Abstract

Dalam studi ini kami telah meneliti jalur dimana papillomaviruses menginfeksi sel, dengan menggunakan bovine papillomavirus (BPV) virion dan sel C127 tikus sebagai sistem model. Dengan mikroskop confocal, masuknya BPV virion, virus seperti partikel BPV (VLPs), dan VLPs HPV16 yang sangat mirip. Pada sel dual terkena, HPV-16 VLPs dan BPV virion colocalized intraseluler. BPV VLPs colocalized dengan AP-2, adaptor clathrin molekuler dan penanda-tergantung clathrin endocytic jalur; dan juga dengan reseptor transferrin, penanda endosomes awal; dan Lamp-2, penanda akhir endosomes dan lisosom. Infeksi BPV terdeteksi dalam waktu 12 jam dari virion mengikat sel-permukaan, yang diukur dengan assay RT-PCR. Infeksi dicegah oleh beberapa inhibitor farmakologis, termasuk chlorpromazine, yang menghambat tergantung clathrin endositosis dan agen lysosomotropic, bafilomycin A. Sebaliknya, dua inhibitor tergantung caveolae serapan, Filipin dan nistatin, tidak mencegah infeksi BPV. Kami menyimpulkan bahwa papillomaviruses menginfeksi sel melalui endositosis reseptor-dimediasi tergantung clathrin. Anehnya, kinetika internalisasi itu luar biasa lambat untuk mekanisme ini, dengan t1 tersebut / 2 dari masuknya BPV-1 menjadi sekitar 4 jam vs 5-15 menit untuk ligan yang khas.

Introduction

Papillomaviruses (PV) yang tidak memiliki amplop, virus DNA ikosahedral yang terus-menerus menginfeksi epitel skuamosa berlapis dari spektrum yang luas dari spesies hewan. Virus ini terlibat penyebabnya di sejumlah lesi epitel, terutama manusia karsinoma serviks (Zur Hausen, 1991).

Penyelesaian jalur menular dari PV sulit dicapai in vitro, sebagai peristiwa akhir siklus terikat dengan diferensiasi keratinosit (Taichman et al., 1984). Kesulitan eksperimental ini telah menghasilkan analisis eksperimental yang terbatas dari jalur dimana PV menginfeksi sel, tanpa analisis sistematis dari jalur perdagangan untuk PV virion. Namun, peristiwa di awal infektivitas virus dapat dipelajari dengan virion PV dan budaya monolayer yang tepat. Aspek proses ini juga dapat diperiksa dengan virus seperti partikel PV (VLPs), asalkan VLPs dan virion dapat ditunjukkan untuk berinteraksi sama dengan sel. Analisis sebelumnya dari PV masuk jalur telah menunjukkan ketergantungan pada sebuah aktin sitoskeleton utuh. Namun, analisis mikroskopis elektron telah menyebabkan hasil yang bertentangan mengenai apakah PV memasuki sel melalui dilapisi atau tidak dilapisi vesikel (Volpers et al, 1995;. Zhou et al, 1995.).

Setelah mengikat reseptor permukaan sel, virus diinternalisasikan ke dalam lingkungan intraseluler melalui salah satu dari beberapa jalur yang mungkin. Virus memiliki amplop umumnya masuk melalui vesikel endocytic berlapis clathrin atau clathrin sistem caveolae independen, yang menghasilkan vesikula uncoated. Di bekas sistem, vesikel pembawa menengah digunakan untuk memberikan virion ke endosomes dan lisosom (terakhir di Schmid, 1997). Mikro vesikular ini dapat memfasilitasi infeksi virus, mungkin melalui melemahnya kapsid tahan sebelumnya seperti yang terjadi untuk anggota keluarga reovirus (Dryden et al, 1993;. Ludert et al, 1987;.. Virgin et al, 1994) atau melalui tergantung pH pelepasan virion ke dalam sitoplasma seperti yang dijelaskan untuk adenovirus (Fujimoto et al, 2000;. Greber et al, 1993.). Dalam sistem lain, virion memasuki sel melalui endositosis caveolar diangkut ke ER halus melalui jalur yang independen dari endosomes dan lisosom (Anderson et al, 1992;.. Pelkmans et al, 2001). Perbedaan antara dua jalur tersebut dapat dicapai melalui analisis pola penghambatan biokimia serapan ligan dan dengan colocalization virus masukan dengan komponen yang ditetapkan dari mesin perdagangan seluler.

Sulit untuk memprediksi a priori yang jalur digunakan oleh PV. Misalnya, di antara polyomaviruses, yang struktur kapsid mirip dengan yang dari PV, beberapa anggota, seperti JC, gunakan jalur clathrin (Pho et al., 2000), sementara yang lain, seperti SV40, memasuki sel melalui caveolae (Anderson et al, 1992;. Chen dan Norkin, 1999; Stang et al, 1997).. Untuk mengidentifikasi jalur eksperimental, kami telah memeriksa di sini masuknya bovine papillomavirus tipe 1 (BPV) ke dalam sel C127, sistem sel-virus standar untuk analisis infeksi PV, yang menghasilkan transformasi seluler produktif stabil (Dvoretzky et al., 1980; Law et al, 1981;.. Watts et al, 1984). Kami telah menggabungkan evaluasi mikroskopis virus terkait sel dengan uji RT-PCR yang mendeteksi ekspresi awal disambung BPV-1 mRNA. Dengan menggunakan tes ini dalam hubungannya dengan baterai senyawa yang menghambat berbagai jalur perdagangan, kami telah memutuskan bahwa PV memasuki sel melalui endositosis reseptor-dimediasi tergantung clathrin.

