99

PENDAHULUAN

Wabah Avian Influenza (AI) H5N1 mulaiterjadi pada tahun 1990-an di Hongkong. AImerupakan penyakit yang disebabkan virusinfluenza tipe A yang termasuk ke dalam familiOrthomyxoviridae (ICTV 2006). Virus inibersifat sangat patogen dan bersifat zoonosiskarena dapat menginfeksi unggas dan manusia(Swayne 2004). Virus influenza berbentuk

pleiomorfik yaitu filamen atau sferoid (bola)dengan diameter 80-120 nm (Harris et al. 2006).

Kasus AI di Indonesia terjadi pada bulanAgustus 2003. Menurut Songserm et al., 2006,virus AI H5N1 sudah terjadi secara endemikpada perunggasan Indonesia. AI masih menjadipenyakit zoonosis yang penting karena wabahAI di Indonesia sudah menelan 115 korban jiwamanusia sampai dengan awal tahun 2009.Keadaan ini mengkhawatirkan akan terjadinya

Preparasi Imunoglobulin G Kelinci sebagai AntigenPenginduksi Antibodi Spesifik Terhadap Virus Avian Influenza

H5N1 Strain Legok

(THE PREPARATION OF RABBIT IMMUNOGLOBULIN G AS AN ANTIGENIN THE INDUCTION OF A SPECIFIC ANTIBODY AGAINST LEGOK STRAIN OF AVIAN

INFLUENZA VIRUS H5N1)

Ketut Karuni Nyanakumari Natih1,2, Retno Damayanti Soejoedono3,I Wayan Teguh Wibawan3, Fachriyan Hasmi Pasaribu3

1Balai Besar Pengujian Mutu dan Sertifikasi Obat HewanJl. Raya Pembangunan, Gunungsindur, Bogor 16340

Telpon/Fax: 021 7560489/021 7560466E-mail: bbpmsoh@plasa.com, ketutkaruni@yahoo.com

2Mahasiswa Sekolah Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor3Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas

Kedokteran Hewan, Institut Pertanian BogorJl. Agatis, Kampus IPB, Darmaga, Bogor 16680

ABSTRACT

The aim of this research was to prepare rabbit Immunoglobulin G as anti-idiotype antibody (Ab2) ofAvian Influenza Virus (AIV) H5N1. A polyclonal antibody was collected from guinea pigs immunized withinactivated AI vaccine H5N1of Legok strain. Antibody of H5N1 AI in serum was detected by Agar gelprecipitation test (AGPT) and an Inhibition Hemmaglutination test (IHT). The highest titre of antibodywas obtained one week after the third immunization. Serum of guinea pigs containing IgG was purifiedusing the Montage Antibody purification kit & spin column with Prosep A media (Millipore). The AI H5N1IgG concentration was 8 mg/ml. AI H5N1 IgG, was then digested with pepsin to obtain F(ab)2 fraction andwas called Ab1. The concentration of IgG and F(ab)2 and purity of IgG were determined by UVspectrophotometer which showed Ab1 concentration 1 mg/ml. Molecular weight was estimated by sodiumdodecyl sulfate- polyacrilamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Ab2 was produced by immunization ofrabbit with Ab1. The first immunization was carried out by subcutaneous injection with 500 µg of Ab1emulsified in Complete Freund Adjuvant. The immunization was repeated with the same dose of Ab1emulsified in Incomplete Freund Adjuvan at 1 week intervals. One week after the second immunization,rabbit’s serum was harvested and IgG was purified using the Montage Antibody purification kit & spincolumn with Prosep A media (Millipore). The rabbit IgG, called Ab2, was an anti-idiotypic antibody againstAIV-H5N1. In AGPT, a precipitation line appeared between Ab1 and Ab2. A partial reaction appearedbetween Ab2 and the AI H5N1 antigen was also detected. The results indicated that Ab2 is a possiblecandidate of imunogen for protection against an AI virus H5N1 infection.

Key word : Avian Influenza, Immunoglobulin G (IgG), anti-idiotype antibody

Jurnal Veteriner Juni 2010 Vol. 11 No. 2 : 99-106ISSN : 1411 - 8327

100

pandemi AI. Pemerintah Indonesia melakukanupaya penanganan AI berupa 9 (sembilan)langkah strategis, salah satunya adalahvaksinasi (Ditjennak 2006). Vaksinasi diyakinisebagai salah satu cara untuk mengurangi kasusklinik penyakit AI dan secara langsungmengurangi kontaminasi lingkungan oleh virusAI. Sejak tahun 2004 Indonesia sudahmenggunakan 400 juta dosis vaksin AI (Boumaet al., 2009).

