlap yang terlalu panjang dapat

menyebabkan terbentuknya produk PCR tidak spesifik.

Siklus PCR overlapping pada penelitian adalah sebanyak 37 kali. Hal

tersebut tidak sesuai dengan siklus PCR overlapping umumnya. Sintesis

DNA menggunakan teknik PCR overlapping umumnya dilakukan sebanyak

15--25 siklus. Hal tersebut bertujuan untuk mencegah terbentuknya fragmen


46

non-spesifik pada produk PCR (Xiong dkk. 2004: 2). Jumlah siklus PCR

pada penelitian diperkirakan cukup baik untuk mendapatkan banyak produk

PCR dengan ukuran sesuai, hal tersebut dapat diketahui dari visualisasi gel

elektroforesis yang menunjukkan terbentuknya pita tunggal DNA dengan

ukuran sesuai (Gambar 13).

Enzim Platinum Taq DNA polymerase yang digunakan untuk PCR

overlapping bukan merupakan high-fidelity DNA polymerase. Penggunaan

enzim tersebut untuk PCR overlapping berlawanan dengan sebagian besar

penelitian PCR overlapping. Beberapa penelitian mengenai PCR overlapping

melaporkan bahwa hasil dari PCR overlapping akan lebih baik jika reaksi

PCR dikatalis oleh high-fidelity DNA polymerase, seperti Pfu DNA

polymerase, karena enzim tersebut memiliki spesifisitas lebih tinggi

dibandingkan Taq DNA polymerase standar (An dkk. 2007: 3; Young & Dong

2004: 2; Xiong dkk. 2004: 6). Platinum Taq DNA polymerase yang digunakan

dalam penelitian memiliki aktivitas hot start, yaitu enzim akan diaktifkan

setelah suhu denaturasi dari siklus PCR mencapai 94° C (Invitrogen 2002: 1).

Berdasarkan hal tersebut diharapkan aktivitas ”hot start” yang dimiliki

Platinum Taq DNA polymerase dapat meningkatkan spesifitas, sensitivitas,

dan jumlah produk PCR (Ausubel dkk. 2002: 15.1). Visualisasi produk PCR

overlapping menunjukkan bahwa penggunaan enzim tersebut kemungkinan

tidak mempengaruhi hasil PCR, sebab tidak terdapat pita DNA berukuran

selain 326 pb. Visualisasi produk PCR melalui elektroforesis gel tersebut


47

perlu diverifikasi lebih lanjut melalui proses sequencing untuk mengetahui

akurasi dari jumlah siklus PCR dan enzim polimerase DNA yang digunakan.

Hasil purifikasi produk PCR menggunakan Qiagen PCR purification kit

menunjukkan bahwa pita DNA produk PCR hasil purifikasi lebih bersih dan

tidak smear (Gambar 13.b). Purifikasi DNA tersebut menggunakan metode

membran silika yang merupakan salah satu metode untuk membersihkan

DNA dari berbagai kontaminan, misalnya enzim, protein, ataupun senyawa

kimia lainnya (Ausubel dkk. 2002: 2.1.1).

Hasil pengukuran konsentrasi produk PCR yang telah dipurifikasi

adalah sebesar 80 ng/μl (Tabel 2). Kemurnian DNA dihitung dengan

membandingkan nilai absorbansi pada λ 260 nm dan 280 nm (Seidman &

Mowery 2006: 5). Kemurnian DNA didapatkan sebesar 1,33, sedangkan

menurut Seidman & Mowery (2006: 5), tingkat kemurnian DNA yang baik

adalah 1,8. Tingkat kemurnian di bawah 1,8 menunjukkan kemungkinan

adanya kontaminasi protein pada DNA hasil purifikasi. Kemurnian produk

PCR yang rendah dapat disebabkan oleh proses purifikasi yang tidak baik,

atau terdapat kontaminan dalam produk PCR hasil purifikasi, sehingga

mempengaruhi pengukuran konsentrasi DNA pada spektrofotometer.

Kontaminasi protein pada produk PCR tidak dapat diketahui melalui

visualisasi gel elektroforesis, hal tersebut disebabkan protein tidak terwarnai

oleh etidium bromida yang merupakan pewarna dalam visualisasi

elektroforesis DNA (Raymer & Smith 2007: 746).


