BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Sediaan Apus Darah Tepi

Tujuan pemeriksaan sediaan apus darah tepi antara lain menilai

berbagai unsur sel darah tepi seperti eritrosi, leukosit, dan trombosit dan

mencari adanya parasit seperti malaria, tripanosoma, microfilarian dan lain

sebagainya. Sediaan apus yang dibuat dan dipulas dengan baik merupakan

syarat mutlak untuk mendapatkan hasil pemeriksaan yang baik.

Bahan pemeriksaan yang terbaik adalah darah segar yang berasal dari

kapiler atau vena, yang dihapuskan pada kaca obyek. pada keadaan tertentu

dapat pula digunakan darah EDTA. (Arjatmo Tjokronegoro, 1996)

Sediaan apus darah yang baik harus memenuhi syarat yaitu lebar dan

panjangnya tidak memenuhi seluruh kaca, ekornya tidak terbentuk seperti

bendera robek,secara granula penebalannya nampak berangsur-angsur menipis

dari kepala kearah ekor, tidak berlubang-lubang, tidak terputus-putus, tidak

terlalu tebal dan pewarnaan yang baik. (Imam Budiwiyono, 1995)

Jenis apusan darah:

1. Sediaan darah tipis

Ciri-ciri sediaan apus darah tipis yaitu lebih sedikit membutuhkan darah

untuk pemeriksaan dibandingkan dengan sediaan apus darah tebal,

morfologinya lebih jelas, dan perubahan pada eritrosit dapat terlihat jelas.

5

6

2. Sediaan darah tebal

Ciri-ciri sediaan apus darah tebal yaitu lebih banyak membutuhkan darah

untuk pemeriksaan dibandingkan dengan sediaan apus darah tipis, jumlah

selnya lebih banyak dalam satu lapang pandang, dan bentuknya tidak sama

seperti dalam sediaan apus darah tipis.

Kriteria kualitas pewarnaan yang baik

1. Makroskopis

a. Sediaan darah kelihatan jernih dan transparan

b. Warna sel darah merupakan kombinasi warna-warna merah, ungu dan

biru

c. Bentuk ekor pada preparat tidak runcing

d. Preparat tidak terputus-putus

e. Preparatnya tidak berlubang-lubang

2. Mikroskopis

a. Lapisan darah harus cukup tipis sehingga eritrosit dan leukosit jelas

terpisah satu dengan lainnya

b. Leukosit tidak boleh menggerombol pada bagian terakhir dari apusan

darah

c. Hapusan tidak boleh mengandung endapan cat

d. Sel leukositnya tidak berlubang-lubang

e. Sel leukositnya terwarnai semua

7

B. Morfologi Sel Darahp

1. Sel darah merah (eritrosit).

Eritrosit merupakan diskus bikonkaf, bentuknya bulat dengan

lekukan pada sentralnya dan berdiameter 7,65 µm. Eritrosit terbungkus

dalam membran sel dengan permeabilitas tinggi. Membran ini elastis dan

fleksibel, sehingga memungkinkan eritrosit menembus kapiler (pembuluh

darah terkecil). Setiap eritrosit mengandung sekitar 300 juta molekul

hemoglobin, sejenis pigmen pernapasan yang mengikat oksigen. Volume

hemoglobin mencapai sepertiga volume sel. (Ethel Sloane, 2003)

Eritrosit merupakan sel yang paling banyak dibandingkan dengan 2

sel lainnya, dalam keadaan normal mencapai hampir separuh dari volume

darah. Sel darah merah mengandung hemoglobin, yang memungkinkan sel

darah merah membawa oksigen dari paru-paru dan mengantarkannya ke

seluruh jaringan tubuh. Oksigen dipakai untuk membentuk energi bagi sel-

sel, dengan bahan limbah berupa karbon dioksida, yang akan diangkut

oleh sel darah merah dari jaringan dan kembali ke paru-paru.

.

