1

Jurnal Veteriner Maret 2009 Vol. 10 No. 1 : 1-6ISSN : 1411 - 8327

PENDAHULUAN

Faktor umur (usia) merupakan salah satufaktor yang menentukan keberhasilan kegiatanreproduksi. Beberapa penelitian melaporkanbahwa pada tikus dan mencit tua terjadipenurunan fertilitas, jumlah dan kualitasembrio yang dihasilkan, kemampuan embriountuk berkembang mencapai blastosis, sertakegagalan implantasi, bahkan tingkat kelahirananak (Day et al., 1991; Sunarti et al., 2001;Acton et al., 2004). Dalam perkembangannya,ada kalanya embrio praimplantasi mengalamigangguan, sehingga tidak semua embriopraimplantasi dapat mengalami hatching(menetas, keluar dari zona pellucida) danimplantasi yakni proses perlekatan dan infiltrasi,bahkan adakalanya disertai invasi sel-seltrofoblas kedalam selaput endometrium induk.

Kajian In vitro Aktivitas Sel-Sel Trofoblas BlastosisMencit Aging dan Pengaruhnya terhadap

Kegagalan Implantasi

(IN VITRO STUDiES OF AGING MICE BLASTOCYST TROPHOBLAST CELLS ACTIVITYAND ITS EFFECT ON THE IMPLANTATION FAILURES)

Ita Djuwita1 , Roza Helmita2, Adi Winarto1 dan Wahyudin1

1Bagian Anatomi, Histologi dan Embriologi, Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi,Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor,

Jalan Agatis Kampus IPB Dramaga Bogor 166802Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan, Universitas Lancang Kuning,

Jalan Yos Yudarso Km 8 Rumbai, Pekanbaru, RiauEmail : djuwitawiryadi@yahoo.com

ABSTRACT

The objectives of this in vitro study were to investigate the hatching rate, the outgrowth diameter andthe activity of mitochondria Nicotiamide Adenin Dinucleotide Dyhidrogenage (NADH)-CoQ reductase ofblastocysts trophoblast cells from aging mice. Blastocysts of aging (age >12 months) and young productive(age 2 months) mice were collected from the cornua utery at day-4 of pregnancy and were cultured inmDMEM medium supplemented with 10% New Born Calf Serum (NBCS), 10% ITS, and 50 µg/mlgentamicine, in 5% CO2 incubator at 37°C for 10 days. The blastocysts hatching rate and the trophoblastsmonolayer were examined for their diameter outgrowth and the NADH-CoQ reductase activity. The resultsshowed that the hatching rate, the trophoblast outgrowth diameter and the activity of NADH-CoQ reductaseof blastocysts collected from productive mice were significantly higher than those collected from the agingmice (P<0,05). It can be concluded that the impairment of blastocysts implantation especially, in agingmice were caused by the low activity of the NADH-CoQ reductase that play important role in energyproduction needed for the hatching and trophoblast outgrowth.

Keywords: aging mice, implantation, trophoblast cells, hatching, NADH- CoQ R

Kegagalan ini menyebabkan embrio tidak dapatberkontak dengan endometrium sehinggaimplantasi dan kebuntingan tidak terjadi (Horseet al., 2000; Dey et al., 2004).

Selain faktor usia tua (aging), adanyagangguan pada organel sel, khususnyamitokondria yang memegang peranan pentingdidalam proses pembentukan energi dapatmempengaruhi terjadinya kegagalan hatchingdan implantasi blastosis (Tsuzuki et al., 2001;John, 2002; Tamassia et al., 2004). Embrio tahapblastosis terdiri dari inner cell mass (ICM) yangakan menjadi fetus, blastosul serta lapisan epitelpaling luar yang disebut trofoblas yang akanberperanan dalam proses implantasi dan akanmenjadi selaput ekstraembrionik. Setelahblastosis mengalami hatching, sel-sel trofoblasakan mengalami proliferasi (pertumbuhan) dandiferensiasi menjadi berbagai tipe sel yakni giant

2

trofoblas, spongiotrofoblas, sel-sel glikogen dansel syncytio trophoblast (Frendo et al., 2003;Dey et al., 2004; Dominguez et al., 2005).