Vaksin AI yang digunakan adalah vaksinAI yang telah diinaktifkan (OIE 2004).Pembuatan vaksin inaktif AI umumnyadilakukan dengan menyuntikkan virus padatelur embrio tertunas (TET) atau dibiakkanpada kultur jaringan Madin Darby CanineKidney (MDCK). Virus AI ditumbuhkan padaembrio telur ayam yang tidak mengandungvirus atau patogen apapun yang dikenal denganSpecific Pathogen Free (SPF). Virus AI yangtelah ditumbuhkan selanjutnya dimatikanuntuk dijadikan vaksin. Kendalanya adalahapabila vaksin dibuat dari virus yang virulen,maka ada kemungkinan terdapat vaksin yangdapat menimbulkan kasus penyakit dan jugamembahayakan pekerja laboratorium yangmemproduksinya.

Saat ini sedang dikembangkan suatu vaksinjenis baru yang dikenal dengan vaksin anti-idiotipe, yaitu vaksin yang dibuat atas dasaradanya daerah pengenalan antigen oleh antibodi.Pengenalan antigen dengan antibodi dapatmenghasilkan imunitas spesifik untukmencapai tujuan imunisasi. Jika hewandisuntik dengan suatu antigen, maka responimun akan terjadi pada tubuh hewan tersebut.Respon humoral yang terjadi menghasilkanantibodi (Ab) yang mengekspresikan beberapakumpulan idiotipe di daerah variable yang akandikenali oleh epitop dari antigen yangdisuntikkan. Apabila Ab1 disuntikkan kepadahewan lain, maka populasi antibodi yangmengenalinya disebut antibodi anti-idiotipe (Ab2)(Vizcaino 2004).

Penggunaan vaksin Ab2 selain sebagaivaksin alternatif untuk penyakit-penyakit yangdisebabkan oleh agen infeksius yang ganas,berbahaya dan sulit dibiakkan juga tidakmengandung risiko adanya agen infeksius yangdapat menimbulkan penyakit pada hewan yangdivaksinasi. Antibodi Ab2 dapat diproduksidalam jumlah banyak dengan biaya produksiyang lebih murah. Selain itu Ab2 yang hanyabereaksi terhadap epitop tunggal agen infeksius

mampu memberikan perlindungan protektifterhadap antigen yang memiliki banyak epitop,antibodi anti-idiotipe juga mampu meniru sifatantigenik sehingga dapat digunakan sebagaiimunogen yang dapat menimbulkan responspesifik terhadap agen infeksius (Lin dan Zhou,1995).

Tujuan penelitian ini adalah untukmenyiapkan imunoglobulin G kelinci sebagaiAb2 Avian Influenza H5N1. Abu-Shakra et al.,1997 mengatakan bahwa molekul imunoglobulinyang merupakan protein bersifat antigeniksehingga hewan yang diimunisasi denganimunoglobulin akan menghasilkan antibodi antiimunoglobulin yang dapat mencegah terjadinyapenyakit.

METODE PENELITIAN

Reidentifikasi Vaksin AI H5N1 InaktifStrain Legok

Vaksin AI H5N1 inaktif strain Legokdiekstraksi RNAnya dan diidentifikasi sub tipevirus AI-nya berdasarkan gen hemaglutinin(HA) dan neuraminidase (NA). Isolasi RNAdilakukan dengan menggunakan metodeTRIZOLR LS Reagent (Invitrogen) sebagaiberikut : sebanyak 250 ml virus AI dan 750 mlTrizol dimasukkan ke dalam tabung microtube1.8 ml, kemudian dihomogenkan memakaivortex mixer. Setelah diinkubasi selama 5 menitpada suhu kamar 25–300C, ditambahkan 500 mlchloroform. Tabung microtube tersebut dikocokdengan tangan selama 15 detik dan diinkubasipada suhu kamar selama 10 menit kemudiandisentrifus dengan kecepatan 12.000 g pada 2–80 C selama 15 menit. Sebanyak 500 ml fasecair pada supernatan (putih bening) diambil dandimasukkan ke dalam tabung baru. Setelah ituditambahkan 500 ml isoprophil alkohol dandiinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar.Larutan selanjutnya disentrifus dengankecepatan 12.000 g pada 2–80C selama 10 menit.Supernatan hasil sentrifugasi dibuang.Hasilnya adalah endapan RNA. Ke dalamendapan tersebut ditambahkan 1000 ml ethanol75% dan disentrifus dengan kecepatan 12.000 gselama 5 menit. Endapan RNA dikeringkanselama 10-15 menit pada suhu ruang danselanjutnya dilarutkan dengan 10 ml air sulingbebas Rnase atau DEPC. Tahap akhir adalahlarutan RNA diinkubasikan dalam penangas air600C selama 10 menit. Larutan RNA disimpan

Natih et al Jurnal Veteriner

101

pada –200C sampai dilakukan ReverseTranscriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).