Hasil

VLPs dan virion memanfaatkan jalur intraseluler yang sama

Baru-baru ini menyarankan bahwa virion (atau DNA yang mengandung VLPs) VLPs dan kosong mungkin berbeda dalam stabilitas dan sensitivitas mereka terhadap protease pencernaan, sebagai hasil dari pembentukan ikatan disulfida tambahan protein kapsid berikut kemasan DNA (Fligge et al., 2001) . Itu adalah hipotesis bahwa peningkatan stabilitas ini dalam partikel DNA yang mengandung dapat menyebabkan hubungan diferensial dengan reseptor seluler. Ini adalah masalah penting, karena kebanyakan studi PV adsorpsi dan penetrasi telah dimanfaatkan VLPs daripada virion.

Untuk membandingkan virion dan VLP kami persiapan untuk kemungkinan perbedaan dalam tingkat mereka internalisasi atau lokalisasi subselular, kami memeriksa BPV virion, dimurnikan dari kutil sapi, dan BPV VLPs secara paralel percobaan mikroskopi timecourse. Tidak ada perbedaan yang jelas yang terdeteksi antara BPV virion dan BPV VLPs (data tidak ditampilkan, meskipun sebanding dengan Gambar. 2B). Itu tidak layak untuk melakukan analisis cytometric, yang membutuhkan sejumlah besar partikel, dengan virion karena ketersediaan terbatas dari bahan ini.

Oleh karena itu, untuk menjawab pertanyaan ini bahkan lebih ketat, kita secara bersamaan diinkubasi sel dengan BPV virion dan HPV-16 VLPs. Meskipun evolusi yang berbeda, ada kemungkinan bahwa virus ini berbagi reseptor umum seperti HPV 16 VLPs dapat bersaing dengan BPV untuk sel-permukaan mengikat (Roden et al., 1994a). Karena ada antibodi monoklonal anticapsid yang secara khusus mengakui BPV atau HPV16 L1 epitop, pewarnaan ganda dengan antibodi ini memungkinkan kita untuk membandingkan lokalisasi virion dan VLPs dalam sel yang sama. Dengan menggunakan pendekatan ini, kami menemukan bahwa pola pewarnaan tumpang tindih substansial (Gambar 1 menunjukkan pewarnaan ganda terhadap HPV-16 L1 dan BPV-1 L1 pada 4 dan 8 jam titik waktu), meskipun beberapa vesikel hanya mengandung satu jenis partikel. Penggunaan antibodi monoklonal yang menunjukkan profil yang berbeda reaktivitas (Booy et al, 1998;.. Roden et al, 1994b;. Slupetzky et al, 2001) dapat menjelaskan kurangnya jelas colocalization mutlak.

Kami menyimpulkan bahwa perbedaan utama tidak ada di jalur penyerapan persiapan kami VLPs dan virion karena bukti bahwa mereka berbagi reseptor sel-permukaan umum dan colocalize dalam kompartemen intraselular. Oleh karena itu, memeriksa perdagangan VLP dan lokalisasi harus memberikan representasi yang memadai dari jalur virus otentik.

BPV-1 VLPs secara perlahan diinternalisasikan

Sebelum memeriksa peristiwa pasca-mengikat secara rinci, kami berusaha untuk menentukan tingkat di mana BPV diinternalisasi. Sebagai jumlah preparatif dari VLPs lebih mudah tersedia dari virion dan, seperti kami sebelumnya telah mendirikan utilitas mereka, kita ditandai proses ini dengan BPV VLPs.

Untuk menentukan t1 tersebut / 2 dari VLP internalisasi, VLPs yang terikat pada permukaan sel C127 pada 0 ° C dan dibiarkan diinternalisasikan pada 37 ° C. Pada waktu yang ditentukan sel telah dihapus dan diwarnai dengan antibodi monoklonal 5B6, yang mengakui penentu konformasi pada kapsid BPV. 5B6 reaktivitas dihitung dengan analisis aliran cytometric. Staining rangkap tiga rata-rata untuk setiap titik waktu. Standard error di bawah 3% untuk setiap seri. Saluran fluoresensi rata-rata pada titik waktu 0-min ditetapkan 100%. Ada lag jelas dalam inisiasi endositosis dari VLPs, tanpa internalisasi signifikan yang terjadi selama awal 60 menit (Gambar 2A). Setelah waktu ini, hilangnya VLPs permukaan sel-linier, dengan sekitar 50% dari VLPs diinternalisasi oleh sekitar 4 jam. Dalam incubations paralel dianalisis secara mikroskopis, capping permukaan VLPs tampak jelas selama satu jam pertama inkubasi pada 37 ° C dengan vesikel sitoplasma signifikan terbukti dengan 2 jam pada 37 ° C (Gambar 2B).

Untuk mengesampingkan kemungkinan bahwa beberapa kerugian tergantung waktu 5B6 reaktivitas dari permukaan sel mungkin telah mengakibatkan sebagian dari VLPs yang dipisahkan dari permukaan sel, bukan dari VLP internalisasi, supernatan sel dari setiap titik waktu dianalisis untuk adanya bahan 5B6-reaktif dengan ELISA. Namun, tidak ada VLPs ditemukan akan dibebaskan dari permukaan sel setelah mulai internalisasi (data tidak ditampilkan), meskipun 5B6 ELISA cukup sensitif untuk mendeteksi sesedikit 1% dari VLPs terikat pada sel. Hasil ini sangat menyarankan bahwa penurunan tergantung waktu dalam sel-permukaan 5B6 pewarnaan telah terutama disebabkan oleh masuknya VLPs ke dalam sel.

