GAMBARAN HISTOPATOLOGI DAN JUMLAH MIKROFLORA JEJUNUM TIKUS PUTIH (Rattus norvegicus) YANG TERPAPAR INDOMETASIN DAN MENDAPAT SUPLEMENTASI BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL)

HISTOPATHOLOGY AND THE AMOUNT OF MICROFLORA IN WHITE RAT JEJUNUM (Rattus norvegicus) EXPOSED TO INDOMETHACIN AND LACTID ACID BACTERIA (LAB)

Oleh :Awang Yoga Pratama, Aulanniam, Masdiana C. Padaga,Program Studi Pendidikan Dokter Hewan Program Kedokteran Hewan Universitas BrawijayaEmail : awangyogapratama07@yahoo.com

ABSTRAKInflamasi pada saluran pencernaan atau pada gastrointestinal tract (GIT) khususnya organ jejunum sering disebabkan oleh bakteri patogen dan efek penggunaan obat-obatan khususnya golongan Non Steroidal Anti Inflamatory Drugs (NSAIDs) seperti indometasin. Suplementasi BAL menjadi pengobatan alternatif untuk mengobati inflamasi pada saluran pencernaan. Tujuan penelitian ini yaitu untuk melihat gambaran histopatologi dan jumlah mikroflora pada jejenum tikus (Rattus norvegicus). Tikus dibagi menjadi 5 perlakuan, yaitu kontrol, indometasin, suplementasi BAL, preventif, dan kuratif. Hasil pengamatan histopatologi pada organ jejunum menunjukkan tikus yang mendapat perlakuan suplementasi BAL dan preventif tidak mengalami kerusakan vilinya dan tidak terjadi deskuamasi epitel. Hal ini menunjukkan perbedaan dengan kelompok yang mendapat perlakuan induksi indometasin dan kuratif, dimana pada kelompok tersebut terjadi kerusakan epitel pada vili dan deskuamasi epitel. Perhitungan jumlah mikroflora pada organ jejunum menunjukkan peningkatan jumlah pada kelompok yang mendapat suplementasi BAL menjadi 2,03x106 CFU/ml (BAL) dan 3,65x106 CFU/ml (enterobacter) dibandingkan yang diinduksi indometasin 1,63x106 CFU/ml (BAL) dan 1,95x106 CFU/ml.

Kata kunci : Jejunum, Indometasin, BAL, Histologi, Mikroflora.

ABSTRACT

Inflammation in digestive tract or gastrointestinal tract (GIT) especially jejunum is often caused by bacterial pathogens and the use of drugs Non Steroidal Anti-Inflammatory Drugs (NSAIDs) such as indomethacin. The purpose of this study is to see the picture histopathology jejunum and colonic microflora in organs jejunum of rat (Rattus norvegicus). LAB can use as an alternative to cure the inflammation of GIT. This study was to observe the histopathology and the amount of microflora in rat jejunum. Rats were divided into 5 grups of treatment; control, indomethacin, LAB supplementation, preventive, and curative. Jejunum histophatological observation showed that there were has damage of epithelial villi and didnt have desquamation. It showed that there are differences with the indomethacin and curative group which show the epithelial damaging and desquamation. Becides, the LAB supplementation LAB yielded the rat jejunum microflora to be 2.03 x106 CFU / ml of LAB and 3.65 x106 CFU / ml of enterobacter higher than indomethacin group was 1.63 x106 CFU / ml of LAB and 1, 95x10 CFU / ml of enterobacter.

Keywords: Jejunum, Indomethacin, LAB, Histolopatology, Microflora.