Selama perkembangan embrio pra-implantasi dari zigot sampai mencapai blastosis,terjadi peningkatan aktivitas metabolisme sertakebutuhan energi (Trimarchi et al., 2000;Ludwig et al., 2001; Blerkom, 2004). Prosespembentukan energi sangat berhubungan eratdengan aktivitas mitokondria sebagai organelpembangkit energi di dalam sel (cell powerhouse) sehingga gangguan atau rusaknyamitokondria dapat mempengaruhi prosespembentukan energi yang sangat dibutuhkandalam proses hatching dan implantasi blastosis.Didalam mitokondria pembentukan energiberupa adenosin trifosfat (ATP) terjadi melaluidua interaksi siklus metabolisme, yaitu siklusasam sitrat (siklus kreb’s) dan fosforilasi oksidasi(Klobuear dan Gorup, 2004; Brookes, 2004).Salah satu produk dari siklus asam sitrat adalahnicotinamide adenin dinucleotide dehydro-genase (NADH) yang berfungsi sebagai substratpada reaksi transduksi energi dalam sistemrantai transpor elektron (RTE) atau fosforilasioksidasi. Pelepasan energi NADH terjadi secarabertahap dengan melibatkan enzim-enzimantara lain NADH-CoQ reductase padakompleks I (Trimarchi et al., 2000; Dimauro danSchon, 2003; Blerkom, 2004). Navarro danBoveris (2007) membuktikan bahwa padamencit aging terjadi penurunan aktivitas enzimpada kompleks I dan IV dari mitokondria.

Walaupun kajian dan informasi terhadapproses implantasi secara in vitro telah banyakdilaporkan, namun kajian in vitro mengenaikegagalan hatching dan implantasi yangdikaitkan dengan kemampuan mitokondriamenghasilkan energi dan faktor umur tua(aging) terhadap pertumbuhan sel-sel trofoblasbelum dilaporkan. Penelitian ini bertujuanuntuk mempelajari dan memperoleh informasimengenai: (1) tingkat hatching blastosis, serta(2) kemampuan pertumbuhan (outgrowth) dan(3) aktivitas NADH-CoQ reductase mitokondriasel-sel trofoblas dari blastosis mencit usia tuadan muda dalam sistem in vitro. Hasil penelitianini diharapkan dapat memberi informasi dasarmengenai pengaruh faktor usia terhadapaktivitas NADH-CoQ reductase mitokondriaserta kemampuan sel-sel trofoblas untuktumbuh dan berdiferensiasi terhadap kegagalanhatching dan implantasi.

METODE PENELITIAN

Penelitian ini dilaksanakan di Labora-torium Embriologi dan Laboratorium Histologi,Departemen Anatomi, Fisiologi, dan Farma-kologi serta Unit Pelaksana Teknis (UPT)Hewan Laboratorium, Fakultas KedokteranHewan, Institut Pertanian Bogor (IPB),Dramaga Bogor.

Rancangan PercobaanBlastosis mencit dibagi kedalam dua

perlakuan, yaitu: (1) blastosis dari induk mencitumur muda (2-3 bulan) dan (2) blastosis dariinduk mencit tua (12 bulan keatas). Masing-masing kelompok dikultur sampai membentukmonolayer selama 10 hari, selanjutnya diukurpertumbuhan sel-sel trofoblas (outgrowth) danaktivitas NADH-CoQ reductase secarahistokimia. Masing-masing perlakuanmenggunakan 10 embrio.

Koleksi BlastosisMencit putih (Mus muculus albino) betina

umur muda (2 bulan) dan umur tua (12 bulankeatas) strain DDY disuperovulasi denganpenyuntikan hormon pregnant mare’s serumgonadotrophin (PMSG, Folligon®, Intervet,Netherland) dengan dosis 5 IU/ekor dan 46 jamkemudian disuntik dengan hormon humanchorionic gonadotrophin (hCG, Chorulon®,Intervet, Netherland) (dengan dosis yang sama)secara intraperitoneal (i.p.). Setelah penyuntikanhCG, mencit betina dikawinkan dengan pejantandengan perbandingan jantan : betina 1:1. Mencitbetina yang telah dikawini pejantan dicirikanoleh adanya sumbat vagina (masa perkejuanberwarna putih kekuningan di dalam lumenvagina) pada 18 jam pasca hCG dan dianggapsebagai hari pertama kebuntingan. Mencitbetina dimatikan 96-98 jam pasca hCG dengancara dislocatio cervicalis. Blastosis diperolehdengan cara membilas kedua tanduk rahimdengan menggunakan spuit 1 cc yang berisimedium Modified Phosphate Buffered Saline(mPBS). Selanjutnya embrio dicuci sebanyaktiga kali di dalam larutan mPBS (Hogan et al.,1994).