Colocalization dengan penanda penyerapan endocytic

Untuk mempelajari jalur internalisasi diikuti oleh BPV VLPs, pertama kita meneliti colocalization mereka mungkin dengan spidol mapan jalur endocytic. Penanda dipelajari meliputi: AP-2, yang merupakan protein adapter clathrin; reseptor transferin, yang merupakan penanda untuk kompartemen endosomal awal; dan Lamp-2, yang merupakan penanda akhir endosomes dan lisosom.

Sel diizinkan untuk internalisasi VLPs untuk periode waktu tertentu. Mereka kemudian tetap dan diwarnai dengan berbagai protein penanda dan antibodi terhadap protein 5B6 BPV L1. Setelah 2 jam pada 37 ° C, colocalization dari BPV L1 dan protein adapter clathrin, AP-2 (Gambar 3, A-C), adalah jelas. Dengan 3 h internalisasi colocalization dari BPV L1 dan transferin reseptor adalah mudah terlihat (Gambar 3D-F), menunjukkan bagian lebih lanjut dari VLPs ke kompartemen endocytic awal. Sebaliknya, tidak ada colocalization jelas dengan anti-Lamp-2 pewarnaan tampak jelas dengan anti-L1 antibodi 5B6 pada setiap titik waktu (data tidak ditampilkan).

Banyak virus melarikan diri dari jalur endocytic sebelum titik ini. Namun, kemungkinan alternatif adalah bahwa BPV L1 VLPs mungkin telah diangkut ke akhir endosomal dan lisosomal

kompartemen, tapi itu transit kompartemen ini mungkin telah dikaitkan dengan perubahan konformasi dalam L1 menyebabkan hilangnya reaktivitas antibodi 5B6. Untuk mengevaluasi kemungkinan ini, sel-sel tetap diwarnai dengan antibodi BPV L1 lain, tidak. 9, yang mengakui epitop konformasi yang berbeda dari yang 5B6. Berbeda dengan hasil yang diperoleh dengan 5B6, antibodi no. 9 tidak menampilkan lokalisasi yang kuat dalam kompartemen Lamppositive (endosomes akhir dan lisosom) mulai sekitar 4 jam setelah inisiasi internalisasi (Gambar 3G-I menunjukkan penempatan di 7 h). Pewarnaan Lampu-2 protein terkait membran tampaknya mengelilingi pewarnaan anti-VLP, yang menunjukkan kehadiran mereka dalam vesikel tersebut. Hasil positif menunjukkan protein BPV L1 yang telah mempertahankan beberapa epitop konformasi yang dapat ditemukan di endosomes akhir dan / atau lisosom. Penggunaan antibodi yang diajukan terhadap epitop L1 linear menghasilkan ada informasi lebih lanjut karena latar belakang pewarnaan yang luas (data tidak ditampilkan).

Penghambatan biokimia dari BPV-1 infeksi

Hasil di atas lokalisasi VLPs dalam vesikel AP-2-postive dan vesikel kemudian kompartemen endocytic konsisten dengan partikel yang telah diinternalisasikan melalui lubang berlapis clathrin. Namun, kesimpulan ini tampaknya akan bertentangan dengan kinetika diamati dari PV internalisasi, karena kebanyakan ligan yang endocytosed melalui jalur tergantung clathrin melakukannya dengan t1 / 2 dari 5 sampai 15 menit (Goldenthal et al, 1988.; Schmid et al., 1988), sedangkan yang t1 / 2 dari BPV-1 internalisasi adalah sekitar 4 jam (Gambar 2). Oleh karena itu, untuk memperkuat kesimpulan bahwa BPV internalisasi dimediasi melalui jalur ini, kami menguji sensitivitas infeksi BPV ke berbagai inhibitor biokimia diketahui menghambat proses seluler yang berbeda.

Untuk mengidentifikasi masuknya virus sukses dan uncoating, kami mengukur penampilan mRNA awal disambung dalam sel C127 setelah penambahan menular virion BPV. Kami beralasan bahwa jenis pengujian akan menjadi cara yang sensitif dan cepat untuk definitif memantau penyelesaian peristiwa awal masuknya virus dan uncoating. BPV virion ditambahkan ke sel-sel C127; sel dipanen pada waktu yang ditetapkan poin postinfection, dan RNA disiapkan. Gen RT-PCR menggunakan primer di seluruh situs sambatan gen awal E6 ^ E7 dari BPV, dan sebagai kontrol untuk integritas mRNA, di persimpangan disambung di seluler?-Aktin. Sebuah putaran kedua PCR dijalankan menggunakan primer internal bersarang ke set pertama. The amplimers dari reaksi ini dianalisis elektroforesis. Gambar. 4A menunjukkan bahwa band RNA spesifik yang menunjukkan transkripsi dari BPV-1 gen awal pertama jelas 12 jam postinfection. Transkrip aktin menunjukkan integritas RNA pada semua titik waktu.