Reverse transcription (RT) adalahpembuatan cDNA yang bersifat komplementerdengan RNA virus, menggunakan enzim reversetranscriptase. RTPCR dilakukan dengan metodeSuper ScriptTM III One-Step RT-PCR Systemwith Platinum R Taq DNA Polymerase(Invitrogen). Primer yang digunakan untukmengamplifikasi gen H5 dan N1 menurut Leeet al., 2001. Reaksi PCR (PCR mix) dibuatsebanyak 50 µl dengan komposisi 25 µl 2xreaction PCR mix , 2 µl Platinum Taq, 5 µl RNAtemplate, 1 µl Primer forward (10 µM), 1 µlPrimer reverse (10 µM) dan 16 µl ddH2O(ultrapure H2O). Campuran tersebut divortexMixer, kemudian dimasukkan ke dalam mesinPCR yang telah diprogram. Program RT-PCRadalah cDNA synthesis 60o C selama 30 menit,predenaturasi 95o C selama 2 menit, 35 siklusterdiri dari denaturasi 95o C 40 detik,penempelan 55o C selama 40 detik, ekstensi 72o

C selama 1 menit dan post ekstensi 72o C selama4 menit. Pita DNA spesifik hasil PCRdiidentifikasi dengan elektroforesis pada gelagarose 2 % (Invitrogen) dengan 3 µl ethidiumbromide.

Produksi Antibodi Poliklonal AI H5N1Produksi antibodi AI dilakukan dengan

menyuntik satu dosis vaksin AI H5N1 inaktifstrain Legok (0,5 ml) secara subkutan pada 10ekor quinea pigs. Penyuntikan diulangsebanyak dua kali dengan interval 3 minggu.Keberadaan antibodi dideteksi dengan ujihambatan hemaglutinasi (HemaglutinationInhibition Test/HIT) (WHO 2002, OIE 2005) danuji agar gel presipitasi (Agar Gel PrecipitationTest /AGPT). Jika titer antibodi tinggi dalamdarah, maka serum dikoleksi dan disimpanhingga penelitian selanjutnya

Reidentifikasi Serum Anti AI H5N1 (Ab1)Reidentifikasi serum marmut dilakukan

dengan HIT dan AGPT. Sebelum dilakukanHIT, serum marmut diinaktivasi terlebihdahulu dalam penangas air 560C selama 30menit dan diabsorbsi dengan sel darah merahayam pada temperatur ruang selama 30 menit,selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 1000g selama 5 menit dan diambil supernatannya.Selanjutnya dilakukan HIT dengan prosedurberikut: semua lubang mikroplate dimasukkan

pengencer PBS dan pada lubang pertamadimasukkan 25 µl serum. Pengenceran secaraseri kelipatan dua sampai lubang 11. Kemudianditambahkan sebanyak 25 µl antigen AI H5N14HAU. Campuran tersebut diinkubasikan padasuhu kamar selama 30 menit, kemudianditambahkan sel darah merah ayam 1%sebanyak 25 µl pada semua lubang danselanjutnya diinkubasikan pada suhu kamarselama 30 menit. Terbentuknya aglutinasimenunjukkan bahwa serum tersebut tidakmengandung antibodi terhadap virus AI,sedangkan apabila tidak terjadi aglutinasi tetapiyang terjadi adalah pengendapan sel darahmerah ayam, maka serum tersebutmengandung antibodi terhadap virus AI.Banyaknya antibodi dalam serum dinyatakandalam titer yang dihitung sampai pengencerankeberapa terjadi pengendapan sel darah merahayam? Satuannya adalah HI unit.

AGPT agar presipitasi adalah sebagaiberikut: agar gel dibuat dengan melarutkan 0.4g agarose dan 1.2 g Poly Ethylene Glycol (PEG)6000, 0.1% Na azide dalam 25 ml PBS pH 7,4dan 25 ml akuades pH 7,4. Larutan inidipanaskan dalam mikrowave sampai larut danwarna larutan menjadi bening. Larutansebanyak 3,75 ml dituangkan pada gelas objekdan ditunggu sampai mengeras, kemudiandibuat sumur-sumur dengan puncher. Antigensebanyak 20 µl dimasukkan ke dalam sumurtengah dan antibodi sebanyak 20 µl dimasukkanke dalam sumur di sekelilingnya. PembacaanAGPT dilakukan setelah 24-48 jam, hasil positifditunjukkan dengan adanya garis putih yangterbentuk di antara lubang yang berisi antigendan antibodi.