1. Gambar eritrosit normal

8

Kelainan morfologi eritrosit:

Kelainan morfologi eritrosit berupa kelainan ukuran (size), bentuk

(shape) dan warna (staining characteristics).

a. Kelainan ukuran :

1. Mikrosit

Sel ini dapat berasal dari fragmentasi eritrosit yang normal

seperti pada anemia hemolitik, anemia megaloblastik dan dapat

pula terjadi pada anemia difisiensi besi.

2. Makrosit

Makrosit adalah eritrosit yang berukuran lebih dari 8 µm.

sel ini didapatkan pada anemia megaloblastik.

3. Anisositosis

Anisositosis tidak menunjukkan suatu kelainan hematologic

yang spesifik. Keadaan ini ditandai dengan adanya eritrosit dengan

ukuran yang tidak sama besar dalam sediaan apus darah tepi.

Anisositosis jelas terlihat pada anemia mikrositik yang ada

bersamaan dengan anemia makrositik seperti pada anemia gizi. (

Arjatmo Tjokronegoro dan Hendra Utama, 1996)

b. Kelainan bentuk

1. Ovalosit

Ovalosit adalah eritrosit yang berbentuk lonjong.

2. Sperofit

Sperofit adalah eritrosit yang berbentuk lebih bulat, lebih

9

kecil dan lebih tebal dari eritrosit normal

3. Schitosit atau fragmentosit

Sel ini merupakan pecahan eritrosit.

4. Sel target

Eritrosit yang mempunyai masa kemerahan di bagian

tengahnya, disebut juga sebagai sel sasaran.

5. Sel sabit atau sickle cell

Sel ini didapatkan pada penyakit sel sabit yang homozigot

(SS). Sel sabit didapatkan dengan cara eritrosit di inkubasi terlebih

dahulu dalam keadaan anoksia dengan menggunakan zat reduktor

(Na2S2O3 atau Na2S2O5).

6. Krenasi

Sel seperti ini merupakan artefak, dapat dijumpai dalam

sediaan apus darah tepi yang telah disimpan 1 malam pada suhu

200 C atau eritrosit yang berasal dari “washed packed cell”.

7. Sel Burr

Sel ini adalah eritrosit yang kecil atau fragmentosit yang

mempunyai duri satu atau lebih pada permukaan eritrosit.

8. Akantosit

Sel ini desebabkan oleh metabolism fosfolipid dari

membrane eritrosit. Keadaan tepi eritrosit mempunyai tonjolan-

tonjolan berupa duri.

10

9. Tear drop cell

Eritrosit yang mempunyai bentuk seperti tetesan air.

10. Poiklositosis

Poiklositosis adalah istilah yang menunjukan bentuk

eritrosit yang bermacam-macam dalam sediaan apus darah tepi.

11. Rouleaux

Rouleaux tersusun dari 3-5 eritrosit yang membentuk

barisan sedangkan auto aglutinasi adalah keadaan dimana eritrosit

bergumpal. ( Arjatmo Tjokronegoro dan Hendra Utama, 1996)

c. Kelainan warna

1. Hipokrom

Eritrosit yang tampak pucat. Eritrosit hipokrom disebabkan

kadar hemoglobin dalam eritrosit

2. Polikrom

Eritrosit polikrom adalah eritrosit yang lebih besar dan lebih

biru dari eritrosit normal. Polikromasi suatu keadaan yang ditandai

dengan banyak eritrosit polikrom pada preparat sediaan apus darah

tepi, keadaan ini berkaitan dengan retikulositosis. ( Arjatmo

Tjokronegoro dan Hendra Utama, 1996)

2. Sel darah putih (leukosit)

Jumlahnya lebih sedikit, dengan perbandingan sekitar 1 sel darah

putih untuk setiap 660 sel darah merah. Terdapat 5 jenis utama dari sel

darah putih yang bekerja sama untuk membangun mekanisme utama tubuh

11

dalam melawan infeksi, termasuk menghasilkan antibodi. Dibedakan

berdasarkan ukuran, bentuk nukleus, dan ada tidaknya granula sitoplasma.