48

B. PENGKLONAAN FRAGMEN GEN tat HIV-1 KE DALAM VEKTOR

EKSPRESI pQE-80L

1. Konstruksi vektor rekombinan pQE-80L pembawa fragmen gen tat HIV-1

Visualisasi hasil isolasi plasmid pQE-80L pada gel agarosa 0,8% (b/v)

menunjukkan terbentuknya dua pita DNA (Gambar 14). Dua pita DNA

tersebut menunjukkan variasi bentuk dari plasmid pQE-80L. Pita DNA yang

berada paling bawah menunjukkan plasmid dengan bentuk supercoiled. Pita

DNA di atas bentuk supercoiled adalah bentuk nicked circle. Pita DNA

supercoiled memiliki tingkat migrasi yang paling cepat dibandingkan bentuk

DNA plasmid lainnya, sehingga pada hasil elektroforesis akan berada pada

posisi lebih rendah dibandingkan bentuk DNA plasmid lainnya, misalnya

nicked circle (Edvotek 2001b: 6). Pita DNA dengan bentuk supercoiled

terlihat lebih tebal dibandingkan nicked circle. Hal tersebut sesuai dengan

pernyataan Ausubel dkk. (2002: 16.22.13) bahwa bahan-bahan untuk

ekstraksi DNA plasmid yang disediakan secara komersial umumnya

dirancang untuk dapat menghasilkan DNA supercoiled dalam jumlah lebih

banyak dibandingkan topologi plasmid lainnya.

Hasil pengukuran konsentrasi DNA plasmid adalah sebesar 70 ng/μl

(Tabel 2) dengan kemurnian sebesar 1,4. Seidman & Mowery (2006: 5)

menyatakan bahwa kemurnian DNA dihitung melalui absorbansi larutan DNA

pada dua panjang gelombang, biasanya λ 260 nm dan 280 nm. Nilai

kemurnian DNA yang baik adalah 1,8. Nilai kemurnian yang kurang dari 1,8


49

menunjukkan bahwa DNA terkontaminasi oleh zat pengotor, misalnya

protein. Hal tersebut dapat terlihat dari visualisasi hasil isolasi vektor plasmid

pQE-80L pada Gambar 14 yang hanya memberikan hasil dua pita DNA,

tanpa adanya smear. Hal tersebut menunjukkan bahwa kemungkinan tidak

terdapat kontaminan berupa RNA yang terdegradasi dalam DNA plasmid.

RNA yang terdegradasi akan bergerak lebih cepat pada saat proses

elektroforesis, sehingga adanya RNA sebagai kontaminan dapat diketahui

dari terbentuknya pola pita yang terang pada bagian paling bawah dari gel

elektroforesis (Sauer 1998: 25).

Plasmid pQE-80L dan fragmen gen tat HIV-1 hasil PCR yang telah

dipurifikasi kemudian didigesti dengan enzim restriksi XmaI dan SalI. Kedua

enzim tersebut digunakan karena sesuai dengan fragmen gen tat HIV-1 yang

dirancang membawa situs restriksi untuk enzim SalI dan XmaI,dan sesuai

dengan situs restriksi yang terdapat pada Multiple Cloning Site (MCS) vektor

plasmid pQE-80L (Qiagen 2003: 116). Hasil pengukuran konsentrasi DNA

plasmid pQE-80L dan fragmen gen tat HIV-1 hasil PCR (Tabel 2) tidak

digunakan untuk menghitung rasio DNA untuk proses digesti. Konsentrasi

DNA plasmid dan produk PCR hanya digunakan untuk mengetahui bahwa

terdapat cukup banyak DNA untuk didigesti dan mengetahui kemurnian dari

DNA vektor dan sisipan.

Visualisasi hasil digesti pada gel agarosa 1,2% (b/v) menunjukkan

terbentuk satu pita DNA untuk fragmen gen tat HIV-1 dan dua pita DNA untuk

vektor pQE-80L (Gambar 15). Pita DNA yang terbentuk memiliki ukuran


50

sekitar 316 pb untuk fragmen gen tat HIV-1 dan 4700 pb untuk DNA vektor.

Hasil visualisasi proses digesti menunjukkan bahwa proses digesti untuk

vektor tidak berlangsung sempurna karena terdapat dua pita DNA.