PENDAHULUANInflamasi pada saluran pencernaan atau gastrointestinal tract (GIT) khususnya organ jejunum sering terjadi karena bakteri patogen dan efek penggunaan obat-obatan khususnya golongan Non Steroidal Anti Inflamatory Drugs (NSAIDs) seperti indometasin (Surono, 2004). Penggunaan indometasin memiliki efek samping yaitu menurunkan sintesa prostaglandin sehingga akan mengurangi jumlah produksi mucus yang berfungsi sebagai proteksi terhadap bakteri patogen (Takeuchi et al., 2003).Penggunaan probiotik seperti kelompok bakteri asam laktat (BAL) dapat meningkatkan kesehatan dengan cara mendukung perkembangan mikroba yang menguntungkan dan menekan pertumbuhan bakteri patogen dalam saluran pencernaan. Hal ini diantaranya adalah organ jejunum (Tamime, 1999). Salminen (1998) menambahkan, bahwa peningkatan jumlah dan aktivitas bakteri asam laktat dalam kolon juga berhubungan erat dengan peningkatan kondisi kesehatan karena bakteri asam laktat yang bertindak sebagai probiotik mampu melakukan kolonisasi, multiplikasi, dan membangun sistem imun.Beberapa penelitian melaporkan bahwa BAL dapat mengatasi penyakit inflamasi saluran pencernaan. Oleh karena itu penelitian ini dilakukan untuk menguji apakah pemberian suplementasi BAL dapat mencegah terjadinya inflamasi ditinjau dari gambaran histopatologi dan jumlah mikroflora pada jejunum pada tikus yang mengalami immune bowel disease (IBW).

MATERI DAN METODE Perlakuan Hewan Coba Hewan coba yang dipakai yaitu tikus (Rattus norvegicus) jantan, strain Wistar berumur 8-12 minggu. Berat badan tikus antara 150-200 gram, yang diperoleh dari Unit Pengembangan Hewan Percobaan (UPHP) UGM Yogyakarta dan telah mendapatkan sertifikat laik etik dari Komisi Etik Penelitian Universitas Brawijaya No. 99-KEP-UB.

Persiapan Isolat Bakteri Asam LaktatIsolat bakteri asam laktat (BAL) didapatkan dari feses orangutan (Pongo pygmeus). Dilakukan uji karakterisasi pada BAL yang diisolasi dari feses orangutan, kemudian dilakukan uji potensi BAL untuk menentukan isolat yang akan dipakai dalam penelitian ini. Dugaan isolat BAL yang digunakan adalah genus Enterococcus dan Lactobacillus. Hasil uji karakterisasi dan uji potensi.

Persiapan IndometasinUntuk membuat tikus menderita enteritis, dosis indometasin yang digunakan adalah 15mg/kgBB tikus. Berat rata-rata tikus yang digunakan 150 gr sehingga diperlukan 2,25 mg indometasin. Untuk membuat larutan stok indometasin maka 45 mg indometasin dilarutkan dalam 4 ml pelarut. Banyaknya larutan yang disonde (dimasukkan per oral) adalah : 2,25 mg x 4 ml = 0,2 ml 45 mgKebutuhan indometasin = 150mg/kg BB x 0,15kg = 2,25 mg

Persiapan Hewan PercobaanTikus dibagi dalam 5 kelompok perlakuan (Tabel 4.1). Sebelum mendapatkan perlakuan, semua tikus diadaptasikan dengan kondisi kandang dan pakan selama tiga hari. Pemberian pakan yang sama dilanjutkan hingga hari ke-10. Sebelum percobaan, semua kelompok tikus diberi ransum standar ad libitum. Komposisi ransum pakan disusun berdasarkan standar AOAC (2005) yaitu mengandung karbohidrat, protein, lemak, mineral, vitamin, dan air.Tikus dikandangkan dalam kandang yang berukuran 17.5 x 23.75 x 17.5 cm, dengan jumlah sesuai dengan jumlah tikus yang digunakan. Kandang terbuat dari stainless steel. Kandang tikus berlokasi pada tempat yang bebas dari suara ribut dan terjaga dari asap industri serta polutan lainnya. Lantai kandang mudah dibersihkan dan disanitasi. Suhu optimum ruangan untuk tikus adalah 22-24 oC dan kelembaban udara 50-60% dengan ventilasi yang cukup (namun tidak ada jendela terbuka).