Sel yang memiliki granula sitoplasma disebut granulosit sedangkan sel

tanpa granula disebut agranulosit.

a. Granulosit

1) Neutrofil

Juga disebut granulosit karena berisi enzim yang

mengandung granul-granul, jumlahnya paling banyak. Neutrofil

membantu melindungi tubuh melawan infeksi bakteri dan jamur

dan mencerna benda asing sisa-sisa peradangan. Ada 2 jenis

neutrofil, yaitu neutrofil berbentuk pita (imatur, belum matang) dan

neutrofil bersegmen (matur, matang). neutrofil memiliki granula

kecil berwarna merah muda dalam sitoplasmanya. Nukleusnya

memiliki tiga sampai lima lobus yang terhubungkan dengan

benang kromatin tipis. Diameternya mencapai 9 µm samapai 12

µm. ( Ethel Sloane, 2003)

Sel netrofil paling banyak di jumpai pada sel darah putih.

Sel golongan ini mewarnai dirinya dengan pewarna netral atau

campuran pewarna asam dan basa serta tampak bewarna

ungu.(irianto,2004)

12

2. Gambar netrofil batang

3. Gambar netrofil segmen

2) Eosinofil

Eosinofil Sel ini ukurannya kurang lebih sama dengan

netrofil. Bentuk inti umumnya mirip gagang telepon atau kaca

mata dengan ukuran yang kurang lebih seragam dan berwarna

merah jingga. Sel ini agak sukar ditemukan karena jumlahnya lebih

sedikit dari neutrofil. Banyaknya jumlah granula membuat sel ini

berwarna lebih gelap. Bentuk inti sel ini merupakan bentuk pada

fase eusinofil yang telah dewasa. Granula pada sel ini mengandung

13

protein yang mampu membunuh cacing seperti schistosoma.

(Irianto,2004)

4. Gambar eosinofil

3) Basofil

Sel ini ukurannya kurang lebih sama dengan neutrofil.

Namun sel ini agak sukar dicari karena jumlahnya dalam keadaan

normal sedikit, bahkan lebih sedikit dari eosinofil. Bentuk intinya

tidak menentu, bahkan sering tidak jelas karena tertutup granula.

Kadang juga terlihat berlobus atau berbentuk batang bengkok.

Granula sitoplasma berwarna biru kehitaman, ukurannya tidak

seragam dan tersebar menutupi inti.

5. Gambar basofil

14

b. Agranulosit

1) Limfosit

Ukuran sel ini beragam, ada yang seperti eritrosit dan ada

yang sebesar netrofil. Limfosit dengan garis tengah 6-8 mikrometer

dikenal sebagai limfosit kecil. Sitoplasma limfosit bersifat basa

lemah dan berwarna biru muda pada sediaan yang terpulas.

Sitoplasma ini mengandung granul azurofilik. Inti selnya

kebanyakan bulat atau terkadang mirip ginjal. Kromatin inti amat

padat dan berwarna biru gelap. Sel ini juga relatif sedikit dan

berwarna biru langit tanpa granul spesifik, namun pada beberapa

sel terlihat granula azurofil yang jika pulasannya baik bewarna

ungu kemerahan.(Irianto,2004)

Limfosit dibagi ke dalam 2 kelompok utama:

a. Limfosit B berasal dari sel stem di dalam sumsum tulang dan

tumbuh menjadi sel plasma, yang menghasilkan antibodi

b. Limfosit T terbentuk jika sel stem dari sumsum tulang pindah

ke kelenjar thymus, dimana mereka mengalami pembelahan

dan pematangan.Di dalam kelenjar thymus, limfosit T belajar

membedakan mana benda asing dan mana bukan benda asing.

Limfosit T dewasa meninggalkan kelenjar thymus dan masuk

ke dalam pembuluh getah bening dan berfungsi sebagai bagian

dari sistem pengawasan kekebalan. (Farieh, 2008)

15

6. Gambar limfosit

2) Monosit

Monosit merupakan sel leukosit yang besar 3-8% dari

jumlah leukosit normal, diameter 9-10 um tapi pada sediaan darah

kering diameter mencapai 20 µm atau lebih. Inti biasanya

eksentris, adanya lekukan yang dalam berbentuk tapal kuda.