Pemotongan plasmid yang tidak sempurna dapat terjadi karena proses isolasi

plasmid tidak berlangsung baik, sehingga terdapat kontaminan pada hasil

isolasi. Kontaminan tersebut kemungkinan ikut terbawa di dalam campuran

reaksi digesti dan menghambat aktivitas enzim restriksi. Menurut Ausubel

dkk. (2002: 3.1.7), pemotongan plasmid yang tidak sempurna dapat

disebabkan oleh adanya kontaminan berupa protein, fenol, kloroform, etanol,

EDTA, SDS, atau konsentrasi garam yang tinggi, sehingga aktivitas enzim

restriksi menjadi terhambat. Edvotek (2001a: 6) menyatakan bahwa plasmid

akan berada dalam bentuk linear jika didigesti dengan enzim restriksi,

sehingga visualisasi pada elektroforesis gel seharusnya hanya akan

menghasilkan satu pola pita DNA.

Nilai kemurnian DNA plasmid hasil digesti adalah 1. Kemurnian dari

fragmen gen tat HIV-1 adalah 2,3. Hal tersebut menunjukkan bahwa masih

terdapat kontaminasi protein ataupun fenol pada DNA plasmid yang telah

didigesti, dan terdapat kontaminasi RNA pada fragmen gen tat HIV-1

(Seidman & Mowery 2006: 5). Hasil spektrofotometri menunjukkan

konsentrasi DNA plasmid pQE-80L yang telah didigesti adalah 180 ng/µl,

sedangkan konsentrasi fragmen gen tat HIV-1 adalah 150 ng/ µl (Tabel 3).

Hasil pengukuran konsentrasi DNA plasmid dan produk PCR sebelum dan

sesudah didigesti menunjukkan perbedaan nilai (Tabel 2 & 3). Konsentrasi


51

kedua jenis DNA tersebut meningkat setelah didigesti. Hal tersebut dapat

terjadi akibat masih adanya pengotor seperti enzim, protein, RNA ataupun

komponen buffer pada DNA yang telah dipurifikasi, sehingga semua pengotor

tersebut ikut meningkatkan konsentrasi DNA saat proses pengukuran.

Fragmen gen tat HIV-1 kemudian disisipkan ke dalam vektor pQE-80L

dan diligasi melalui directional cloning. Proses directional cloning dilakukan

untuk membuat orientasi plasmid rekombinan hanya satu arah (spesifik) dan

memperkecil kemungkinan vektor beresirkulasi (Lewin 2006: 583). Jumlah

DNA sisipan dan vektor yang digunakan dalam ligasi pada penelitian adalah

150 ng/µl dan 180 ng/µl . Volume DNA sisipan dan vektor untuk reaksi ligasi

dalam penelitian adalah masing-masing sebanyak 2 µl. Promega (1999: 6)

menyebutkan bahwa rasio DNA vektor dan sisipan untuk ligasi umumnya

adalah 1:3. Berdasarkan Lampiran 2, seharusnya volume DNA sisipan untuk

reaksi ligasi adalah 0,24 µl. Volume DNA sisipan yang lebih besar daripada

penghitungan diharapkan memperbesar kemungkinan ligasi DNA vektor dan

sisipan, sehingga jumlah plasmid rekombinan juga semakin banyak.

2. Transformasi plasmid rekombinan

Hasil ligasi vektor pQE-80L dengan fragmen gen tat HIV-1 langsung

ditransformasi dan diseleksi pada medium LB padat (+ampisilin).

Transformasi dan seleksi merupakan tahapan yang harus dilakukan untuk

mengetahui keberadaan fragmen gen tat HIV-1 dalam plasmid pQE-80L.


52

Proses transformasi hasil ligasi menunjukkan terbentuknya 81 koloni E. coli

TOP10 (Gambar 16).

Escherichia coli TOP10 yang digunakan sebagai sel inang dalam

transformasi terlebih dahulu dibuat kompeten dengan mensuspensikan

bakteri tersebut ke dalam larutan CaCl2 (Sambrook & Russell 2001a: 1.116--

1.118). Efisiensi transformasi dari sel E. coli TOP10 kompeten dihitung untuk

mengetahui kemampuan sel E. coli tersebut dalam menerima plasmid

sirkuler. Sambrook & Russell menyatakan (2001a: 1.24) bahwa proses

pembuatan sel kompeten menggunakan induksi larutan CaCl2 akan

menghasilkan nilai efisiensi transfomasi antara 105--106 cfu/µg DNA.