Untuk menentukan sensitivitas tes, kami menambahkan penurunan jumlah virion pada sel C127 dan memungkinkan infeksi untuk terus selama 14 jam. Kami menemukan bahwa sinyal yang kuat terdeteksi turun ke 80 ng/106 sel; sinyal lemah jelas pada 32 ng/106 sel, dan tidak ada sinyal yang diamati di bawah ini tingkat input (Gambar 4B). Satu mikrogram virion sama dengan sekitar 3? 1010 partikel, sehingga batas terdeteksi 32 ng/106 sel setara dengan sekitar 1000 virion per sel. Mengingat tingginya rasio partikel-to-infektivitas dijelaskan untuk papillomavirus (Roden et al, 1996;.. Smith et al, 1995), ini bukan moi tinggi Dalam uji formasi fokus, rasio partikel-to-infektivitas dari 2? 104 ditentukan untuk BPV virion, dimurnikan dari kutil dengan cara yang identik dengan bahan kami (Roden et al., 1996). Selain itu, kami mengevaluasi assay dengan mengolah RNA diperoleh dari BPHE-1 sel. Sel-sel ini mengandung sekitar 50 salinan otonom mereplikasi genom (Zhang et al., 1987). Bahan dari sekitar 10 BPHE-1 sel menghasilkan sinyal yang jelas dalam uji RT-

PCR (data tidak ditampilkan), menunjukkan kegunaan metode ini untuk mendeteksi sensitif sel BPV terinfeksi.

Assay ini PCR sensitif kemudian digunakan untuk menentukan apakah infeksi BPV dapat dicegah dengan inhibitor jalur endocytic (lihat Tabel 1). Virion terikat pada sel-sel C127 selama 60 menit pada 0 ° C; virion terikat telah dihapus, dan infeksi diizinkan untuk melanjutkan dengan penambahan 37 ° C media. Untuk analisis awal, inhibitor hadir selama seluruh infeksi, dan dua tingkat virion masukan diuji untuk mengevaluasi kemungkinan efek menengah (Gambar 5). Obat-obatan yang mencegah infeksi yang chlorpromazine, bafilomycin A, NH4Cl, Nocodazole, Latrunculin B, dan natrium azida. Tiga inhibitor pertama bertindak pada jalur clathrinendosomal di berbagai titik (Bayer et al, 1998;.. Clague et al, 1994;. Subtil et al, 1994). Latrunculins mencegah polimerisasi monomer aktin (Spector et al., 1989). Aktin telah ditemukan untuk menjadi tidak penting untuk internalisasi beberapa ligan tergantung clathrin (Fujimoto et al, 2000;. Salisbury et al, 1980;. Sandvig dan van Deurs, 1990). Sodium azide menyebabkan penghambatan fosforilasi oksidatif. Masing-masing inhibitor mencegah infeksi pada kedua jumlah virus input. Sebaliknya, pengobatan dengan Filipin dan nistatin (Rothberg et al, 1992;. Schnitzer et al, 1994), yang merupakan dua inhibitor dari caveolae-dimediasi serapan jalur, itu tidak berpengaruh pada infeksi papillomavirus. Namun, infeksi SV40, yang digunakan sebagai kontrol positif untuk jalur ini, terhambat di bawah kondisi ini (data tidak ditampilkan). Selain itu, jalur caveolar melewati kompartemen vesikular diasamkan sehingga efek bafilomycin A dan NH4Cl terhadap infeksi papillomavirus akan konsisten dengan serapan caveolar (Pelkmans et al., 2001).

Kami selanjutnya dianalisis subset dari inhibitor aktif dalam percobaan waktu-kursus untuk menentukan kapan masing-masing obat penghambatan diberikan pengaruhnya terhadap infeksi. Untuk menentukan di mana titik masuk jalur menular berbagai inhibitor diberikan efek mereka, inhibitor ditambahkan 2, 4, 6, atau 8 jam setelah dimulainya infeksi, atau untuk seluruh infeksi sebagai kontrol positif. Infeksi dilanjutkan selama total 12 jam, di mana titik RNA sudah siap dan dianalisis untuk kehadiran transkrip BPV (Gambar 6).

Pengobatan dengan klorpromazin atau bafilomycin A mengakibatkan kursus waktu yang sama inhibisi. Masing-masing obat ini adalah penghambat ketika ditambahkan 2 jam setelah infeksi, tetapi tidak mempengaruhi infeksi ketika ditambahkan pada titik waktu 4-h atau lambat, menunjukkan bahwa mereka menghambat aspek awal infeksi. Inferensi ini juga konsisten dengan situs yang dikenal tindakan obat. Blok klorpromazin tergantung clathrin endositosis dengan menyebabkan redistribusi AP-2 (Subtil et al, 1994;.. Wang et al, Anderson, 1993); bafilomycin A adalah inhibitor ATPase vacuolar (Lamaze et al, 1997;.. Spector et al, 1989) yang juga telah terbukti mempengaruhi transit ligan dari endosomes awal ke vesikel pembawa endosomal. Penghambatan infektivitas pada 2 jam oleh agen-agen ini konsisten dengan temuan di atas bahwa internalisasi VLPs adalah proses yang relatif lambat. Berbeda dengan inhibitor di atas, Nocodazole adalah mikrotubulus depolymerizing agen yang bertindak pada suatu titik kemudian, dengan menghalangi transportasi dari awal sampai akhir endosomes dalam beberapa jenis sel (Bayer et al, 1998;.. Bomsel et al, 1990; Parton et al., 1991). Konsisten dengan situs kemudian inhibisi, Nocodazole mencegah infeksi ketika ditambahkan melalui awal 6 jam infeksi. Ketika ditambahkan untuk final 4 jam dari infeksi, tidak ada efek. Selain itu kami menemukan bahwa pengobatan dengan Latrunculin B menghambat infeksi dengan profil yang menunjukkan tindakan yang relatif awal. Meskipun telah dijelaskan bahwa Latrunculin B dapat mencegah endositosis yang diperantarai reseptor pada tahap vesikel dilapisi pemula (Durrbach et al, 1996;.. Lamaze et al, 1997), laporan lain menunjukkan tidak ada peran aktin dalam tergantung clathrin endositosis (Fujimoto et al, 2000;.. Salisbury et al, Sandvig

dan van Deurs, 1990). Peran awal ini aktin dapat memberikan petunjuk berharga untuk identitas reseptor PV.