Sitoplasma relatif banyak dengan pulasan wrigh berupa bim abu-

abu pada sajian kering. Granula azurofil, merupakan lisosom

primer, lebih banyak tapi lebih kecil. Ditemui retikulim

endoplasma sedikit. Juga ribosom, pliribosom sedikit, banyak

mitokondria. Apa ratus Golgi berkembang dengan baik, ditemukan

mikrofilamen dan mikrotubulus pada daerah identasi inti. Monosit

terdapat dalam darah, jaringan ikat dan rongga tubuh. Monosit

tergolong fagositik mononuclear (system retikuloendotel) dan

mempunyai tempat-tempat reseptor pada permukaan membrannya.

Untuk imunoglobulin dan komplemen.(Efendi, 2003)

16

7. Gambar monosit

c. Kelainan morfologi leukosit

1) Kelainan sitoplasma

a) Granulasi toksik (infeksi akut, luka bakar dan intoksikasi)

b) Granulasi polimorfonuklear (leukemia dan sindrom

mielodisplasia)

c) Badan dohle (keracunan, luka bakar dan infeksi berat)

d) Batang aurer (leukemia myeloid akut)

e) Limpositik plasma biru (infeksi virus dan mononucleosis

infeksiosa)

f) Smudge sel (leukemia limfosit kronik)

g) Vakuolisasi (keracunan dan infeksi berat)

2) Kelainan inti sel

a) Hipersegmentasi (anmegaloblastik, infeksi, uremia dan

GGK)

b) Intipiknotik (sepsis dan leukemia)

c) Anomaly pelger huet (leukemia kronik mielodisplastik)

17

3. Platelet (trombosit).

Merupakan paritikel yang menyerupai sel, dengan ukuran lebih

kecil daripada sel darah merah atau sel darah putih. Sebagai bagian dari

mekanisme perlindungan darah untuk menghentikan perdarahan, trombosit

berkumpul dapa daerah yang mengalami perdarahan dan mengalami

pengaktivan. Setelah mengalami pengaktivan, trombosit akan melekat satu

sama lain dan menggumpal untuk membentuk sumbatan yang membantu

menutup pembuluh darah dan menghentikan perdarahan. Pada saat yang

sama, trombosit melepaskan bahan yang membantu mempermudah

pembekuan. (Junquiera,1997)

8. Gambar trombosit

C. Pewarnaan Sediaan Darah

Macam-macam pewarnaan pada sediaan apus darah menurut

Romanowsky ada empat macam pewarnaan yaitu pewarnaan wright’s stain,

pewarnaan Lieshman,pewarnaan may grunwald dan pewarnaan giemsa.(Imam

Budiwiyono, 1995)

18

Pewarnaan wright adalah pewarnana untuk sedian darah dengan

menggunakan reagen biru metilena dan eosin, yang menghasilkan warna akhir

sediaan darah merah muda dan sel darah merah berwarna kuning atau merah

muda. (Pudjaatmaka, A.Hadyana.2002)

Bagian sel darah dapat jelas dibedakan dengan pewarnaan pappenheim

pada film darah (pewarnaan May-Grunwald dan pewarna giemsa).struktur

nucleus lebih kurang bersifat basofil dibandingankan sitoplasma, dengan cara

tersebut granula dapat diperhatikan dengan baik (Martoprawiro.1986)

Giemsa adalah zat warna yang terdiri dari eosin dan metilen azur

memberi warna merah muda pada sitoplasma dan metilen biru pada inti

leokosit.ketiga jenis zat warna ini dilarutkan dengan metal alcohol dan

gliserin.larutan Ini dikemas dalam botol coklat (100-500-1000cc) dan dikenal

sebagai giemsa stock yang ph 7.

Eosin yang dicampur dengan methilen biru akan menghasilkan pulasan

berupa sel darah berwarna merah muda, inti sel darah putih menjadi

lembayung tua, protoplasma parasit malaria menjadi biru dan butir kromatin

parasit menjadi merah.(Hadidjaja,1992)

Faktor yang harus diperhatikan untuk mencapai pewarnaan yang

baik :

1) Kualitas dari stock giemsa yang digunakan standar mutu

a) Stock giemsa yang belum tercemar air.

b) Zat warna pada giemsa masih aktif.