Efisiensi transformasi sel kompeten menggunakan plasmid pQE-80L adalah

2,568 x 105 cfu/µg (Lampiran 3). Hal tersebut menunjukkan bahwa sel

kompeten cukup baik untuk digunakan dalam transformasi.

Koloni E.coli yang tumbuh pada medium LB (+ampisilin) diduga

membawa plasmid rekombinan. Hal tersebut dilakukan karena vektor pQE-

80L memiliki gen bla yang membuat sel inang mampu hidup di lingkungan

yang mengandung ampisilin. Koloni bakteri yang mengandung DNA

rekombinan diharapkan dapat tumbuh pada medium selektif (Qiagen 2003:

15). Seleksi dengan medium mengandung ampisilin belum memastikan

bahwa koloni E.coli yang berhasil tumbuh pada medium membawa plasmid

rekombinan. Terdapat kemungkinan bahwa beberapa koloni mengandung

plasmid yang bersirkulasi. Hal tersebut dapat diketahui berdasarkan

tumbuhnya kontrol positif self-ligation. Proses directional cloning yang


53

dilakukan dalam penelitian seharusnya tidak menghasilkan kontrol positif self-

ligation yang berhasil tumbuh, hal tersebut dikarenakan proses digesti

menggunakan enzim restriksi yang berbeda seharusnya menghasilkan ujung

potongan yang tidak dapat saling berpasangan (Lewin 2006: 583).

C. ANALISIS DAN VERIFIKASI PLASMID REKOMBINAN

1. Isolasi plasmid rekombinan dari koloni transforman hasil ligasi

Sebanyak 15 dari 81 koloni E.coli TOP10 transforman hasil ligasi

diisolasi dengan metode alkali lisis. Visualisasi hasil isolasi plasmid pada gel

agarosa 0,8% menunjukkan bahwa 5 dari 15 koloni E.coli TOP10 positif

membawa plasmid rekombinan berisi sisipan fragmen gen tat HIV-1 (Gambar

17). Plasmid rekombinan akan berukuran 5016 pb, sedangkan plasmid pQE-

80L tanpa DNA sisipan memiliki ukuran 4700 pb. Ukuran DNA sisipan yang

kecil, yaitu sekitar 316 pb menjadi satu penyebab tidak terlalu terlihatnya

perbedaan pola migrasi antara plasmid rekombinan dengan plasmid kontrol

(tanpa sisipan).

Pola migrasi pita DNA dari plasmid rekombinan no. 10, 11, 12, 14, dan

15 terlihat sedikit lebih tinggi dibandingkan pola pita DNA plasmid tanpa

sisipan. Topcu (2000: 845) menyatakan bahwa hasil visualisasi positif

terhadap plasmid rekombinan adalah terdapatnya pita-pita DNA yang berada

lebih tinggi dari pita plasmid tanpa DNA sisipan, hal tersebut disebabkan oleh

berat molekular plasmid rekombinan yang lebih besar daripada plasmid tanpa


54

DNA sisipan, sehingga pergerakannya di dalam gel agarosa menjadi lebih

lambat.

Sebanyak 10 plasmid hasil isolasi lainnya memperlihatkan pita-pita

DNA berada pada posisi yang sama dengan pita DNA plasmid pQE-80L

tanpa DNA sisipan (Gambar 17). Plasmid-plasmid tersebut diduga tidak

membawa fragmen gen tat HIV-1 karena posisi pita DNA yang sama dengan

pita pQE-80L menunjukkan bahwa kemungkinan 10 plasmid tersebut

memiliki ukuran sama besar dengan pQE-80L, sehingga kemungkinan

fragmen gen tat HIV-1 tidak berhasil disisipkan ke dalam plasmid.

Ketidakberhasilan fragmen gen tat HIV-1 untuk terligasi ke dalam vektor pQE-

80L dapat diakibatkan oleh beberapa faktor, salah satunya vektor yang

beresirkulasi tanpa adanya DNA sisipan (Brown 2006: 87).