Pemurnian Imunoglobulin G Anti AI H5N1(Ab1) dan Antibodi Anti-idiotipe (Ab2)

Pemurnian imunoglobulin G (IgG) AI H5N1dari serum quinea pigs (Ab1) dan produksiantibodi anti-idiotipe (Ab2) dilakukan denganmenggunakan montage antibody purification kit& spin column with Prosep A media (Millipore).Prosep A dilepaskan dari tutup atas danbawahnya kemudian dimasukkan ke dalam spinkolom. Spin kolom dicuci dengan 10 ml bindingbuffer disentrifus dengan kecepatan 500 gselama 15 menit. Serum difilter denganmenggunakan steriflip GP filter 0,22 µm.Sampel serum dilarutkan dengan binding buffermenggunakan perbandingan 1:1 v/v, laludimasukkan ke dalam kolom spin dan

Jurnal Veteriner Juni 2010 Vol. 11 No. 2 : 99-106

102

disentrifus pada kecepatan 150 g selama 20menit. Kolom spin dicuci kembali dengan 10 mlbinding buffer dan disentrifus dengan kecepatan500 g selama 5 menit, pencucian dilakukan duakali. Imunoglobulin G dielusi dengan 10 mlbuffer elusi langsung ke dalam tabung sentrifusberisi 1,3 ml buffer netral dengan kecepatan 500g selama 5 menit. Larutan yang berada di bawahyang ditampung, merupakan IgG. Imunoglo-bulin G di desalting dengan menggunakanAmican Ultra 15 dan disentrifus dengankecepatan 4500 g selama 30 menit. Larutan yangada di atas ditampung dan merupakan IgG.

Reidentifikasi IgG AI H5N1 dilakukandengan uji AGPT dan untuk mengetahui beratmolekul IgG dilakukan SDS-PAGE denganmenggunakan sistem diskontinu, terdiri atas gelpemisah konsentrasi 12 % dan gel pengumpul14 %. Gel diwarnai dengan commassie blue danestimasi berat molekul protein berdasarkanperbandingan dengan marker umum beratmolekul. Konsentrasi IgG dihitung denganmenggunakan spektrofotometer UV.

Pemotongan Imunoglobulin G AI H5N1 danPurifikasi Fragmen F(ab)2

Pemotongan imunoglobulin G (Ig G) dariserum marmut ditujukan untuk memperolehfragmen F(ab)2 dari imunoglobulin. FragmenF(ab)2, selanjutnya disebut Ab1, akan digunakanuntuk merangsang terbentuknya antibodispesifik terhadap epitop Ab1 pada kelinci.Antibodi yang akan terbentuk oleh Ab1 inimerupakan antibodi anti-idiotipe (Ab2).Pemotongan dilakukan dengan menggunakanenzim pepsin, sehingga akan diperoleh 1fragmen F(ab)2 divalen yang mengandung 2 Fabdan 1 fragmen Fc.

Imunoglobulin G dibuat menjadi 5 mg/mldalam Na sitrat 100 mM pH 3,5. PemotonganIgG dilakukan dengan menggunakan 5 µg pepsinuntuk 1 mg IgG, kemudian diinkubasi dalampenangas air pada suhu 37 0C selama 24 jam.Setelah 24 jam reaksi dihentikan dengan Trisbuffer 3 M pH 8,8 sebanyak 10%, lalu di sentrifusdengan kecepatan 10.000 g selama 30 menit.Larutan ini kemudian didesalting denganHiTrap Desalting. Larutan hasil desaltingmerupakan F(ab)2. Reidentifikasi dilakukandengan metode SDS-PAGE. Fragmen F(ab)2memiliki berat molekul 110 Kda dan fragmenF(ab) 50 Kda. Konsentrasi dihitung denganmenggunakan spektrofotometer Ultra Violet.