19

2) Kualitas dari air pengencer giemsa

a) Air pengencer harus jernih

b) Derajat keasaman pengencer hendaknya berada 6,8 sampai 7,2

perubahan ph pada larutan berpengaruh pada pewarnaan sel-sel darah

3) Kualitas pembuatan sedian darah

Ketebalan sel darah yang akan diwarnai mempengaruhi hasil pewarnaan,

semakin berat fixaxi akan semakin sukar bagi larutan giemsa menerobos

plasma darah untuk mencapai sel darah merah untuk melakukan proses

hemolisa.

4) Kebersihan sedian darah

Zat warna yang mengendap dipermukaan pada akhir pewarnaan tertinggal

pada sel darah dan mengotorinya.oleh karena itu pada akhir pewarnaan

larutan giemsa harus dibilas dengan air yang mengalir.

5) Lakukan pewarnaan. (Depkes RI,1993)

Giemsa stock harus diencerkan lebih dulu sebelum dipakai mewarnai

sel darah.Elemen-elemen zat warna giemsa melarut selama 40-90 menit

dengan air atau aquadest atau air buffer.Setelah itu semua elemen zat warna

akan mengendap dan sebagian lagi balik ke permukaan membentuk lapisan

tipis seperti minyak sebab itu giemsa tidak boleh tercemar air. (Depkes

RI,1993)

20

D. Pedoman Pemakaian Giemsa

1. Giemsa stock baru boleh diencerkan dengan aquadest atau air buffer sesaat

akan digunakan agar diperoleh efek pewarnaan yang optimal.

2. Mengencerkan giemsa sebanyak yang dibutuhkan, sebab bila berlebih

terpaksa harus dibuang.

3. Untuk mengambil stock giemsa dari botolnya, menggunakan pipet khusus

agar stock giemsa tidak dicemari.

4. Methanol dapat menarik air dari udara, sebab itu stock giemsa harus di

tutup rapat dan tidak boleh sering dibuka. Pisahkan giemsa dibotol tetes

atau botol kecil dari stock.

5. Pewarnaan giemsa adalah pewarnaan lambat, sehingga hasil baik bila

menggunakan giemsa encer.

6. Tolak ukur sebagai dasar perhitungan

a) 1cc sama dengan 20 tetes

b) Seluruh permukaan kaca sediaan dapat ditutupi cairan sebanyak 1 cc

c) Berdasarkan tolak ukur ini dapat dihitung banyaknya giemsa encer

yang harus dibuat sesuai dengan kebutuhan terutama bila melakukan

pewarnaan.

7. Takaran pewarnaan

Untuk melakukan pewarnaan individu pada kegiatan stock giemsa 1 tetes

tambah pengencer sepuluh tetes dengan lama pewarnaan 15 – 20 menit

(giemsa 10%) atau stock giemsa 1 tetes ditambah pengencer 1 cc (20 tetes)

dengan lama pewarnaan 45 – 60 menit (giemsa 5%)

21

8. Gunakan air pengencer yang mempunyai PH 6,8 – 7,2. (Depkes,1993)

E. Konsentrasi Pengenceran Giemsa

1. Pembuatan larutan giemsa 5% (1:20), 1 bagian giemsa + 19 bagian

aquadest atau buffer. Lakukan pewarnaan dengan larutan giemsa 5%

selama 30-45 menit.

2. Pembuatan larutan giemsa 10% (1:10), 1 bagian giemsa + 9 bagian

aquadest atau buffer. Lakukan pewarnaan dengan larutan giemsa 10%

selama 20-25 menit.

