18

3 METODOLOGI

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret-Agustus 2011. Penelitian

dilakukan di Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Laboratorium Karakteristik

Bahan Baku Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan; Laboratorium

Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu

Kelautan; Laboratorium Histopatologi, Ruang Diskusi Histopatologi, Departemen

Klinik Reproduksi dan Patologi (KRP), Fakultas Kedokteran Hewan, Institut

Pertanian Bogor.

3.2 Alat dan Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari bahan utama

berupa jeroan (usus, hati, dan ginjal) ikan bandeng (Chanos chanos). Ikan

bandeng yang diamati adalah ikan bandeng yang disimpan pada suhu chilling.

Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis proksimat meliputi H2SO4

(MERCK p.a.), kjeltab Selenium (MERCK p.a.), NaOH (MERCK p.a.), H3BO3

(MERCK p.a.), n-heksana (MERCK p.a.), dan HCl (MERCK p.a.). Bahan-bahan

yang digunakan untuk pembuatan preparat histologi terdiri dari larutan Buffer

Normal Formalin (BNF) 10% (MERCK p.a.), Bouin’s 10% (MERCK p.a.),

alkohol 50-100% (MERCK p.a.), xylol (MERCK p.a.), parafin (MERCK p.a.),

hematoksilin (MERCK), eosin (MERCK), dan mounting agent (MERCK).

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi soxhlet (SIBATA

SB 6), tabung kjeldahl (PYREX), tanur pengabuan (Yamato FM 38), timbangan

analitik (AND HF 400), oven (Yamato DV 40), cetakan yang terbuat dari kertas

kalender, rotary mikrotom (Yamato Kohki LR-85), mikroskop cahaya (Olympus

BH52), Microcular MD 130 Electron Eyepiece, serta kamera digital (Canon

A495). Alat lainnya yang digunakan dalam penelitian ini adalah peralatan uji

organoleptik.

3.3 Metode Penelitian

Ikan bandeng yang digunakan dalam penelitian ini diambil dari areal

tambak di daerah Kampung Melayu, Teluk Naga, Tanjung Pasir, Kabupaten

Tangerang-Banten. Bobot ikan yang diamati berkisar antara 200-250 gram dan

19

berumur sekitar 4 bulan. Ikan tersebut diambil menggunakan pancing. Setelah

ditangkap, ikan langsung dimatikan dengan cara menusuk kepala bagian medula

oblongata. Sebagian ikan diambil jeroannya dan dilakukan uji proksimat (kadar

air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak, dan kadar karbohidrat). Ikan lainnya

disimpan pada suhu chilling (±5 ºC) selama 17 hari (sampai ikan busuk). Ikan

yang disimpan tersebut dibuka dibagian perut dan dilakukan pengamatan

organoleptik setiap hari. Pengujian organoleptik dilakukan menggunakan

scoresheet berdasarkan dinding perut dan jeroan ikan segar (Laporan Penelitian

Lembaga Teknologi Perikanan, No. 2 1973 diacu dalam Ilyas 1983). Pengamatan

dan pembuatan preparat histologis dilakukan pada setiap fase kemunduran mutu

(prerigor, rigor, postrigor, dan busuk). Pembuatan preparat histologis

menggunakan metode parafin (Angka et al. 1990). Tahapan penelitian dapat

dilihat pada Gambar 6.

Gambar 6 Diagram alir penelitian.

Ikan bandeng

Dimatikan

Analisis

proksimat

Penyimpanan pada suhu chilling

(±5 ºC) selama 17 hari

Prerigor Rigor Postrigor Busuk

Analisis histologi

Uji organoleptik

setiap 24 jam

sekali

20

3.3.1 Uji organoleptik

Pengujian organoleptik dilakukan menggunakan scoresheet berdasarkan

dinding perut dan jeroan ikan segar (Laporan Penelitian Lembaga Teknologi

Perikanan, No. 2 1973 diacu dalam Ilyas 1983) (Lampiran 1). Pengujian

organoleptik merupakan cara pengujian kesegaran ikan yang bersifat subjektif

dengan menggunakan indera yang ditujukan pada mata, insang, lendir permukaan

badan, daging, bau, tekstur, dan isi perut (jeroan) sampel ikan. Beberapa syarat

yang harus dipenuhi oleh panelis untuk uji organoleptik (SNI 01-2346-2006),

antara lain tertarik dan mau berpartisipasi dalam uji organoleptik, terampil dan

konsisten dalam mengambil keputusan, siap sedia pada saat dibutuhkan dalam

pengujian, tidak menolak contoh yang akan diuji, berbadan sehat, bebas dari

penyakit THT dan tidak buta warna (psikologis), tidak sedang merokok, serta

jumlah panelis minimum untuk satu kali pengujian adalah 15 orang (panelis semi

terlatih). Data yang diperoleh, kemudian dilakukan analisis kesegaran ikan dengan

kriteria :

Segar : nilai organoleptik berkisar 7-9

Agak segar : nilai organoleptik berkisar 5-6

Tidak segar : nilai organoleptik berkisar 1-3

3.3.2 Analisis proksimat

Analisis proksimat merupakan metode analisis kimia untuk mengidentifikasi

kandungan nutrisi pada suatu bahan. Analisis proksimat terhadap jeroan ikan

bandeng meliputi penentuan kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak, dan

kadar karbohidrat (by difference). Prosedur uji proksimat adalah sebagai berikut:

(1) Analisis kadar air (AOAC 2005)

