Analisis Kuantitatif m.o
-
Upload
ayyu-thrye-sartheeqaa -
Category
Documents
-
view
135 -
download
11
Transcript of Analisis Kuantitatif m.o
1. Perhitungan massa sel secara langsung :
a. Volumetrikb. Grafimetrikc. Turbidimetrik
Gravimetri dan volumetri merupakan metode analisis
kuantitatif suatu zat atau komponen yang telah diketahui
dengan cara menimbang berat residu (gravimetri)/mengukur
volume larutan (volumetri) setelah melalui proses
pemisahan.
Dalam bidang mikrobiologi, kedua metode ini jarang
dilakukan karena memiki tingkat kesulitan yang tinggi
sehingga membutuhkan sarana dan prasarana.
Analisis kuantitatif secara turbidimetri merupakan analisis
berdasarkan pengukuran turbiditas atau kekeruhan dari
suatu suspensi. Metode ini meliputi pengukuran cahaya yang
diteruskan.
Turbiditas berbanding lurus terhadap konsentrasi sel.
Perhitungan mikroorganisme dilakukan dengan cara
mengukur persentase cahaya yang melewati larutan yang
diperiksa.
Alat yang biasa digunakan pada metode ini adalah
spektrofotometer. Prinsip umum dari alat ini adalah sinar
yang datang mengenai suatu partikel ada yang diteruskan
(transmittan) dan ada yang diserap (absorban), maka sinar
yang diteruskan digunakan sebagai dasar pengukuran.
Sejumlah cahaya ditembakkan dari sebuah sumber cahaya menuju monokromator.
Monokromator akan menguraikan cahaya dan meneruskannya menuju kuvet yang berisikan suspensi sel
Ketika cahaya melewati kuvet:1.Cahaya akan diserap sebagian oleh partikel tersuspensi.2. Sebagian cahaya diteruskan.3. dan sebagian lagi menyebar ke segala arah
Jumlah cahaya yang diserap akan sebanding dengan jumlah partikel tersuspensi (konsentrasi sampel).
2. Perhitungan massa sel secara tidak langsung :
a. Analisis komponen sel (protein, DNA, ATP)
b. Analisis produk katabolisme (energi, metabolisme primer, metabolisme sekunder)
c. Analisis konsumsi nutrien (karbon, N, O, asam amino, mineral)
Analisis kuantitatif secara tidak langsung sering dilakukan
untuk mengetahui adanya pertumbuhan mikroorganime
melalui pengamatan aktivitas biokimianya. Misalnya, uji
metil biru, uji molish, uji TSIA, uji Voges-Proskauer, uji
Merah Metil, uji indol dan lain-lain.
Sebagai contoh dilakukan pengujian uji metil biru pada
susu. Pada uji tersebut, ditambahkan metil biru dalam
jumlah tertentu ke dalam sampel susu. Selanjutnya
dilakukan pengamatan terhadap kemampuan m.o. (bakteri)
untuk tumbuh dan menggunakan oksigen sehingga warna
biru berubah menjadi warna putih metilen.
Organisme yang tumbuh dalam susu akan menggunakan oksigen yang ada. Karena jumlah oksigen mulai berkurang/habis, maka terjadi reaksi oksidasi-reduksi untuk kelangsungan hidup mikroba.
Sitrat yang merupakan metabolit mikroba berfungsi sebagai donor hidrogen, methylene blue sebagai aseptor hidrogen, dan enzim reduktase yang diproduksi mikroba merupakan katalis. Reaksi oksidasi yang terjadi harus dapat menyediakan energi untuk pertumbuhan mikroba. Oleh karena itu, dengan enzim reduktase mikroba menurunkan potensial oksidasi-reduksi, dengan mereduksi metilen biru. Karena tereduksi maka metilen biru berubah warnanya dari biru menjadi putih metilen/methylene white.
Uji ini memberikan perkiraan jumlah koloni bakteri yang
terdapat di dalam susu dengan mengamati waktu yang
dibutuhkan oleh bakteri untuk melakukan reaksi reduksi dapat
menyebabkan perubahan zat warna biru dari metilen biru.
Semakin tinggi jumlah bakteri dalam susu, semakin cepat
terjadinya perubahan warna.
Beberapa hasil penelitian melaporkan bahwa perkiraan jumlah
koloni pada uji ini diperoleh dengan metode hitung cawan
yang dihubungkan dengan waktu reduksi.