Pemberian BAL dan IndometasinPemberian BAL dan indometasin diberikan peroral. Pada kelompok perlakuan C dan E pada Tabel 4.1, Indometasin diberikan dengan dosis 15 mg/kg BB pada hari ke-1. Untuk kelompok B BAL diberikan selama 10 hari sejak hari ke-1. Pada kelompok D, BAL diberikan sejak hari ke-1 sampai dengan hari ke-7 sedangkan pada kelompok E, BAL yang diberikan sejak hari ke-2 sampai dengan hari ke 10. Dosis BAL yang diberikan pada tikus sebanyak 2ml.

Pengambilan OrganPengambilan jejunum usus halus pada hewan coba dilakukan dengan cara hewan coba dikorbankan terlebih dahulu dengan melakukan dislokasi pada bagian leher tikus. Kemudian hewan coba tikus putih dibedah pada bagian abdomennya untuk selanjutnya diambil bagian jejunum usus halus. jejunum diambil dan dicuci dengan NaCl 0.9% dan direndam dalam PBS

Pembuatan Preparat JejunumEvaluasi histologi dilakukan dengan pembuatan preparat histologi organ jejunum dengan pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE) pada semua perlakuan. Metode yang dipakai adalah metode Janqueira & Carneiro (2007). Langkah-langkahnya yaitu persiapan organ jejunum yang akan dibuat sediaan histology. Dilanjutkan dengan proses clearing dengan xylol dan dilanjutkan dengan proses embedding dan blocking pada parafin. Proses selanjutnya yaitu sectioning untuk ditempelkan pada object glass dan dilakukan pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE). Langkah-langkah pembuatan preparat histologi secara lengkap dijelaskan pada Lampiran 2.

Pengamatan HistologiPengamatan histopatologi jaringan jejunum dilakukan menggunakan mikroskop cahaya (Olympus BX-51). Pengamatan meliputi perubahan pada lapisan mukosa, vili, dan deskumasi epitel.

Analisis MikrobiologiOrgan jejunum dipotong kecil (lebih kurang 1cm3), dimasukkan ke dalam larutan Buffer Pepton Water (BPW) 1 % kemudian dilakukan pengenceran sampai dengan 10-5. Selanjutnya dilakukan penanaman menggunakan teknik pour plate ke dalam media selektif de Mann, Rogosa, Sharpe Agar (MRSA) sebagai media tumbuh BAL dan media VRB-G sebagai media tumbuh Enterobactericeae dengan metode double layer, kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 48-72 jam (Nair & Surendran, 2005).

Analisis DataPada percobaan ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) yang mana tikus diberi 4 perlakuan dengan 5 kali pengulangan. Analisa data aktivitas mikroflora jejunum menggunakan Analysis Of Variance (ANOVA). Jika ada perbedaan maka akan diuji menggunakan uji Turkey menggunakan software SPSS for windows version 16.0. untuk melihat apakah ada perbedaan nyata.

HASIL DAN PEMBAHASAN5.1 Efek Suplementasi Bakteri Asam Laktat Terhadap Gambaran Histopatologi jejunum Tikus (Rattus norvegicus) Hasil Induksi Indometasin.

Penelitian menggunakan parameter histopatologi dengan menggunakan pewarnaan Hematoksilin Eosin (HE). Penelitian ini menggunakan perbesaran lemah (100x) dengan mengamati perubahan struktur vili (Gambar 5.1). Hasil Epengamatan preparat jejunum tikus pada masing-masing kelompok perlakuan dapat dilihat pada Gambar 5.1 berikut ini ;

A

B

C

D

Gambar 5.1 Perbandingan bentuk vili pada gambaran histopatologi jejunum tikus (Rattus norvegicus) (HE, 100x) a. Kontrol b. Induksi indometasin, terjadi kerusakan bentuk vili (panah merah), c. Suplementasi BAL d. Preventif e. Kuratif