diskusi

Peristiwa awal infeksi virus termasuk virion lampiran reseptor seluler, penetrasi, dan uncoating, yang diikuti oleh transkripsi gen virus. Seperti disebutkan di atas, virus DNA umumnya memiliki amplop memasuki sel melalui salah satu dari dua jalur, yang tergantung clathrin endosomal vesikular jalur atau caveolae. Dalam studi saat ini, kita telah menggunakan tiga pendekatan yang berbeda untuk mengidentifikasi jalur selular yang digunakan untuk infeksi awal oleh PV: morfologi, lokalisasi subselular, dan penghambatan transkripsi virus dengan obat dengan situs yang berbeda dari tindakan. Bukti yang dikembangkan oleh masing-masing pendekatan mendukung kesimpulan bahwa PV memasuki sel melalui tergantung clathrin jalur, daripada caveolae, meskipun dengan kinetika jauh lebih lambat dari biasanya terlihat dengan proses tergantung clathrin.

Secara morfologi, PV ditemukan pada vesikel yang merupakan ciri khas dari jalur tergantung clathrin internalisasi. Dengan lokalisasi subselular, PV colocalized dengan penanda jalur ini. Biokimia, PV mRNA sintesis, digunakan sebagai indeks dari masuknya virus dan uncoating, dihambat oleh beberapa obat yang mengganggu jalur clathrindependent, tapi tidak dengan obat yang menghambat jalur tergantung caveolae.

Lubang dilapisi mengandung dua protein struktural utama, clathrin dan protein adaptor AP-2 (Pearse, 1976, 1978, 1989). AP-2 kompleks terlokalisasi pada plasma membranederived lubang dilapisi. Adaptor memainkan peran penting dalam lampiran clathrin membran dan perekrutan protein membran yang melokalisasi ke-kaya clathrin membran daerah (Beck et al, 1992;.. Chang et al, 1993;. Glickman et al, 1989; Pearse, 1988; Pearse dan Bretscher, 1981). Colocalization diamati dari PV VLPs dengan AP-2 di vesikel sitoplasma sangat berimplikasi jalur tergantung clathrin dalam penetrasi virus. Kesimpulan ini selanjutnya didukung oleh colocalization, dalam kompartemen vesikular, dari VLPs dengan reseptor transferin, yang merupakan penanda awal endosomes (Harding et al, 1983;. Yamashiro dan Maxfield, 1984), kompartemen selanjutnya dari keturunan endocytic daripada yang diidentifikasi oleh AP-2. Dalam kompartemen ini, VLPs direaksikan dengan anti-L1 antibodi 5B6, tapi tidak kuat dengan antibodi no. 9 (data tidak ditampilkan). Kedua antibodi yang menetralkan dan mengenali epitop permukaan konformasi. Namun, tidak ada. 9 bereaksi dengan bagian atas capsomers dan dapat mengganggu virion mengikat ke permukaan sel, sedangkan 5B6 bereaksi dengan sisi capsomers, di sebuah situs di atas intercapsomere cross-jembatan, dan tidak menghambat sel-permukaan mengikat (Booy et al, 1998;.. Roden et al, 1994b). Oleh karena itu, salah satu interpretasi dari hasil negatif tanpa antibodi. 9 adalah bahwa ketika virion atau VLPs berhubungan dengan clathrin atau kompartemen endosomal awal, interaksi mereka dengan reseptor begitu luas bahwa tidak ada terdeteksi. 9 mengikat dicegah.

Meskipun beberapa virus mungkin melarikan diri dari, atau mengalami uncoating dalam, endosomes awal (Bartlett et al, 2000;. Bayer et al, 1999;.. Greber et al, 1993), banyak terus passaged, melalui vesikel pembawa endosomal, sampai akhir endosomes dan kemudian ke lisosom (Zeichhardt et al., 1985). Menggunakan Lampu-2 protein sebagai penanda untuk endosomes akhir dan lisosom (Chen et al., 1985), kami menemukan bahwa itu colocalized dengan BPV L1, di lain waktu daripada colocalization diamati dengan reseptor transferin. Berbeda dengan hasil antibodi L1 dilihat dalam hubungan dengan AP-2 atau reseptor transferin, antibodi L1 no. 9 pewarnaan positif dalam kompartemen yang terkait dengan Lamp-2, sedangkan antibodi 5B6 sebagian besar negatif.