Produksi Imunoglobulin G Kelinci Anti-Idiotipe (Ab2)

Imunoglobulin G Ab2 disiapkan dengan caramenyuntik kelinci dengan Ab1 (F(ab)2). Kelincidiimunisasi dengan 500 µg Ab1 H5N1 dalam CFAsecara intramuskular. Imunisasi ulangandilakukan satu minggu berikutnya denganmenyuntikkan 500 µg Ab1 dalam IFA secaraintramuskular. Satu minggu kemudian serumdikoleksi. Identifikasi keberadaan Ab2 H5N1strain Legok dengan AGPT. Berat molekulditentukan dengan metode SDS-PAGE dankonsentrasinya dihitung dengan spektofotometerultra violet.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Vaksin yang digunakan dalam pembuatanantibodi poliklonal adalah vaksin AI inaktif.Menurut Rantam (2005) vaksin inaktif yaituvaksin yang dihasilkan melalui pengrusakanvirulensinya tapi imunogenitasnya masih ada.Vaksin ini sangat aman karena tidak infeksius,tapi diperlukan dalam jumlah banyak untukdapat merangsang respon imun. Reidentifikasivaksin AI H5N1 inaktif strain Legok denganuji RT-PCR menunjukkan hasil positif terhadapvirus AI subtipe H5N1.

Keberadaan antibodi poliklonal AI H5N1dideteksi dengan uji hambatan hemaglutinasi.Hasil titer antibodi dapat dilihat pada Tabel 1.Titer antibodi seminggu setelah imunisasi ketiga tinggi (2 10.4). Li et al., 2005 melaporkanbahwa hasil titer antibodi terhadap virus AI

Tabel 1. Hasil Uji Hambatan Hemaglutinasi

Titer Antibodi pada Uji HI (log 2)Marmut

I II III

1 6 7 E”112 7 7 93 6 6 104 5 6 E”115 8 8 106 7 8 97 6 7 E”118 7 7 E”119 7 8 E”1110 7 8 E”11

Rataan 6.6 7.2 10.4

Natih et al Jurnal Veteriner

103

sebanyak 2 10 adalah tinggi dan dapat dilakukanpanen serum.

Reidentifikasi serum anti AI H5N1 (Ab1)dengan uji imunodifusi AGPT menunjukkanreaksi positif dengan antigen AI H5N1 denganterbentuknya garis presipitasi (Gambar 1). Halini berarti telah terbentuk antibodi yanghomolog terhadap virus AI H5N1 yangdiimunisasikan.

Menurut Decker (2006), antibodi serumadalah antibodi poliklonal karena antibodi inidihasilkan oleh turunan dari beberapa sel B yangmengenali epitop berbeda pada antigen yangsama. Antibodi poliklonal dihasilkan dengan caramenyuntikkan antigen ke dalam tubuh hewanlalu memurnikan antibodi dari serum darah.Antibodi ini umumnya bereaksi dengan banyakepitop.

Pengulangan vaksinasi terhadap marmutpada penelitian ini dilakukan sebanyak 3 kali,hal ini dilakukan untuk membentuk kondisihiperimun pada marmut sehingga dihasilkanantibodi dengan titer tinggi. Secara normalvaksin inaktif diperlukan dua atau tiga kalivaksinasi. Vaksinasi pertama adalah untukmemperkenalkan dan kedua sebagai boosteratau ulangan sangat diperlukan, supayaimunitasnya cukup (Rantam 2005). Titerantibodi yang tertinggi dicapai satu minggusetelah vaksinasi ke tiga. Pembentukan antibodidipengaruhi beberapa faktor, yaitu:imunogenesitas, kualitas, bentuk kelarutanstimulan, spesies hewan, rute imunisasi, dansensitivitas assay (Bellanti 1993).

Hemaglutinasi adalah fenomena aglutinasisel darah merah oleh virus tertentu antara lainoleh Influenza, sebagian besar virus Myxobeberapa virus Pox (Variola, Vaccinia danEctromelia), semua virus Reo, sebagian besarvirus Toga, beberapa virus Entero dan lainnya.Bagian virus yang mengaglutinasi sel darahmerah disebut hemaglutinin. Virus akanmenempel pada permukaan sel darah merahmelalui hemaglutinin tanpa menembus masukke dalam sel tersebut. Tempat virus menempelpada permukaan sel darah merah merupakanreseptor yang terdiri dari karbohidrat(mukopolisakarida) bersifat seperti lem dan sifatkimiawinya mirip musin pada saluranpernafasan. Hemaglutinasi terjadi karenabanyak virus melekat pada sel darah merah danbila dua sel darah merah yang mengandungpartikel virus pada permukaannya bersentuhanmereka saling menempel melalui jembatanprotoplasma yang terbentuk antara kedua sel

tersebut. Lama kelamaan terbentuk massayang cukup besar terdiri dari sel darah merahyang saling berdekatan (aglutinasi) dan karenamassa tersebut cukup berat secara perlahan-lahan akan mengendap ke dasar tabung ataumicroplate.