Seperti tampak pada Gambar 5.1 (A) yang merupakan gambaran dari histopatologi jejunum tikus dalam keadaan normal. Menunjukkan bentukan vili-vili usus yang tersusun rapi, rapat, dan teratur. Jejunum normal dapat terlihat mukosa dengan vili yang panjang, sel-sel epitel columnar dengan sel goblet, lapisan submukosa, lapisan muscular dan lapisan serosa (Galdeano, 2006). Histologi pada kelompok ini dapat dijadikan patokan adanya perubahan dan kerusakan yang terjadi pada kelompok lainnya. Gambaran histologi normal atau kontrol (Gambar 5.1.A) ini berbeda apabila dibandingkan dengan gambaran histopatologi yang diinduksi indometasin (5.1.B) yaitu terlihat perbedaan di struktur vilinya. Gambaran histologi yang diinduksi indometasin (5.1.B) mengalami kerusakan. Menurut Lanas & Scarpignato (2006) pemberian obat-obatan NSAIDs seperti indometasin dapat menyebakan kerusakan vili dan mukosa di usus. Didukung juga oleh pernyataan Guyton & Hall(1997); Mitchell & Cotran (2003) bahwa inflamasi pada jejunum ditandai dengan adanya kerusakan vili dan epitel.Gambar 5.1 (C) merupakan gambaran histopatologi jejunum yang mendapat suplementasi BAL dimana susunan sama dengan kelompok normal. Perbaikan struktur vili pada kelompok suplementasi BAL (Gambar 5.1C) terjadi karena bakteri asam laktat mampu menstimulasi sistem imunitas melalui ikatan terhadap sel intestinal dan interaksi dengan GALT (Gut associated-lymphoid tissue) yang merupakan organ limfoid yang terdapat dalam saluran pencernaan. Probiotik ini akan memicu produksi sitokin anti inflamasi dan mengurangi produksi sitokin proinflamasi sehingga memperkuat barier mukosa jejenum (Markwick et al., 2004).Pemberian suplementasi BAL dengan menyonde BAL dalam bentuk pellet secara oral pada tikus yang terpapar indometasin mampu mengurangi terjadinya inflamasi, ditandai dengan tidak ditemukannya kerusakan vili, infiltrasi sel inflamasi dan edema. Hal itu dikarenakan BAL sebagai probiotik membantu proses pencernaan pada usus dengan cara memecah protein menjadi asam amino, dimana asam amino yang diserap oleh usus akan membantu mmemperbaiki lapisan mukosa yang rusak (Muchtadi, 1997; Siregar, 2004).Kelompok tikus suplementasi BAL Gambar 5.1 (C) tidak menunjukkan perbedaan secara histologi dengan kelompok kontrol. Pemberian BAL tidak mempegaruhi gambaran histologi jejunum masih dalam kondisi yang baik yakni bentuk vili masih terlihat rapi seperti yang terlihat pada Gambar5.1 Keberadaan BAL sebagai kandidat probiotik di saluran pencernaan dapat membantu menjaga keseimbangan mikroflora usus sehingga berdampak pada kesehatan usus terutama pada jejunum. (Ohara & Shanahan,2007). Gambar 5.1(D) menunjukan histopatologi jejunum kelompok tikus yang diberi suplementasi bakteri asam laktat (BAL). Hasil yang terlihat menunjukkan tidak ada perbedaan yang terlalu signifikan bila dibandingkan dengan gambar kelompok kontrol 5.1 (A), dapat diamati dari vili hingga lapisan muskularisnya sama dan tanpa ada kerusakan. Perbaikan pada kelompok tikus yang diberi terapi BAL (Gambar 5.1 E) ini terjadi karena terapi dilakukan setelah pemberian indometasin dan dilakukan secara berulang. Sehingga bentuk vili terlihat rapi kembali, dan terlihat berbeda jika dibandingkan dengan kelompok tikus yang diinduksi indometasin (Gambar 5.1 B). Galdeano (2006) mengatakan bahwa adanya penempelan BAL pada epitel jejunum dapat merangsang aktifnya sel-sel epitel dan fungsi limfosit sehingga dapat meningkatkan kapasitas perlindungan pada sistem pertahanan mukosa.