Kultur (Biakan) Blastosis Secara In VitroBlastosis yang terkoleksi dimasukkan ke

dalam 20 µl medium tetes pada cawan petri sterilyang ditutupi dengan mineral oil. Medium

Djuwita et al Jurnal Veteriner

3

kultur yang dipakai adalah Tissue CultureMedium (TCM 199 Gibco-BRL) yang diberigentamicin 50 µg/ml medium, New Born CalfSerum (NBCS) 20%. Proses kultur dilakukandi dalam inkubator dengan kadar CO2 5% padasuhu 37°C sampai blastosis mengalamihatching. Kultur selanjutnya dilakukan denganmenggunakan Dubellco’s Modified Eagles’Medium (DMEM Gibco-BRL) yang ditambahkan50µg/ml gentamicin, NBCS 20%, 1µl/ml ITS(kandungan insulin 5mg/ml, tranferin 10mg/ml,selenium 5mg/ml; Sigma St Louis USA) dan ß-mercaptoethanol 14,3 mM (Sigma St Louis USA).Blastosis dikultur selama 10 hari sampai sel-sel trofoblas membentuk monolayer (selapis sel).

Pengukuran Pertumbuhan (Outgrowth)Sel-Sel Trofoblas

Sel-sel trofoblas dalam medium kultur invitro akan tumbuh dan melakukan penjuluranke arah eksternal yang diistilahkan denganoutgrowth. Pengukuran areal outgrowth sel-seltrofoblas menggunakan eyespiece micrometerdengan mengukur panjang pertumbuhan sel-seltrofoblas mulai dari batas luar ICM sampai batasluar sel trofoblas dibawah mikroskop invertedcahaya.

Aktivitas NADH-CoQ Reductase denganPewarnaan Histokimia

Aktivitas NADH-CoQ reductase dideteksidengan pewarnaan histokimia yang dilihat dariaktivitas NADH-tetrazolium reductase (NADH-TR) berdasarkan metode Malik et al (2000)dengan modifikasi. Monolayer sel-sel blastosisdiinkubasi pada suhu 37°C, dalam campuranpereaksi yang terdiri dari: 0,2 mol/L bufer fosfat(pH 7,4) yang mengandung 0,1 mol/L sodiumlaktat, 0,1% laktat dehydrogenase (LDH;Boehringer Mannheim), 0,5 mg/ml NAD(Boehringer Mannheim) dan 0,5 mg/ml nitrobluetetrazolium (NBT; Boehringer Mannheim),selama 60 menit dalam suasana gelap. Reaksi

enzim NADH-tetrazolium reductase dihentikandengan mencuci kultur monolayer sel denganbufer fosfat 0,05 mol/L. NADH-TR akanmengubah NBT yang tidak berwarna menjadiproduk reduksi yang berwarna biru. Penilaianaktivitas NADH-TR dilakukan berdasarkanpengamatan intensitas warna biru darinitroblue tetrazolium pada sel-sel trofoblasyakni: (1) biru tua, (2) biru, (3) biru muda, dan(4) tidak berwarna biru. Warna biru tua yangditimbulkan menggambarkan bahwa fungsimitokondria pada sistem transpor elektrondalam kondisi sangat baik. Bila tidak atausangat sedikit menghasilkan warna birumenggambarkan adanya gangguan ataudisfungsi pada mitokondria terutama padasistem transpor elektron khususnya kompleksI (NADH-CoQ reductase) dalam membentukenergi.

Analisis DataData tingkat hatching blastosis dari mencit

usia tua dan muda serta data pertumbuhan sel-sel trofoblas diuji dengan analisis keragamandan dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Terkecil(BNT) menggunakan software Statistic AnalysesSystem (SAS 2000). Sedangkan data aktivitasNADH-CoQ reductase diuji dengan menggu-nakan metode Kruskal-Wallis dengan uji lanjutMultiple Comparison of Mean Ranks.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Tingkat Hatching Blastosis dari IndukMuda dan Tua (Aging)

Hasil pengamatan menunjukkan bahwapersentase blastosis yang mampu hatching padakelompok umur muda (63%) secara nyata lebihtinggi dibandingkan dengan kelompok umur tua(33%). Hal ini juga didukung oleh data tingkatabnormalitas morfologi blastosis pada kelompokumur tua (52%) lebih tinggi dibandingkan umurmuda (23%) (Tabel 1).