Reaktivitas positif tidak ada. 9 menunjukkan bahwa epitop ini tidak lagi ditempati oleh reseptor mengikat, sebuah disosiasi sering terlihat dengan virus lain dalam kompartemen Lamp terkait. Reaktivitas negatif untuk 5B6 menunjukkan baik bahwa partikel virus telah mengalami beberapa perubahan konformasi relatif halus atau bahwa mereka telah menjadi sebagian dibongkar. Pembongkaran substansial tampaknya tidak mungkin, seperti yang telah dilaporkan bahwa ketika BPV VLPs yang dipisahkan untuk pentamers in vitro, mereka mempertahankan kemampuan mereka untuk mengikat 5B6 tapi kehilangan mereka mengikat no. 9, dan chimeric BPV VLPs telah diidentifikasi yang mengikat no. 9 tetapi tidak 5B6 (Slupetzky et al., 2001). Pengamatan bahwa sebagian tidak. 9 bahan reaktif tidak melokalisasi dalam kompartemen Lampu dapat menunjukkan penampilan epitop ini bertepatan dengan hanya bagian dalam lisosom, meninggalkan Lampu? akhir endosomes tidak aktif.

Di atas "aliran massal" analisis berguna dalam mempelajari virus masuk. Namun, rasio partikel-to-infektivitas meningkatkan kemungkinan bahwa peristiwa produktif bisa mendominasi hasil yang diperoleh dengan pendekatan ini dan visualisasi demikian jelas otentik jalur infektif. Oleh karena itu, kami juga menganalisis produksi viral mRNA transkrip awal sebagai ukuran infeksi yang benar dan kemampuan obat yang menghambat berbagai proses endocytic mengganggu produksi transkripsi ini. Dengan menambahkan inhibitor pada berbagai waktu setelah awal infeksi, itu juga mungkin untuk menyimpulkan bila selama infeksi masing-masing obat itu cenderung aktif.

Kami menemukan bahwa klorpromazin, Latrunculin B, dan A masing-masing bafilomycin akumulasi menghambat transkrip virus jika mereka ditambahkan 2 jam setelah infeksi, tetapi tidak 4 jam setelah infeksi, sementara Nocodazole diblokir bahkan ketika ditambahkan 4 jam setelah infeksi, meskipun tidak ketika ditambahkan pada 6 jam atau lebih. Hasil ini menunjukkan PV kemungkinan menggunakan jalur clathrin endocytic dan Nocodazole yang mungkin menghambat langkah paling lambat tiga obat lain. Ringkasan percobaan ini diilustrasikan pada Gambar. 7.

Latrunculins khusus mempengaruhi sitoskeleton aktin dengan eksekusi aktin monomer (Lamaze dan Schmid, 1995;. Spector et al, 1989), dan filamen aktin telah terbukti diperlukan pada langkah-langkah awal dalam endositosis reseptor-dimediasi dalam beberapa sistem sel (Durrbach et al ., 1996; Lamaze et al, 1997).. Namun, meskipun persyaratan mapan untuk aktin dalam endositosis dalam ragi (terakhir di Geli dan Riezman, 1998), dalam sel mamalia hubungan antara sitoskeleton dan mekanisme endocytic belum jelas menunjukkan (Fujimoto et al, 2000;. Salisbury et al, 1980;. Sandvig dan van Deurs, 1990). Aktin telah terbukti menjadi penting untuk internalisasi beberapa proteoglikan heparansulfated (HSPGs) (Fuki et al., 1997, 2000). Permukaan sel heparan sulfat merupakan persyaratan untuk infeksi PV (Giroglou et al, 2001). Ini bisa mengindikasikan hubungan antara buruk didefinisikan HSPG internalisasi jalur dan jalur clathrin didefinisikan dengan baik. Studi masa depan kita akan mengeksplorasi kemungkinan ini.

Klorpromazin khusus blok clathrin-mediated endositosis dengan menyebabkan redistribusi AP-2 dari clathrin mengandung lubang (Subtil et al, 1994;.. Wang et al, 1993). Kemampuan klorpromazin dan Latrunculin B untuk menghambat awal selama infeksi menunjukkan bahwa peristiwa awal infeksi PV dimediasi oleh proses tergantung clathrin dan memerlukan aktin sitoskeleton utuh. Persyaratan aktin juga konsisten dengan hasil penelitian sebelumnya PV VLP internalisasi (Zhou et al., 1995).

Bafilomycin A telah ditunjukkan untuk mempengaruhi endosomal perdagangan awal (Bayer et al, 1998;.. Clague et al, 1994), selain penghambatan mapan yang ATPase vacuolar (Bowman et al, 1988;.. Yoshimori et al, 1991). Oleh karena itu, penghambatan dengan bafilomycin A dapat diartikan sebagai menyiratkan bahwa PV uncoating tergantung pada paparan pH rendah dan / atau yang

uncoating produktif terjadi pada akhir kompartemen endosomal. Yang terakhir kemungkinan harus dipertimbangkan secara serius, karena Nocodazole mencegah perdagangan endosomes awal untuk endosomes terlambat depolymerizing mikrotubulus. Namun, infeksi ditemukan dihambat oleh obat lysosomotropic lainnya, NH4Cl (Gambar 5) dan chloroquine (data tidak ditampilkan), menyiratkan persyaratan kemungkinan untuk pH rendah. Hal ini juga harus dicatat bahwa Nocodazole mengganggu dengan infeksi bahkan jika ditambahkan pada saat infeksi yang resisten terhadap pengobatan dengan klorpromazin, Latrunculin B, atau bafilomycin A. Sebagai proses infeksi berada di luar endosome transisi awal-ke-akhir saat itu, ini hasil menunjukkan bahwa fungsi mikrotubulus juga mungkin diperlukan pada langkah relatif terlambat, mungkin transisi dari kompartemen vesikular ke inti. Hubungan antara papillomavirus L1 dan mikrotubulus baru-baru ini telah dijelaskan (Liu et al., 2001).