Perkiraan hubungan antara jumlah koloni dengan waktu
reduksi menggunakan metil biru, sebagai berikut:
Waktu reduksi (jam) Perkiraan koloni
(x 10-4)
Mutu susu Keterangan
½ - 3½ 80 atau lebih Buruk/sedang Buruk, berubah warnanya dalam waktu kurang dari 2 jam
setelah di mulai uji BM
4 40 Sedang Sedang, berubah warna dalam waktu 2 jam sampai kurang
dari 6 jam uji BM
4½ 25 Sedang -
5 15 Sedang -
5½ 10 Sedang -
6 6 Sedang -
6½ - 8 2,5 Baik Baik, berubah warna dalam waktu 6 jam sampai kurang
dari 8 jam uji BM
8 1 Sangat baik Sangat baik, tidak berubah warnanya setelah 8 jam uji BM
3. Perhitungan jumlah sel : a. Hitungan mikroskopik :
- Metode Breed- Metode Petroff-Hausser
b. Hitungan cawan : - SPC bakteri - SPC kapang
c. MPN
a. Metode Breed
Metode analisis ini digunakan untuk menganalisis
susu.
Metode ini dilakukan dengan terlebih dahulu
mengukur luas areal pandang pada mikroskop yang
akan digunakan, dengan menggunakan mikrometer.
Mikrometer yang digunakan adalah mikrometer
objek gelas yang berskala terkecil 0,01 mm.
Areal pandang mikroskop biasanya mempunyai
ukuran 0,14 – 0,16 mm
Metode Breed ini merupakan metode yang cepat
karena hanya menggunakan mikroskop untuk
menghitung mikroorganisme secara langsung.
Selain itu, metode ini juga mempunyai kelemahan
yaitu tidak dapat dilakukan terhadap sampel susu
yang telah mengalami pasteurisasi.
Hal ini disebabkan karena sel-sel m.o yang telah mati
dengan sel m.o yang masih hidup secara mikroskopik
tidak dapat dibedakan sehingga sel-sel m.o yang telah
mati juga ikut terhitung.
b. Metode Petroff-Hausser
Metode analisis ini menggunakan gelas
objek khusus yang memiliki kotak-kotak
skala.
Pada alat tersebut, kotak berskala
tersebut memiliki luas 1 mm2 yang terdiri
dari 25 kotak besar dengan luas masing-
masing kotak besar 0,04 mm2. Dan setiap
kotak besar terdiri 16 kotak kecil.
Tinggi sampel yang terdapat di antara gelas objek dan gelas penutup yaitu ± 0,02 mm.
Perhitungannya dimulai dengan menghitung jumlah sel yang terdapat dalam beberapa kotak besar, kemudian dihitung jumlah sel rata-rata dalam kotak besar.
Jumlah sel per ml sampel dapat dihitung, sebagai berikut:
1
Jumlah sel /ml sampel = A x 25 kotak x x 103
0,02 A= jumlah sel per kotak besar
Hitungan mikroskopik mempunyai beberapa kelemahan
selain sebagai pilihan metode kuantitatif yang cepat dan
murah, antara lain:
Sel-sel yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel-sel
yang hidup.
Sel-sel yang berukuran sangat kecil, sukar dilihat di bawah
mikroskop.
Agar diperoleh ketelitian yang tinggi, jumlah sel dalam
suspensi sampel harus cukup tinggi. Mis.x untuk bakteri min.
106 sel/ml.
Tidak dapat digunakan untuk menghitung sel m.o pada
bahan yang mengandung sel debris atau ekstrak makanan.
Metode hitung cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk menentukan jumlah mikroorganisme, karena beberapa hal sebagai berikut:1.Hanya sel yang masih hidup yang dihitung2.Beberapa jenis mikroorganisme dapat dihitung sekaligus3.Dapat digunakan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi mikroorganisme, karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari suatu mikroorganisme yang penampilan pertumbuhannya yang spesifik
Metode hitung cawan juga memiliki kelemahan, yaitu:
1.Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel sebenarnya, karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk koloni.
2.Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang berbeda.
3.Mikroorganisme yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar.
4.Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama, kemudian pertumbuhan koloni dapat dihitung.