Tabel 1. Keadaan morfologi dan tingkat hatching blastosis mencit umur tua dan muda

Superscript yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata( P < 0.05).

Jurnal Veteriner Maret 2009 Vol. 10 No. 1 : 1-6

Umur induk (bulan)

Jumlah blastosis

Morfologi normal

(%)

Morfologi abnormal

(%)

Tingkat hatching

(%)

Gagal hatching

(%) Muda (2-3) 189 145 (77) 44 (23) 91 (63)a 54 (37)a Tua (>12) 63 30 (48) 33 (52) 10 (33)b 20 (67)b

4

Berdasarkan hasil tersebut diatas nampakbahwa faktor umur mempengaruhi morfologidan perkembangan embrio. Dengan semakinmeningkatnya umur induk terjadi penurunanjumlah dan kualitas oosit, bahkan jumlah oosityang mengalami apoptosis meningkat (Tarin etal. 2000; Collin et al. 2005) yang mengindi-kasikan semakin berkurangnya kemampuanrepro-duksi. Dengan semakin meningkatnyaumur induk, dilaporkan pula terjadinyakelainan kromosom yang dapat mengakibatkanabnor-malitas embrio bahkan atau malformasipada fetus (Collin et al. 2005).

Persentase blastosis normal yangmengalami hatching pada kelompok umur tuasecara nyata lebih rendah dibandingkan denganumur muda. Kegagalan hatching antara laindapat disebabkan oleh adanya gangguanaktivitas mitokondria sebagai organel pem-bangkit energi yang dibutuhkan untuk proseshatching.

Outgrowth Sel-Sel Trofoblas Blastosis dariInduk Muda dan Tua

Pada saat implantasi, blastosis akanmengalami serangkaian kejadian yaknihatching, adesi dan perlekatan sel-sel trofoblaske dinding endometrium, proliferasi,diferensiasi, infiltrasi, dan invasi sel-sel trofoblaske dalam endometrium. Dalam lingkungan invitro (kultur di dalam cawan petri), tidak semua

kejadian tersebut terjadi tetapi terbatas padaproses hatching, adesi, perlekatan yang diikutidengan pertumbuhan (outgrowth) dandiferensiasi sel-sel trofoblas. Outgrowth dandiferensiasi sel-sel trofoblas tersebut dapatdianalogkan dengan proses invasi secara in vivo.

Hasil penelitian menunjukkan bahwakemampuan pertumbuhan sel-sel trofoblas darimencit umur tua lebih rendah (223.5 ± 140)dibanding dengan pertumbuhan sel-sel trofoblasdari mencit umur muda yaitu 487.7 ± 291 (Tabel2). Hal ini menunjukkan bahwa faktor umurmempengaruhi kemampuan pertumbuhan sel-sel trofoblas yang berperan penting dalam prosesimplantasi embrio.

Diameter outgrowth yang rendah padakelompok umur tua menunjukkan kemampuanpertumbuhan sel-sel trofoblas yang rendah.Untuk dapat berinvasi ke dalam endometriumdan membentuk hubungan antara maternal danfetus, sel- sel trofoblas perlu melakukanproliferasi (pertumbuhan). Karenanya kegaga-lan atau terhambatnya proses pertumbuhan daninvasi sel-sel trofoblas dapat mengakibatkankegagalan implantasi. Proses pertumbuhan danperkembangan membutuhkan energi yangtinggi yang dihasilkan oleh mitokondria.Karenanya diduga terjadi penurunan fungsimitokondria dalam menghasilkan energi yangdibutuhkan untuk proses hatching danpertumbuhan sel-sel trofoblas.

Tabel 2 Diameter outgrowth sel-sel trofoblas dari mencit umur muda dan tua

Superscript yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata( P < 0.05).

Tabel 3. Aktivitas enzim NADH Co Q reductase sel-sel trofoblas blastosis dari induk umur mudadan tua.

Keterangan: 3 = biru tua (aktivitas enzim tinggi); 2 = biru sedang (aktivitas enzim sedang); 1 =biru muda (aktivitas enzim rendah) dan 0=tidak berwarna (tidak ada aktivitas enzim). Superscriptyang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata ( P < 0.05).