Hemaglutinasi oleh virus dapat dihambatoleh antibodi yang spesifik terhadap virustersebut, sehingga uji hambatan hemaglutinasidigunakan untuk mengetahui dan mengukuradanya antibodi dalam serum. Batas akhiraktivitas penghambatan adalah pengencerantertinggi dari serum yang masih dapatmenghambat secara sempurna penggumpalansel darah merah.

AGPT dilakukan untuk melihat reaksipengendapan antigen oleh antibodi spesifik.Pengendapan antigen oleh antibodi inidiperlihatkan oleh adanya garis presipitasi dimedia agar gel. Jika sediaan antibodi tidakhomolog dengan antigen maka tidak akanterbentuk garis presipitasi.

Purifikasi imunoglobulin gG (Ig) dilakukandengan menggunakan montage antibodypurification kit with Prosep A media. Purifikasidilakukan untuk mendapatkan IgG murnisehingga memudahkan proses pemotonganF(ab)2 dari Fc. Reidentifikasi IgG H5N1 denganuji imunodifusi AGPT menunjukkan reaksipositif dengan antigen H5N1, ditunjukkandengan terbentuknya garis presipitasi (Gambar2). Hal ini berarti bahwa terjadi reaksi serologiyang homolog antara IgG H5N1 dengan antigenH5N1 karena IgG H5N1 merupakan antibodispesifik terhadap virus AI H5N1. KonsentrasiIgG H5N1 yang diperoleh sebesar 8 mg/ml.

Pemotongan imunoglobulin G dengan enzimpepsin menghasilkan fragmen Fc dan F(Ab)2.Fragmen F(Ab)2 adalah antibodi 1 (Ab1), dandigunakan mengimunisasi kelinci untukproduksi antibodi anti-idiotipe (Ab2). FragmenF(Ab)2 dan Fc dipisahkan dengan prosesdesalting menggunakan HiTrap Desalting.Hasil pemurnian ini kemudian dianalisis profilpita proteinnya menggunakan SDS-PAGE(Gambar 4).

Menurut Rantam (2003), SDS-PAGE adalahprotein dielektrophoresis dalam detergen ionikyaitu SDS. Detergen ini akan mengikat residuhidrofobik dari bagian belakang peptida secarakomplit, dengan demikian protein SDS-komplekbermigrasi melalui poliakrilamid, tergantungberat molekulnya. Ada dua sistem pada SDSyaitu kontinyu dan diskontinyu. Pada sistemkontinyu campuran protein dilapiskan pada

Jurnal Veteriner Juni 2010 Vol. 11 No. 2 : 99-106

104

bagian atas (bands pada bagian atas dariseparating gel ), sehingga kelemahan padasistem ini akan terjadi resolusi dengan sampel.Pada penelitian ini menggunakan sistemdiskontinyu, protein bermigrasi dengan cepatmelaui pelarut ion pada stacking gel dan

separating gel. Protein terkonsentrasi padagaris tipis berupa pita atau band yang tipis.

Lebih lanjut Rantam (2003) menyatakanbahwa Polyacrylamide Gel Electrophoresis(PAGE) adalah merupakan metode standarpengujian terhadap berat molekul protein,

Gambar 1. Reaksi Presipitasi Serum MarmutSpesifik Terhadap Antigen Virus Avian InfluenzaH5N1 Pada Uji Agar Gel PresipitasiAg = Antigen AI H5N1; 1 = Serum marmut 1; 2 =Serum marmut 2; 3 = Serum marmut 3; 4 = Serummarmut 4; 5= Serum marmut 5; 6 = Serum marmut6; ( ) Garis presipitasi

Gambar 2. Reaksi Presipitasi Imunoglobulin GMarmut Spesifik Terhadap Antigen Virus AvianInfluenza H5N1 Pada Uji Agar Gel PresipitasiHasil Uji AGPT IgG AI H5N1Ag = Antigen AI H5N1; 1,2,3,4,5 = IgG AI H5N1;( ) Garis presipitasi

Gambar 3. Reaksi Identitas Parsial ImunoglobulinG Kelinci Spesifik Terhadap Ab1 dan Antigen VirusAvian Influenza H5N1Ag = Antigen H5N1; Ab1 = antibodi AI H5N1; Ab2= Antibodi anti-idiotipe;( ) = garis presipitasi

Gambar 4. Profil pita protein Imunoglobulin G yangtelah dipurifikasi,M = Marker umum (Invitrogen), 1= IgG Ab1, 2= IgGkelinci kontrol, 3= F(ab)2 , 4= IgG Ab2, 5= IgG rabbitstandar (Promega),