Jumlah koloni dalam sampel dapat dihitung sebagai berikut:
1 Koloni per ml atau per gram = jumlah koloni per cawan x
faktor pengenceran
Range Mikroba Untuk Dihitung :Bakteri : 30 – 300 koloniJamur : 10 – 150 koloni
1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 30 – 300/cawan (bakteri) atau antara 10 – 150/cawan (jamur)
2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan satu kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan dapat dihitung sebagai satu koloni saja
3. Satu deretan rantai koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni
1. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari 2 angka yaitu angka kesatu (satuan) dan angka kedua (desimal). Jika angka ketiga ≥ 5 harus dibulatkan 1 angka lebih tinggi pada angka kedua.Contoh : 1,65 x 103 unit koloni/ml atau gram
= 1,7 x 103 unit koloni/ml atau gram
2. Jika pada semua pengenceran dihasilkan < 30 koloni pada cawan petri maka dilaporkan pengenceran terendah.Contoh:
jumlah koloni SPCKeterangan
10-4 10-5 10-6
15 5 2 < 3,0 x 105 yg terendah
ada di 10-4
3. Jika semua pengenceran dihasilkan > 300 koloni pada cawan petri maka dilaporkan pengenceran tertinggi.contoh:
jumlah koloni SPCKeterangan10-4 10-5 10-6
TBUD TBUD 345 > 3,0 x 108 ada pada 10-6
(3,5 x 108) TBUD 315 15 > 3,0 x 107
ada pada 10-5 (3,2 x 107)
4. Jika pada cawan petri dari dua tingkat pengenceran dihasilkan koloni dengan jumlah antara 30 – 300, maka keduanya dibandingkan antara pengenceran tertinggi dan pengenceran terendah. Sehingga pelaporannya :
Bila hasilnya > 2 maka dilaporkan pengenceran tertinggi (pekat) dan
Bila hasilnya 2 maka dirata-ratakan dari kedua nilai tersebut dengan memperhitungkan pengencerannya dan dilaporkan adalah pada pengenceran terendah (encer)
jumlah koloni SPC Keterangan10-4 10-5 10-6
293 41 10 4,1 x 106 hitung rata-ratanya,
krn 4100000/2930000 = 1,4 → (< 2)
140 32 5 1,4 x 106 hitung rata-ratanya,
krn 3200000/1400000 = 2,3 → (>2)
5. Jika digunakan 2 cawan petri (duplo) pengenceran, maka data yang diambil harus dari kedua cawan tersebut.
MPN adalah suatu metode numerasi mikroorganisme yang
menggunakan data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme
pada medium cair spesifik dalam seri tabung yang ditanam dari
sampel padat atau cair yang ditanam berdasarkan jumlah
sampel atau diencerkan menurut tingkat seri tabungnya
sehingga dihasilkan kisaran jumlah mikroorganisme yang diuji
dalam nilai MPN/satuan volume atau massa sampel.
Contoh :
Data yang didapat adalah : 3 tabung positif dari pengenceran
1/10, 2 tabung positif dari pengenceran 1/100 dan 1 tabung
positif dari pengenceran 1/1000.
Lalu dicocokkan dengan tabel, menghasilkan nilai : 150 MPN/g
Digunakan medium yang berbentuk cair (Laktosa
Broth) yang dimasukkan dalam tabung-tabung
reaksi yang diisi penuh dengan tabung kecil yang
disebut dengan tabung durham.
Cara perhitungannya didasarkan pada banyaknya
tabung yang positif yaitu yang ditumbuhi oleh
mikroorganisme yang ditandai dengan terjadi
perubahan warna dari medium dari warna hijau
menjadi kuning dan terbentuk gelembung gas
yang terperangkap di dalam tabung durham.
Tujuan untuk menghitung jumlah m.o. tertentu yaitu bakteri coliform yang terdapat diantara campuran m.o. lainnya.
Pada metode ini pengenceran harus dilakukan lebih tinggi daripada hitungan cawan sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang diinokulasikan dengan larutan hasil pengenceran sampel tersebut mengandung sedikitnya satu sel.
Dengan demikian, setelah diinkubasi diharapkan terjadi pertumbuhan pada beberapa tabung yang dinyatakan positif sedangkan yang lainnya dinyatakan negatif.
Rumus : 1
MPN = Nilai MPN (tabel) x Fp tengah
NB: nilai MPN dilihat pada tabel berdasarkan jumlah tabung yang hasilnya
positif
Uji Angka Staphylococcus aureus Prinsip pengujian: Adanya pertumbuhan Staphylococcus aureus pada
medium yang sesuai, adanya proses reduksi kalium telurit, adanya proses hidrolisa kuning telur, dan adanya koagulasi plasma.
Medium :Buffered Pepton Water, Baird Parker Agar, Brain
Heart Infusion Broth (BHIB). Pereaksi :
Plasma kelinci, Egg Yolk (EY)
BPA merupakan medium pengaya non selektif. Medium BPW,
komposisinya terdiri dari pepton, natrium klorida, dan dapar
fosfat.
Medium pengencer ini digunakan untuk memulihkan/
menguatkan sel bakteri yang mungkin kehilangan
vitalitasnya (lemah) karena kondisi di dalam sampel yang
kurang menguntungkan selama proses pengolahan makanan.