Fragmen gen tat HIV-1 dan vektor pQE-80L didigesti menggunakan

dua enzim restriksi yang tidak komplementer satu sama lain, sehingga

seharusnya resirkulasi vektor dapat dihindari (Lewin 2006: 583). Hasil

pemotongan DNA vektor yang memang tidak sempurna (Gambar 15)

menunjukkan adanya kemungkinan terjadi resirkulasi vektor. Adanya vektor

yang beresirkulasi dapat disebabkan oleh kurang optimalnya aktivitas salah

satu enzim yang digunakan untuk proses digesti. Kurang optimalnya kerja

enzim dapat disebabkan oleh tidak sesuainya buffer yang digunakan untuk

kedua jenis enzim tersebut. Enzim XmaI memiliki aktivitas optimal pada

buffer NE 4, sedangkan SalI memiliki aktivitas optimal pada buffer NE 3.

Proses digesti pada penelitian menggunakan buffer NE 4, sehingga terdapat


55

kemungkinan aktivitas SalI dalam memotong DNA menjadi tidak optimal

(Biolabs 1995: 16).

Sebanyak 5 dari 15 koloni yang diisolasi memiliki tiga pita DNA yang

terletak lebih tinggi daripada pita vektor tanpa DNA sisipan, sehingga

diperkirakan 5 koloni tersebut mengandung plasmid rekombinan. Tahap

lanjutan untuk memastikan kebenaran dugaan tersebut adalah melakukan

digesti terhadap plasmid rekombinan hasil isolasi.

2. Analisis digesti menggunakan enzim XmaI dan SalI

Analisis digesti terhadap rekombinan no. 10, 11, 12, 14, dan 15 yang

diduga membawa sisipan fragmen gen tat HIV-1 dilakukan menggunakan

enzim SalI dan XmaI. Multiple cloning sites (MCS) plasmid pQE-80L

memiliki situs restriksi SalI dan XmaI. Kedua jenis enzim tersebut akan

memotong plasmid rekombinan tepat pada titik ligasi, sehingga hasil

pemotongan akan menunjukkan dua pita DNA, masing-masing berukuran

sekitar 4700 pb (vektor) dan 316 pb (fragmen gen tat HIV-1) (Gambar 18).

Hasil pemotongan divisualisasikan pada gel agarosa 1,5% (b/v) karena gel

tersebut efektif dalam memisahkan fragmen DNA dengan ukuran 80 pb

sampai 4 kb (Sambrook & Russell 2001a: 5.6).

Plasmid rekombinan no. 10, 12, dan 14 menunjukkan hasil

pemotongan tepat seperti yang diharapkan (Gambar 19). Keberadaan

fragmen gen tat HIV-1 di dalam plasmid rekombinan dapat diketahui

berdasarkan adanya satu pita DNA berukuran sekitar 316 pb yang


56

menunjukkan bahwa fragmen tat HIV-1 berhasil disisipkan ke dalam vektor

pQE-80L. Pita DNA vektor pQE-80L akan berada pada bagian atas gel

elektroforesis karena memiliki ukuran yang lebih besar dibandingkan fragmen

gen tat HIV-1.

Visualisasi hasil analisis digesti pada gel agarosa 1,5% (b/v) terlihat

kurang jelas dalam menunjukkan keberadaan fragmen tat HIV-1, sehingga

dilakukan elektroforesis gel poliakrilamid untuk memperjelas visualisasi hasil

analisis digesti. Gel poliakrilamid yang digunakan adalah gel dengan

konsentrasi 8% (b/v), berdasarkan Ausubel dkk. (2002: 2.7.2) konsentrasi gel

tersebut efektif dalam memisahkan fragmen DNA berukuran 60--400 pb.

Melalui elektroforesis gel poliakrilamid 8% (b/v) diharapkan fragmen gen tat

HIV-1 dengan ukuran 316 pb dapat tervisualisasi lebih jelas.

Hasil elektroforesis gel poliakrilamid 8% (b/v) menunjukkan bahwa

plasmid rekombinan no. 12, 14, dan 15 positif membawa fragmen gen tat

HIV-1 (Gambar 19). Fragmen DNA plasmid pQE-80L berukuran 4700 pb,

sehingga pada elektroforesis gel agarosa dan poliakrilamid akan berada pada

bagian atas gel. Hal tersebut terjadi karena ukuran fragmen DNA terlalu

besar untuk melewati pori-pori gel poliakrilamid 8% (b/v) yang hanya mampu

memisahkan fragmen DNA berukuran 60--400 pb.

Visualisasi pada gel poliakrilamid memberikan hasil yang berbeda

dengan gel agarosa. Plasmid rekombinan no. 10 yang terlihat memiliki pita

DNA berukuran 316 pb pada visualisasi gel agarosa, ternyata tidak

menunjukkan terbentuknya pita DNA berukuran sama pada gel poliakrilamid.