Profil inhibitor dan kinetika internalisasi menunjukkan bahwa infeksi PV terjadi jauh lebih lambat dari endositosis konvensional, di mana khas kompleks ligan-reseptor transit perifer endosomes awal dalam waktu kurang dari 10 menit (Hanover et al, 1984, 1985;.. Schmid et al, 1988 ). Pengamatan kami menunjukkan bahwa virion tidak keluar endosomes awal dalam 2 jam pertama internalisasi, dengan transit mereka ke endosomes akhir terjadi sekitar 4 jam, dan mereka keluar dari endosomes akhir dalam 6 - 8-h jendela. Kami tidak memiliki penjelasan yang jelas untuk tingkat yang lambat ini. Virus JC menggunakan jalur tergantung clathrin, tetapi memasuki sel dengan kinetika lebih cepat (Pho et al., 2000). Sebaliknya, periode panjang di permukaan sel sebelum masuk juga terlihat dengan SV40 (Pelkmans et al., 2001). Namun, SV40 internalisasi mapan terjadi melalui caveolar endositosis (Anderson et al, 1996;.. Stang et al, 1997).

Mengingat bahwa polyomaviruses SV40 dan JC memasuki sel melalui jalur yang berbeda, secara teori bahwa tidak semua PV mengikuti jalur tergantung clathrin. Namun, bukti yang diterbitkan sebelumnya menunjukkan bahwa HPV 16 VLPs dapat bersaing dengan BPV untuk sel-permukaan mengikat (Roden et al., 1994a), dan di sini kami telah menemukan bahwa HPV 16 VLPs, BPV VLPs, dan BPV virion memasuki sel dengan kinetika yang sama dan melalui kompartemen yang sama. Karena HPV 16 dan BPV secara evolusi divergen (Chan et al, 1995;.. Myers et al, 1996), karena itu nampaknya semua PV memasuki sel oleh proses yang sama.

Kinetika, lokalisasi subselular, dan profil penghambatan biokimia dari PV tidak sepenuhnya sejalan dengan skema internalisasi didefinisikan. The tergantung clathrin jalur dimanfaatkan oleh interleukin-2 reseptor tidak bersinggungan dengan kompartemen endosomal. Namun, hal itu menunjukkan kinetika cepat dan tidak akan menunjukkan colocalization dengan spidol preendosomal seperti AP-2 (Lamaze et al., 2001). Beberapa racun bakteri memasuki sel melalui clathrin-independen, jalur noncaveolar. Namun, racun ini, racun kolera, shiga toxin, dan verotoxin, tidak bersinggungan dengan kompartemen endosomal kemudian dan tidak terpengaruh oleh bafilomycin, Nocodazole, dan NH4Cl. Mereka langsung diangkut dari endosomes awal ke aparatus Golgi (Falnes dan Sandvig, 2000; Mallard et al, 1998;. Nichols dan Lippincott-Schwartz, 2001; Orlandi dan Fishman, 1998). Oleh karena itu, meskipun kinetika yang atipikal untuk ligan diinternalisasikan melalui jalur tergantung clathrin, dominan bukti, termasuk colocalization dari PV dengan penanda jalur ini dan inhibisi dengan agen biokimia konsisten dengan serapan clathrin-mediated, mendukung kesimpulan bahwa infeksi terjadi melalui PV jalur ini. Penjelasan untuk tingkat yang lambat dari internalisasi dan aktin ketergantungan mungkin terletak pada identifikasi reseptor PV (s). Meskipun reseptor definitif tetap terdefinisi, ketergantungan pada keberadaan permukaan sel heparan sulfat telah mapan. HSPGs telah terbukti diinternalisasi perlahan dan jalur ini serapan dihambat oleh agen biokimia yang mempengaruhi polimerisasi aktin (Fuki et al., 1997, 2000). Jalur yang digunakan oleh

sebagian besar HSPGs belum dijelaskan. Mungkin pengamatan kami menunjukkan bahwa beberapa ligan diinternalisasi oleh asosiasi dengan HSPGs masuk ke dalam endocytic rute klasik.

Bahan dan metode

Reagen

Sel C127 ditumbuhkan dalam media dimodifikasi Eagle Dulbecco yang disuplementasi dengan antibiotik dan 10% serum janin anak sapi. Antibodi 5B6 dan tidak ada. 9, yang mengenali protein asli BPV L1, dan antibodi V5, yang mengakui asli HPV16 L1, semuanya telah dijelaskan sebelumnya (Booy et al, 1998;.. Roden et al, 1994b). Untuk beberapa percobaan biotinylated 5B6 digunakan. Konjugat ini disusun menggunakan ester Succinimidyl biotin sesuai dengan teknik standar. Tikus antibodi monoklonal mengenali AP-2 dibeli dari Affinity Bioreagents. Antiserum poliklonal kelinci diangkat ke reseptor transferin dibeli dari Santa Cruz Bioteknologi. Antibodi monoklonal tikus ABL-93, melawan Lamp-2, diberikan oleh Dr Jonathan Yewdell. HPV L1 dan BPV-1 L1/L2 VLPs dibuat dari sistem ekspresi baculovirus di SF-9 sel digambarkan sebagai sebelumnya (Kirnbauer et al., 1993). BPV-1 virion dimurnikan dari kutil sapi sesuai dengan metode yang dijelaskan sebelumnya (Roden et al., 1996).