Adanya deskuamasi sel epitel yaitu ketidak teraturan susunan epitel pada jejunum tikus dapat dilihat pada gambar 5.2.

A

C

D

E

Gambar 5.2Tanda hitam menunjukkan deskuamasi epitel dan tanda merah menunjukkan degenerasi hidrofilik. (A) kontrol, (B)Indometasin, (C)suplementasi BAL, (D) Preventif, (E) Kuratif. Pewarnaan HE perbesaran 400x.

BKelompok tikus kontrol (A) dan kelompok BAL (C) tidak terlihat adanya deskuamasi epitel. Berbeda dengan kelompok tikus yang terpapar indometasin (B) yang memperlihatkan adanya deskuamasi epitel. Deskuamasi epitel ditandai dengan susunan epitel yang berantakan akibat meningkatnya permeabilitas mukosa karena inflamasi (Mansjoer, 2003). Pada kelompok preventif (D) masih terlihat adanya deskuamasi epitel, namun tingkat keparahannya lebih rendah dari kelompok indometasin (B). Hal tersebut dimungkinkan terjadi karena waktu terapi yang kurang dan dosis indometasin yang diberikan pada tikus tersebut merupakan dosis yang s tinggi (Perry et al., 1997). Pada kelompok kuratif (E) masih terdapat deskuamasi epitel, hal tersebut dimungkinkan kurangnya waktu suplementasi BAL.Degenerasi hidrofilik dapat ditemukan pada kelompok indometasin Gambar 5.2 (B). degenerasi hidrofilik tidak ditemukan pada kelompok kontrol, BAL, dan terapi karena degenerasi hidrofilik merupakan salah satu tanda terjadinya inflamasi. Mansjoer (1993) mengatakan bahwa degenerasi hidrofilik tersebut ditandai dengan terjadinya pembengkakan/ edematosa pada vili. Paparan indometasin dapat menyebabkan inflamasi, Inflamasi tersebut menyebabkan meningkatnya permeabilitas pembuluh darah sehingga protein mudah lolos masuk ke jaringan melalui celah-celah yang muncul diantara sel-sel endotel (Takeuchi et al., 2003; Cenac et al., 2007; Kumar dkk., 2007). Akibat paparan indometasin pada tikus menyebabkan terjadinya kerusakan epitel yang ditunjukkan dengan adanya deskuamasi epitel. Yoon et al. (2011) dan Ohland et al. (2009) mengatakan bahwa pemberian probiotik pada kondisi tersebut dapat membantu kestabilan tight junctions (TJs) dan meningkatkan fungsi barier dari sel epitel usus dengan menurunkan permeabilitas epitel sehingga deskuamasi epitel tidak terjadi.

B5.2 Efek Pemberian Indometasin dan Suplementasi Bakteri Asam Laktat (BAL) Terhadap Jumlah Mikroflora Jejunum Tikus (Rattus norvegicus)Nilai rata-rata jumlah BAL dan Enterobacter pada jejunum tikus menunjukkan adanya variasi pada jumlah bakteri antar kelompok tikus. Pengamatan parameter rata-rata populasi BAL dan Enterobacter yang disajikan pada dalam Tabel 5.1Tabel 5.1 Rata rata jumlah BAL dan Enterobacter jejunum tikus putih (rattus norvegicus).

KelompokEnterobacter(CFU/ml)BAL(CFU/ml)

Kontrol (A)1,98 x 106 b1,55 x 106 b

Indometasin (B)1,95 x 104 a1,63 x 104 a

BAL (C)2,93 x 106 c2,18 x 106 b

Preventif (D)Kuratif (E)3,65 x 106 c 3,43 x 106 c2,03 x 106 b2,00 x 106 b

Tabel 5.1 menunjukkan terjadinya perbedaan jumlah mikroflora yang berbeda nyata di antara perlakuan. Hasil penghitungan jumlah mikroflora pada jejunum dengan perlakuan BAL, preventif, dan kuratif menunjukan terdapat perbedaan yang nyata jika dibandingkan dengan tikus yang diinduksi indometasin. Analisis statistika dengan p