Natih et al Jurnal Veteriner

105

struktur subunit dan kemurnian protein.Poliakrilamid adalah matrik pilihan untukmemisahkan protein yang mempunyai beratmolekul antara 500-250.000 Dalton. Pori-poripada matrik dibentuk oleh rantai cross-linkinglinear polyacrylamid dengan bis acrylamide.Ukuran pori-pori berkurang sesuai denganpeningkatan total presentasi acrylamide ataupeningkatan derajat presentasi konsentrasicampuran dengan bisacrylamide. Denganpembuatan atau pemilihan total konsentrasiyang tepat akan menentukan pula ukuran yangtepat terhadap ukuran protein yang diinginkan.Jadi semakin tinggi total presentasi akanmenghalangi pergerakan protein ke dalam gel,begitu juga bila terlalu rendah total presentasiakan mengakibatkan pergerakan proteinmenjadi terlalu cepat melalui gel yangmengakibatkan didapatkan protein spesifikrendah dan tidak sesuai dengan protein yangdiinginkan. Awal terjadinya polimerasi biasanyadisempurnakan oleh ammonium persulfat dandikatalisis oleh N,N,N,N-Tetramethylethyle-nediamine (TEMED).

Pemeriksaan konsentrasi fragmen F(Ab)2menggunakan spektrofotometer UV dandiperoleh hasil sebesar 1 mg/ml. Jumlah inicukup untuk digunakan sebagai antigen, gunamenginduksi terbentuknya anti-idiotipe padakelinci. Dosis antigen berkisar antara 10-100 µg(Leenars et al. 1997, Paryati 2006, Poetri dkk2008).

Penggunaan adjuvan di dalam penelitian inibertujuan untuk meningkatkan respon imuntubuh sehingga antibodi yang terbentuk cukupbanyak. Adjuvan membantu imunogen yangkurang imunogenik dalam menggertak sistemimun tubuh. Kuby (1997) menyatakan bahwaadjuvan adalah substansi yang jikadicampurkan dengan antigen kemudiandiinjeksikan bersama-sama akan bekerjamemperbesar imunogenesitas antigen. Adjuvandigunakan untuk meningkatkan respon imunapabila antigen memiliki imunogenesitasrendah atau apabila jumlah antigen sedikit.Adjuvan juga dapat berfungsi sebagai depotantigen karena adjuvan sebagai pembawaantigen menuju lokasi sistem imun danmelepaskannya sedikit demi sedikit, sehinggamasa pembentukan antibodi berlangsung lebihlama (Leenaars et al. 1994).

Menurut Bellanti (1993) dan Rantam (2005)penggunaan adjuvan untuk memacu responsimun dengan afinitas yang tinggi dengan caramemperluas permukaan antigen danmemperlambat pelepasan antigen dalam tubuh,sehingga pembentukan antibodi lebih optimal.Adjuvan memperluas permukaan antigen danmemperlama penyimpanan antigen di dalamtubuh sehingga memberi kesempatan padasistem limfoid untuk menuju antigen.

Satu minggu setelah dua kali vaksinasidengan Ab1

dalam adjuvan, serum kelincidiperiksa keberadaan antibodi terhadap Ab1dengan AGPT. Hasil AGPT IgG kelincimenunjukkan reaksi positif yang ditandaidengan terbentuknya garis presipitasi antaraAb1 dan Ab2, artinya telah terbentuk antiboditerhadap Ab1. Antibodi ini disebut sebagaiantibodi anti-idiotipe (Ab2) Avian InfluenzaH5N1. Antibodi Ab2 ini dapat digunakan sebagaiantigen pengganti karena memilikikarakteristik yang sama dengan antigen aslinyaterlihat dengan terbentuknya reaksi identitasparsial antara antibodi anti-idiotipe AI H5N1dengan antigen H5N1. Reaksi ini menunjukkanvirus AI H5N1 mempunyai determinan antigenyang sama dengan antibodi anti-idiotipe AIH5N1. Menurut Jerne 1985, daerahhipervariabel dari imunoglobulin dapat bersifatsebagai antigen dan antibodi yang terbentuk dariantigen tersebut merupakan antibodi anti-idiotipe yang dapat berikatan secara langsungdengan paratope atau daerah pengikatan antigendari Ab1. Dari hasil AGPT ini membuktikanbahwa Ab2 mempunyai kemampuan untukmeniru struktur antigen aslinya sehingga Ab2dapat digunakan sebagai imunogen dalampencegahan infeksi virus AI H5N1.