Pengenceraan suspensi sampel dilakukan untuk
mendapatkan koloni yang tumbuh secara terpisah dan dapat
dihitung dengan mudah, hal ini akan sangat membantu
terutama untuk sampel dengan cemaran yang sangat tinggi.
Baird-Parker Agar dengan Kuning Telur tellurite merupakan media selektif untuk yang digunakan untuk mendeteksi Staphylococcus aureus dalam sampel biologi, produk farmasi, kosmetik, makanan dan air.
Komposisi medium ini terdiri dari litium klorida dan tellurite yang berfungsi untuk menghambat pertumbuhan flora mikroba alternatif sedangkan natrium piruvat dan glisin untuk mendukung pertumbuhan Staphylococcus aureus.
Hasil positif yang ditunjukkan pada medium ini yaitu koloni Staphylococcus yang muncul berwarna hitam dengan zona jernih di sekitar koloni.
BHIB merupakan medium bernutrisi tinggi yang
umumnya digunakan untuk kultivasi
mikroorganisme yang bersifat patogen.
Nitrogen, vitamin, dan sumber karbon disediakan
oleh Brain-Heart Infusion dan intisari enzimatik dari
gelatin; dekstrosa sebagai sumber karbohidrat;
natrium klorida untuk mempertahankan
keseimbangan osmotik lingkungan; dan dinatrium
fosfat sebagai bahan pendapar di medium.
1. Secara aseptik ditimbang 25 g sampel atau dipipet 25 ml
sampel, dimasukkan ke dalam erlenmeyer steril dan
ditambahkan 225 ml BPW atau dilakukan homogenisasi selama
30 detik hingga diperoleh suspensi yang homogen dengan
pengenceran 10-1.
2. Disiapkan dua tabung yang masing-masing telah diisi dengan 9
ml BPW. Dipipet 1 ml dari pengenceran 10-1 ke dalam tabung
berisi 9 ml BPW hingga diperoleh pengenceran 10-2. Dibuat
pengenceran berikutnya hingga10-3.
3. Dari sampel setiap pengenceran masing-masing dipipet 0,25 ml
ke dalam cawan petri yang telah berisi 15-20 ml medium BPA-EY
yang telah memadat dan dibuat triplo.
3. Suspensi segera disebar-ratakan dengan menggunakan batang gelas bengkok (hokky stick). Disiapkan pula cawan lain yang hanya diisi dengan media BPA-EY sebagai kontrol media.
4. Apabila inokulum belum terserap semua oleh agar, biarkan cawan dengan posisi ke atas di dalam inkubator selama 10-60 menit, kemudian inkubasi cawan dengan posisi dibalik pada suhu 35ºC-37ºC selama 24-48 jam.
5. Pilih dan hitung cawan yang mengandung 20-200 koloni yang diduga Staphylococcus aureus. Koloni Staphylococcus aureus memiliki ciri-ciri bulat, halus, lembab, diameter 2-3 mm, berwarna abu-abu kehitaman, memucat di tepi koloni, dan apabila dicuplik dengan ose koloni tampak seperti mentega sampai lengket.
6. Dipilih 10 koloni spesifik yang diduga S.aureus dari tiga cawan terhitung, kemudian diinokulasikan 1 ose ke dalam tabung reaksi kecil berisi 0,2-0,3 ml BHIB, diinkubasi pada suhu 35ºC-37ºC selama 18-24 jam.
7. Ditambahkan 0,5 ml plasma kelinci dan diaduk merata, diinkubasi 35ºC-37ºC selama 6 jam. Diamati terjadinya koagulasi plasma kelinci dalam setiap tabung dengan membalikkan tabung, apabila media tetap ditempatnya berarti dipertimbangkan positif S.aureus.
Angka S. aureus dinyatakan berdasarkan persentase koloni spesifik yang telah dikonfirmasi sebagai S. aureus (koagulasi positif) dikalikan jumlah koloni dari tiga cawan (triplo) dan faktor pengenceran. AAngka S.aureus: = x B x C
10A : Koloni spesifik S.aureus (koagulasi positif)B : jumlah koloni terduga S.aureus dari tiga cawan (triplo)C : faktor pengenceran
Contoh:Perhitungan koloni terduga S. aureus pada
pengenceran 10-2 (C) adalah 90 (B), dan dari 10 koloni yang dikonfirmasi ternyata 9 positif sebagai S. aureus, maka angka S. aureus per gram atau per ml sampel adalah :
Angka S. Aureus : 9
x 90 x 102 = 81 x 102 koloni 10