Djuwita et al Jurnal Veteriner

5

Aktivitas NADH-CoQ Reductase Sel-SelTrofoblas Mencit Umur Muda dan Tua

Berdasarkan intensitas warna, sel-seltrofoblas pada semua blastosis mencit umurmuda menunjukkan intensitas warna biru tua(3,0) yang mengindikasikan tingginya aktivitasNADH-CoQ reductase; sedangkan pada mencitumur tua menunjukkan intensitas warna biruyang bervariasi dengan intensitas rata-rataadalah rendah (1,0) yang mengindikasikanbahwa aktivitas NADH-CoQ reductase rendah(Tabel 3 dan Gambar 1). Hal ini menunjukkanbahwa pada blastosis dari induk umur tuaterjadi penurunan aktivitas mitokondria dalammenghasilkan energi atau ATP; dan hasil inisejalan dengan hasil penelitian Navarro danBoveris (2007) yang melaporkan bahwa terjadipenurunan aktivitas enzim NADH-CoQreductase pada sel-sel organ tubuh dari mencitaging.

Sistem transpor elektron merupakanpenghasil energi paling banyak dibandingmetabolisme lainnya. Dalam menjalankanfungsinya sistem ini menggunakan substrat,salah satunya adalah NADH. Substrat inimasuk pada kompleks I transpor elektron secarabertahap dengan melibatkan enzim-enzim

antara lain NADH-CoQ reductase. Oleh sebabitu jumlah energi yang dihasilkan olehmitokondria sangat tergantung pada aktivitasenzim NADH-CoQ reductase. Adanya gangguanpada mitokondria pada komponen kunci rantaitranspor elektron seperti NADH-CoQ reductasepada kompleks I dapat mengakibatkanterganggu atau tidak terbentuknya elektronsehingga ATP tidak dapat dihasilkan denganefisien dan dapat mengganggu fisiologis sel.

Kegagalan mitokondria diketahui berkaitandengan penyakit degeneratif dan ketuaan.Kegagalan ini diakibatkan oleh tingginya radikalbebas dan akumulasi mutasi DNA yang dapatmerusak DNA mitokondria sehingga terjadipenurunan fungsi mitokondria yang berperansebagai tempat penghasil energi atau ATP, sertamengontrol pH intraseluler dan homeostasiskalsium dalam sel (Blerkom 2004; Acton et al.2004). Patofisiologis mitokondria merupakanmarka sitoplasmik sel pada proses degeneratifaging (Thouas et al. 2005). Terganggunyafisiologis sel dapat mengakibatkan selmengalami lisis atau apoptosis sehingga sel tidakdapat tumbuh dan berdiferensiasi ke prosesselanjutnya (Dimauro dan Schon 2003; Klobueardan Gorup 2004; Blerkom 2004).

Gambar 1. Aktivitas sel-seltrofoblast blastosis. (A) Blastosis hatching; (B) Outgrowth monolayersel-sel trofoblast; (C-D) Pewarnaan histokimia NADH- tetrazolium reduktase padamonolayer sel-sel trofoblas: (C) pada blastosis mencit umur muda dengan intensitasbiru tua dan (D) mencit umur tua dengan intensitas biru muda. Garis skala: 100 µm.

Jurnal Veteriner Maret 2009 Vol. 10 No. 1 : 1-6

6

SIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian dapatdisimpulkan bahwa tingkat hatching sertapertumbuhan dan aktivitas NADH-CoQreductase sel-sel trofoblas blastosis dari indukumur muda lebih tinggi dibandingkan indukumur tua. Rendahnya aktivitas NADH-CoQreductase sel-sel trofoblas berkaitan erat dengankegagalan hatching serta rendahnyakemampuan pertumbuhan (outgrowth) sel-seltrofoblas yang selanjutnya dapat berdampakpada kegagalan implantasi.

DAFTAR PUSTAKA

Acton BM, Jurisicova A, Jurisica I, Casper RF.2004. Alterations in mitochondrialmembrane potential during preimplantationstages of mouse and human embryo develop-ment. Mol Hum Reprod 10 (1) : 23-32.

Blerkom JV. 2004. Mitochondria in humanoogenesis and preimplantation embryogene-sis: engines of metabolism, ion regulationand developmental competence. Reproduc-tion 128: 269-280.