SIMPULAN

Fragmen F(Ab)2 IgG H5N1 bersifatimunogenik karena dapat menginduksiterbentuknya antibodi anti-idiotipe (Ab2) yangmampu berikatan secara homolog denganantibodi virus AI H5N1. Imunoglobulin G kelincidapat digunakan sebagai antigen penginduksiantibodi spesifik terhadap virus Avian InfluenzaH5N1 strain Legok sehingga dapat dijadikansebagai antigen pengganti virus Avian InfluenzaH5N1.

Jurnal Veteriner Juni 2010 Vol. 11 No. 2 : 99-106

106

UCAPAN TERIMA KASIH

Ucapan terima kasih ditujukan kepadaseluruh staf Laboratorium Imunologi danLaboratorium Terpadu Departemen IPHK FKHIPB serta Kepala Balai Besar Pengujian Mutudan Sertifikasi Obat Hewan dan staf atasbantuan dan fasilitas yang telah diberikanselama penelitian.

DAFTAR PUSTAKA

Abu-Shakra M, Buskila D, Shoenfeld Y. 1997.Introduction – Idiotypes and Anti-idiotypes.Elsevier Science B.V.

Bellanti JA. 1993. Imunologi III. Terjemahan.Gadjah Mada University Press.Yogyakarta.

Bouma A, Claassen I, Natih K, Klinkenberg D,Donnelly CA, Koch G, Boven M. 2009.Estimation of Transmission Parameters ofH5N1 Avian Influenza Virus in Chickens.Plos Pathogens. 5 (1) : e1000281.

Decker JM. 2006. Antibody. http://microvet.arizona.edu.

Ditjenak. Direktorat Jendral Peternakan. 2006.Prosedur Operasional Standar PengendalianPenyakit Avian Influenza di Indonesia.Direktorat Jenderal PeternakanDepartemen Pertanian RI. Jakarta.

Harris A, Cardone G, Winkler DC, HeymannJB, Brecher M, White JM, Steven A. 2006.Influenza Virus Pleiomorphy Characterizadby Cryoelectron Tomography. Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 103 : 19123-19127.

[OIE]. Office International des Epizooties. 2004.OIE Manual of Standar for Diagnostic Testand Vaccines 4th Edition. Paris, France.

[OIE]. Office International des Epizooties. 2005.Avian Influenza. Chapter 2.7.12. Manualof Diagnostic Test and Vaccines forTerrestrial Animals. Paris

Jerne NK. 1985. The Generative Grammar ofThe Immune System. Science. 229: 1057 -1059.

Kuby J. 1997. Imunology 3. rd. New York.Freeman and Company.

Lee MS, Chang PC, Shien JH, Cheng MC, ShiehHK. 2001. Identification and Subtyping ofAvian Influenza Viruses by ReverseTranscription-PCR. J. Virol. Method. 97 :13-27.

Leenaars PPAM, Hendriksen CFM, Angulo AF,Koedam MA, Claassen E. 1994. Evaluationof Several Adjuvant as Alternatives to TheUse of Freund’s Adjuvant in Rabbits. Vet.Immunol. Immunopathol. 40:225-241.

Leenaars PPAM, Claassen E, Boersma WJA.1997. Antigen and Antigen Presentation.In: Immunology Methods Manual, I.Lefkovits (Ed). Akademic Press Ltd.,London, pp. 989-1013.

Li B, Peng J, Niu Z, Yin X, Liu F. 2005.Preparation of Anti-idiotypic AntibodyAgainst Avian Influenza Virus Subtype H9.Cellular & Molecular Immunology. 2 (2) :155-157.

Lin M, Zhou EM. 1995. Internal Image RabbitAnti-Idiotypic Antibody Detects SheepAntibodies to the Bluetongue Virus CoreProtein VP7. Immunotechnol. 1:151-155.

Paryati SPY, Wibawan IWT, Soejoedono RD,Pasaribu FH. 2006. Imunoglobulin ayamSebagai Antibodi Anti-idiotipe terhadapRabies. J. Vet. 7 (3): 92-103.

Poetri ON, Soejoedono RD, Paryati SPY. 2008.Produksi Antibodi Anti-Idiotipe SebagaiAlternatif Pengganti Virus Avian Influenza.Media Kedokteran Hewan. 24 : 74-79.

Rantam FA. 2003. Metode Imunologi. AirlanggaUniversity Press. Surabaya.

Swayne DE. 2004. Avian Influenza, Vaccine &Control. Poultry Sci. 83 : 79-81.

Vizcaino SMJ. 2004. How Many Types areKnown? Course of Introduction to the SwineImmunologi. http://www.sanidadanimal.info./inmum/elautor.htm

[WHO] World Health Organization. 2002. WHOManual on Animal Influenza. Diagnosis andSurveillance.

Natih et al Jurnal Veteriner