Infeksi BPV-1 virion

Kecuali dinyatakan lain, virion dimurnikan ditambahkan ke kultur budaya patuh sel C127 dengan dosis 500 ng/106 sel. Virion yang terikat pada sel-sel di PBS, 2% FBS selama 60 menit di atas es. Virion Unbound telah dihapus oleh tiga mencuci PBS. Infeksi dimulai dengan penambahan 37 ° C media dan dilanjutkan selama 12 jam, dimana sel-sel trypsinized, dicuci dua kali dengan PBS, dan diproses untuk ekstraksi RNA. Untuk studi inhibitor, medium 37 ° C yang mengandung obat tertentu ditambahkan ke infeksi pada waktu yang ditunjukkan. Inhibitor yang digunakan pada konsentrasi berikut: bafilomycin A, 100 nM (Alexis Biokimia); klorpromazin, 25 M (Calbiochem); Filipin, 400 nM (Sigma); Latrunculin B, 63 m (Probe Molekuler); NH4Cl, 20 mM (Sigma); Nocodazole, 10 m (Calbiochem); nistatin, 27? M (Sigma), natrium azida, 63 mM (Sigma). Natrium azida diperlakukan sel diinkubasi dalam medium bebas glukosa. Semua incubations lain dilakukan dalam media pertumbuhan standar.

RT-PCR dan PCR

PCR primer untuk mendeteksi transkrip BPV adalah sebagai berikut: maju luar primer; 5? gcgcgcaccagctcgacgtccctgct 3? (BPV nt 761-780); membalikkan luar primer; 5? cacacagctctgatgggaccgcaggc 3? (BPV nt 3350-3331); maju dalam primer; 5? gcgcgcactcagatttagacctcttg 3? (BPV nt 801-820); membalikkan dalam primer: 5? cacacaggctgggctggctcggcttc 3? (BPV nt 3305-3286). PCR primer untuk mendeteksi transkrip?-Aktin adalah sebagai berikut: maju luar: 5? gcgcgcgtcatggtgggcatgggcca 3? (aktin nt 145-165); membalikkan luar: 5? cacacaccggccagccaggtccagac 3? (aktin nt 587-567); maju dalam; 5? gcgcgctgggacgacatggagaagatc 3? (aktin nt 277-297); membalikkan dalam; 5? cacacaagagtcgatgacaatgccagt 3? (aktin nt 484-504). RNA dibuat menggunakan kit RNAqueous (Ambion) sesuai dengan petunjuk produsen dengan langkah tambahan DNase 1 pencernaan (30 U / ml selama 30 menit pada 37 ° C). Satu mikrogram RNA digunakan sebagai template untuk RT-PCR

menggunakan kit RT-PCR (Roche) sesuai dengan petunjuk dari produsen. Satu mikroliter, setara dengan 2% dari reaksi selesai, digunakan sebagai template untuk putaran kedua PCR. Produk-produk dari reaksi kedua dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa.

immunofluorescent pewarnaan

Untuk mikroskop C127 sel unggulan ke acidwashed no. 01 coverslips di piring 24-baik dengan kepadatan 105 sel / baik dan berbudaya semalam. VLPs yang melekat pada sel-sel pada konsentrasi 5? G / ml dalam PBS, 2% FBS selama 60 menit di atas es. VLPs Unbound telah dihapus oleh pencucian dan sel diinkubasi dalam medium lengkap pada 37 ° C untuk waktu yang ditentukan. Sel tetap dan diproses untuk mikroskopi seperti yang dijelaskan sebelumnya (Hari et al., 1998). Untuk ganda immunofluorescent pewarnaan yang melibatkan antibodi primer dari spesies inang yang berbeda, antibodi diinkubasi serempak. Untuk pewarnaan ganda menggunakan 5B6 dan antibodi tikus kedua, 5B6 terbiotinilasi digunakan dan dideteksi dengan Texas streptavidin terkonjugasi merah setelah menyelesaikan prosedur pewarnaan untuk antibodi lainnya. Fluoresensi diperiksa dengan Bio-Rad MRC 1024 laser scanning confocal sistem yang melekat pada mikroskop Zeiss Axioplan. Semua gambar diperoleh dengan Zeiss 63? NA 1.4 Planapo obyektif. Penggunaan coverslips kontrol menetapkan bahwa fluoresensi dalam saluran hijau dan merah tidak tumpang tindih dan antibodi mengikat adalah khusus untuk antigen yang dimaksudkan. Gambar-gambar tersebut collaged dan mengalami penyesuaian skala dengan software Adobe Photoshop. Untuk analisis aliran cytometric VLPs, 5? G / ml dalam PBS, 2% FBS, terikat ke 1? 106 C127 sel dalam suspensi dengan goyang pada suhu 4 ° C selama 60 menit. VLPs Unbound telah dihapus oleh pencucian luas dengan PBS. Prewarmed 37 ° C media yang ditambahkan ke sel-sel dan titik waktu yang diambil pada waktu yang ditunjukkan. Sel diwarnai dengan 5B6 dan FITCconjugated keledai anti-tikus IgG di PBS, 2% FBS, 0,1% NaN3. Intensitas neon logaritmik dianalisis pada aliran FACSCalibur cytometer (Becton-Dickinson).