Brookes PS et al. 2004. Calcium, ATP, and ROS:a mitochondrial love-hate triangle. Am JPhysiol Cell Physiol 287: C817-C833.

Collin et al. 2005. ESHRE capri workshop group:Fertility and ageing. Human Reproduction.11(3): 261–276.

Day JR, Lapolt PS, Morales TH, and Lu JKH.1991. Plasma pattern prolactin, proges-teron, and estradiol during early pregnancyin aging rats: relation to embryonicdevelopment. Biol. Reprod. 44:786-790.

Dey SK et al. 2004. Molecular cues to implan-tation. Endocrine Reviews 25(3): 341-373.

Dimauro S, Schon EA. 2003. Mitochondrialrespiratory-chain desease. The N Engl JMed 348 (26): 2656-2668.

Dominguez F, Ya´n˜ez-Mo M, Madrid SF, Simo´nC. 2005. Embryonic implantation andleukocyte transendothelial migration:different processes with similar players?.The FASEB Journal 19.

Fong CY et al. 2001. Ultrastructural observa-tions of enzymatically treated humanblastocysts: zona-free blastocyst transferand rescue of blastocysts with hatchingdifficulties. Hum Reprod 16(3): 540-546.

Frendo FL et al. 2003. Direct involvement ofHERV-W Env glycoprotein in humantrophoblast cell fusion and differentiation.Mol Cell Biol. 23(10): 3566–3574.

Hashash AHK El, Kimber SJ. 2004. Tropho-blast differentiation in vitro: establishmentand Characterisation of a Serum-FreeCulture Model for Murine Secondary

Trophoblast Giant Cells. Reproduction128:53-71

Hogan B, Beddington R, Costantini F, Lacy E.1994. Manipulating the mouse embrio: alaboratory manual. 2nd Ed. New York USA.Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Horse KR et al. 2004. Trophoblast differentiationduring embryo implantation and formationof the maternal-fetal interface J. Clin.Invest. 114:744-754.

John JC. 2002. The transmission of mito-chondrial DNA following assisted repro-ductive techniques. Theriogenology 57:109-123.

Klobuear NK, Gorup M. 2004. Histochemicalinvestigations of NADPH-and NADH-tetrazolium reductase Actvity in the Liverof Selenium and Copper Treated Carp(Cyprinus carpio L.). Veterinarski Arhiv 74(5): 331-340

Ludwig TE, Squirrell JM, Palmenberg AC,Bavister BD. 2001. Relationship betweendevelopment, metabolism, and mitochon-drial organization in 2-cell hamster embryosin the presence of low levels of phosphate1.Biol Reprod 65: 1648–1654.

Malik S, Sudoyo H, Marzuki S. 2000. Micropho-tometric analysis of NADH-tetrazoliumreductase deficiency in fibroblast of patientswith leber hereditary optic neuropathy. JInherit Metab Dis. 23:730-744.

Navarro A, Boveris A. 2007. The mitochon-drialenergy transduction system and the agingprocess. Am J Physiol Cell Physiol 292:C670–C686.

Sunarti, Djuwita I, dan Sukra Y. 2000. Penga-ruh Umur Induk Mencit terhadap Perkem-bangan Embrio secara In Vitro pada mencitSuperovulasi. Media Veteriner. 7(4):18-21.

Tamassia et al. 2004. In vitro embryo productioneffciency in cattle and its association withoocyte adenosine triphosphate content,quantity of mitochondrial DNA, andmitochondrial DNA haplogroup. BiolReprod 71:697–704.

Tarin JJ, Albala SP, Cano S. 2000. Consequenseon offspring abnormal function in ageinggamet. Hum Reprod. 6(6):532-549.

Thouas GA, Trounson AO, Jones JM. 2005.Effect of Female Age on Mouse Oocyte Deve-lopmental Competence Following Mitochon-drial Injury. Biol. Reprod. 73, 366–373.

Trimachi RJ et al.2000. Oxidative phosphory-lation-dependent and -independent oxygenconsumption by individual preimplantationmouse embryos. Biol Reprod 62: 1866-1874.

Tsuzuki Y, Hisanaga M, Ashizawa K, FujiharaN. 2001. The effect of dimethyl – sulfoxideand sucrose as a cryoprotectant on the adeno-sine triphosphate and ultrastructure ofbovine oocytes mature in vitro. J.Anim. Sci.14 (10): 1353-1359.

Ita Djuwita et al Jurnal Veteriner