57

Hal tersebut dapat disebabkan oleh tidak homogennya sampel pada saat

dimasukkan ke dalam sumur gel, ataupun karena pipetting error (Cambrex

2003 : 31).

Hasil elektroforesis gel poliakrilamid menunjukkan perbedaan pola

migrasi pada pita DNA yang dihasilkan oleh rekombinan no. 12, 14, dan 15.

Pita DNA dari ketiga rekombinan tersebut, walaupun memiliki tingkat migrasi

sedikit berbeda, tetap diidentifikasikan sebagai fragmen gen tat HIV-1 yang

berukuran 316 pb. Hal tersebut dapat dilihat dari pola pita plasmid pQE-80L

yang juga tidak sejajar antar sampel rekombinan. Perbedaan pola migrasi

dari ketiga pita DNA dapat disebabkan oleh konsentrasi gel poliakrilamid

yang tidak merata atau ada kemungkinan terdapat gelembung udara,

sehingga pergerakan pita DNA menjadi terganggu.

Gambar 19 memperlihatkan tidak ada pita DNA yang terpotong pada

plasmid rekombinan no. 11. Hasil tersebut bertentangan dengan visualisasi

hasil isolasi plasmid yang menunjukkan bahwa plasmid rekombinan no. 11

kemungkinan merupakan plasmid dengan DNA sisipan karena memiliki

tingkat migrasi lebih tinggi dibandingkan pQE-80L tanpa DNA sisipan. Pola

migrasi dari rekombinan no.11 juga terlihat sejajar dengan keempat

rekombinan yang diduga mengandung sisipan fragmen gen tat HIV-1.

Berdasarkan hal tersebut, plasmid rekombinan no.11 diduga tidak terpotong

oleh enzim restriksi. Hal tersebut mungkin dikarenakan adanya kalium

asetat, RNA, ataupun fenol sisa isolasi rekombinan pada campuran reaksi

digesti. Ausubel dkk. (2002: 1.6.2) menyatakan bahwa senyawa-senyawa


58

tersebut dapat mengganggu aktivitas enzim restriksi. Hal tersebut dapat

dihindari dengan mengulang purifikasi DNA plasmid menggunakan etanol,

sehingga diharapkan plasmid telah benar-benar bersih dari kontaminan.

3. Verifikasi rekombinan dengan PCR

Hasil elektroforesis pada gel agarosa 1,5% (b/v) menunjukkan

terbentuknya pita DNA berukuran ± 581 pb pada rekombinan no. 10, 12, 14

dan 15 yang diverifikasi dengan PCR (Gambar 20). Hasil tersebut

menunjukkan bahwa fragmen gen tat HIV-1 telah berhasil disisipkan ke

dalam plasmid pQE-80L. Berdasarkan letak pelekatan primer, maka besar

fragmen DNA yang seharusnya didapatkan adalah ± 581 pb, yang terdiri atas

265 pb daerah pQE-80L dan 316 pb fragmen gen tat HIV-1.

Kondisi PCR disesuaikan dengan kondisi PCR saat melakukan PCR

overlapping. Primer pQE-forward dan Ex2-TatpNL4C merupakan primer

untuk proses verifikasi PCR karena pasangan primer tersebut akan

mengamplifikasi mulai dari daerah promoter vektor hingga berakhir pada

fragmen gen tat HIV-1.

D. ANALISIS PREDIKSI KONSTRUKSI PLASMID REKOMBINAN

Fragmen gen tat HIV-1 diklona ke dalam vektor ekspresi pQE-80L

dengan tujuan menghasilkan protein rekombinan yang terfusi dengan

penanda 6x Histidin yang disandikan oleh vektor tersebut. Hal tersebut

mengakibatkan pengklonaan fragmen gen tat HIV-1 harus dilakukan secara


59

sebingkai (in frame) terhadap vektor plasmid pQE-80L. Pengklonaan

sebingkai (in frame) dilakukan dengan menyisipkan DNA target ke dalam

Open Reading Frame (ORF) vektor (Qiagen 2003: 23). Hal tersebut

menunjukkan bahwa DNA sisipan harus disisipkan pada Multiple cloning site

(MCS) plasmid yang berada downstream dari sekuen Ribosomal Binding Site

(RBS), penanda 6x Histidin, dan start codon vektor, sehingga proses translasi

diawali dari sekuen promoter vektor. Proses pengklonaan tersebut akan

menghasilkan protein rekombinan yang terfusi dengan penanda 6x Histidin.