3. Pembuatan larutan giemsa 20% ( 1:5), 1 bagian giemsa + 4 bagian

aquadest atau buffer. Lakukan pewarnaan dengan larutan giemsa 20%

selama 10-15 menit. (Depkes RI,2007)

F. Pengencer Giemsa

1. Larutan Penyangga buffer

Suatu larutan yang dapat menahan perubahan ph yang besar ketika

ion-ion hydrogen atau hidroksida ditambahkan atau ketika larutan itu

diencerkan disebut larutan penyangga atau larutan dapar. (Day And

Underwood, 2001:148)

Larutan buffer adalah larutan yang memiliki kemampuan untuk

mempertahankan PH pada penambahan asam atau basa (Tim Dosen

Kimia, 2003)

22

Larutan buffer didefinisikan sebagai campuran asam lemah dengan

basa konjugasinya atau basa lemah dengan asam konjugasinya (Achmad,

1996:418)

PH yang rendah atau kurang dari 6,8 mengakibatkan sel darah

merah lebih banyak mengambil pewarna asam atau eosin, sehingga sel

darah merah menjadi lebih merah muda. Lekosit juga akan

memperlihatkan bagian-bagian inti yang kurang jelas. (Robert

R.Harr,2002)

Pembuatan larutan buffer dengan cara melarutkan Na2HPO4.2H2O

17,799 gram kedalam beker glass 500 ml dengan aquadest 250 ml

homogenkan, kemudian masukan kedalam labu ukur 1000 ml dengan

menambahkan aquadest sampai tanda batas dan homogenkan kembali

untuk mendapatkan larutan Na2HPO4 0,1 M kemudian Melarutkan

NaH2PO4.2H2O 15,601 gram kedalam beker glass 500 ml dengan aquadest

250 ml homogenkan, kemudian masukan kedalam labu ukur 1000 ml

dengan menambahkan aquadest sampai tanda batas dan homogenkan

kembali untuk mendapatkan larutan NaH2PO4 0,1 M. Membuat buffer PH

6,8 dengan cara menghomogenkan larutan Na2HPO4 0,1 M sebanyak

51,1ml dan NaH2PO4 0,1 M sebanyak 48,9 ml. (mulyono, 2006)

2. Aquadest

Aquadest adalah air dari hasil penyulingan(diuapkan dan disejukan

kembali) dan memiliki kandungan murni H2O,sedangkan air mineral tidak

murni H2O.air suling juga memiliki rumus kimia pada air umumnya yaitu

23

H2O yang berarti dalam 1 molekul terdapat 2 atom hydrogen kovalen dan

atom oksigen tunggal.

Aquadest merupakan larutan yang bebas dari mikroba hidup,baik

itu pathogen dan non patogen yang biasanya digunakan untuk campuran

bahan dalam laboratorium atau melarutkan obat

G. Kerangka Teori

Keterangan :

Hasil pewarnaan sediaan apus darah dipengaruhi oleh faktor lama

pewarnaan, apusan darah, pewarna (jenis, kualitas, pengencer, dll), sumber

daya manusia (tingkat ketrampilan, pengecatan dll).

H. Kerangka Konsep

Lama pewarnaan

Apusan darah

Pengenceran

SDM

Hasil pewarnaansediaan apus

darah

Pengencer giemsamenggunakan

aquadest

Hasil pewarnaan morfologisel darah

Pengencer giemsamenggunakan buffer

24

Keterangan:

Pengencer giemsa mempengaruhi hasil pewarnaan pada sediaan apus

darah. pengencer giemsa dilakukan menggunakan larutan buffer dan

aquadest. Pengenceran giemsa berpengaruh pada morfologi sel darah dan

dikatakan baik apabila memperlihatkan tidak adanya endapan cat giemsa. Sel

eritosit berwarna merah muda, tidak adanya kelainan warna hipokrom atau

polikrom lebih dari 10%, granula sel netrofil berwarna ungu, limfosit tanpa

granul spesifik berwarna biru langit, limfosit dengan sel terlihat granul

azurofil berwarna ungu kemerahan, kromatin inti limfosit padat dan berwarna

biru gelap, bagian tepi pada sel trombosit yang dinamakan hialomer berwarna

biru muda dan bagian tengah sel trombosit yang berbutir-butir atau

dinamakan granulomer berwarna ungu.