Adanya penanda 6x Histidin tersebut akan memudahkan dalam purifikasi

protein rekombinan, karena 6x Histidin akan berinteraksi dengan matriks

nickel-nitrilotriacetic (Ni-NTA) (Gambar 18).

Analisis prediksi konstruksi plasmid rekombinan menunjukkan bahwa

terdapat kemungkinan fragmen gen tat HIV-1 diklona secara out of frame

(Gambar 21). Hal tersebut dapat diketahui dari perubahan kerangka baca

translasi asam amino fragmen gen tat HIV-1 yang disisipkan ke dalam vektor

pQE-80L. Gambar 21 menunjukkan hasil translasi fragmen gen tat HIV-1

yang seharusnya diawali oleh asam amino metionin, akan tetapi karena

terjadi pergeseran kerangka baca, maka awal translasi fragmen gen tat

berubah menjadi triptofan. Kesalahan translasi asam amino tersebut

kemungkinan akan menghasilkan protein bukan Tat HIV-1.

Gray dkk. (1982: 6599) menyatakan bahwa pengklonaan fragmen gen

secara out of frame akan menghasilkan protein rekombinan yang tidak sesuai

karena terjadi perubahan pola baca saat proses translasi. Perubahan


60

kerangka baca fragmen gen tat HIV-1 diduga karena kesalahan dalam

merancang situs restriksi pada bagian upstream primer forward untuk sintesis

fragmen gen. Faktor lain yang dapat menjadi penyebab pergeseran

kerangka baca tersebut adalah rancangan primer tepat, tetapi vektor yang

digunakan tidak sesuai dengan fragmen gen sisipan. Primer untuk sintesis

gen tat HIV-1 yang dirancang oleh Kelompok Peneliti LMK-UI kemungkinan

tidak disesuaikan untuk proses pengklonaan ke dalam vektor pQE-80L,

melainkan ke dalam vektor ekspresi lainnya.

Apabila fragmen gen tat HIV-1 benar diklona secara out of frame dan

tetap diekspresikan melalui vektor pQE-80L, akan dihasilkan protein

rekombinan yang tidak sesuai, yaitu bukan protein Tat HIV-1. Selain itu, jika

ekspresi protein tetap dilakukan, kemungkinan protein yang dihasilkan tidak

terdeteksi pada Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel

Electrophoresis (SDS-PAGE) sebab ukuran protein terlalu kecil. Hal tersebut

dapat diketahui dari banyaknya stop kodon pada hasil translasi rekombinan.

Fragmen gen tat HIV-1 yang kemungkinan tidak diklona secara in

frame dapat tetap diekspresikan melalui beberapa cara. Salah satu cara

yang dapat digunakan adalah melakukan subcloning fragmen gen tersebut ke

dalam vektor ekspresi lain, misalnya pGEX 4T-2 [Amersham]. Cara lain yang

dapat dilakukan adalah merancang primer baru dengan situs restriksi sesuai

terhadap vektor ekspresi pQE-80L ataupun vektor lainnya.

Hasil analisis konstruksi plasmid rekombinan tersebut tetap perlu

diverifikasi melalui proses sequencing, akan tetapi, berdasarkan hasil


61

penelitian mulai dari sintesis fragmen melalui PCR overlapping sampai

verifikasi PCR, diperkirakan bahwa sintesis dan pengklonaan fragmen gen tat

HIV-1 kemungkinan besar telah berhasil dilakukan. Proses PCR overlapping

untuk mengamplifikasi fragmen gen tat HIV-1 didasarkan pada adanya

sekuen yang sama dan saling tumpang tindih pada fragmen yang akan

diamplifikasi (Vallejo dkk. 1994: 124). Berdasarkan hal tersebut, maka kecil

kemungkinan untuk terjadinya kesalahan dalam amplifikasi fragmen gen yang

akan menghasilkan pita DNA berukuran sama dengan fragmen gen tat HIV-1.


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. SINTESIS DAN … DNA dikatakan spesifik dan berhasil diamplifikasi...

Documents

Transcript of BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. SINTESIS DAN … DNA dikatakan spesifik dan berhasil diamplifikasi...