Tahap pertama yang dilakukan pada analisis kadar air adalah mengeringkan

cawan porselen dalam oven pada suhu (102-105) oC selama 30 menit. Cawan

tersebut diletakkan dalam desikator (kurang lebih 40 menit) hingga dingin

kemudian ditimbang sampai beratnya konstan. Sampel sebesar 5 gram kemudian

ditimbang dan dimasukkan ke dalam cawan. Cawan tersebut kemudian

dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 150 oC selama 8 jam hingga diperoleh

bobot konstan. Cawan tersebut dimasukkan ke dalam desikator dan dibiarkan

21

sampai dingin kemudian ditimbang. Perhitungan kadar air jeroan ikan bandeng

ditentukan dengan rumus :

Keterangan :

A = Berat cawan kosong (gram)

B = Berat cawan yang diisi sampel (gram)

C = Berat cawan dengan sampel yang sudah dikeringkan (gram)

(2) Analisis kadar abu (AOAC 2005)

Cawan abu porselen dibersihkan dan dikeringkan di dalam oven bersuhu

105 oC selama 30 menit. Cawan abu tersebut kemudian dimasukkan ke dalam

desikator (30 menit) dan ditimbang. Sampel sebesar 5 gram ditimbang dan

dimasukkan ke dalam cawan abu porselen. Selanjutnya dibakar di atas kompor

listrik sampai tidak berasap dan dimasukkan ke dalam tanur pengabuan (600 oC)

selama 7 jam. Cawan dimasukkan ke dalam desikator dibiarkan sampai dingin

kemudian ditimbang. Perhitungan kadar abu jeroan ikan bandeng ditentukan

dengan rumus :

Keterangan :

A = Berat cawan abu porselen kosong (gram)

B = Berat cawan abu porselen dengan sampel (gram)

C = Berat cawan abu porselen dengan sampel setelah dikeringkan (gram)

(3) Analisis kadar lemak (AOAC 2005)

Sampel sebesar 5 gram (W1) dimasukkan ke dalam kertas saring dan

selongsong lemak, kemudian dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah

ditimbang berat tetapnya (W2) dan disambungkan dengan perangkat soxhlet.

Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor perangkat soxhlet dan

disiram dengan pelarut lemak kemudian dipasang pada perangkat soxhlet lalu

dipanaskan pada suhu 40 oC menggunakan pemanas listrik selama 16 jam. Pelarut

lemak yang ada di dalam labu lemak didestilasi hingga semuanya menguap. Pada

saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan

sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak. Selanjutnya labu lemak dikeringkan

22

dalam oven pada suhu 105 oC dan didinginkan dalam desikator sampai beratnya

konstan (W3). Perhitungan kadar lemak jeroan ikan bandeng ditentukan dengan

rumus :

Keterangan :

W1 = Berat sampel (gram)

W2 = Berat labu lemak tanpa lemak (gram)

W3 = Berat labu lemak dengan lemak (gram)

(4) Analisis kadar protein (AOAC 2005)

Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari destruksi,

destilasi dan titrasi.

(a) Tahap destruksi

Jeroan ikan bandeng ditimbang sebesar 1 gram kemudian sampel tersebut

dimasukkan ke dalam tabung kjeldahl. Sebanyak 0,25 gram selenium dan 3 ml

H2SO4 pekat ditambahkan ke dalam tabung tersebut. Tabung yang berisi larutan

tersebut dimasukkan ke dalam alat pemanas. Proses destruksi dilakukan sampai

larutan berwarna bening .

(b) Tahap destilasi

Isi labu dituangkan ke dalam labu destilasi lalu ditambahkan akuades 50 ml,

air bilasan juga dimasukkan ke dalam alat destilasi dan ditambahkan larutan

NaOH 40% sebanyak 20 ml. Cairan dalam ujung tabung kondensor ditampung

dalam erlenmeyer 10 ml berisi larutan H3BO3 dan 2 tetes indikator (cairan methyl

red dan bromo cresol green) yang ada di bawah kondensor. Destilasi dilakukan

sampai diperoleh 10 ml destilat dan berwarna hijau kebiruan.

(c) Tahap titrasi

Titrasi dilakukan dengan menggunakan HCl 0,1 N sampai warna larutan

erlenmeyer berubah menjadi merah muda. Volume titran dibaca dan dicatat.

Perhitungan kadar protein jeroan ikan bandeng ditentukan dengan rumus :

23

(5) Analisis kadar karbohidrat (AOAC 2005)

Kadar karbohidrat ditentukan dengan cara by difference, yaitu hasil

pengurangan dari 100% dengan kadar air, kadar abu, kadar lemak, dan kadar

protein. Perhitungan kadar karbohidrat jeroan ikan bandeng ditentukan dengan

rumus :

Karbohidrat (%) = 100% - (% kadar air - % kadar abu - % kadar protein - % kadar

lemak)

3.3.3 Pembuatan preparat

Menurut Angka et al. (1990), pembuatan preparat histopatologi terdiri dari

tiga tahapan besar yaitu fiksasi jaringan dan parafinisasi, pemotongan jaringan,

serta pewarnaan jaringan (Lampiran 2).

(1) Fiksasi jaringan dan parafinisasi

(a) Fiksasi

Fiksasi adalah tahapan yang dilakukan untuk mencegah autolisis dan

dekomposisi postmortem dari suatu jaringan atau organ. Fiksasi juga bertujuan

untuk mengawetkan morfologi dan komposisi jaringan sehingga jaringan tetap

seperti pada keadaan semula sewaktu hidup juga mengeraskan jaringan agar dapat

diiris serta mencegah jaringan larut selama proses pembuatan preparat. Larutan

fiksatif yang digunakan adalah larutan BNF 10%. Jaringan direndam dalam

larutan fiksatif ini selama 48 jam. Perendaman dilakukan di dalam botol film

dengan volume larutan fiksatif sebanyak 15-20 kali volume jaringan.

(b) Dehidrasi

Dehidrasi merupakan proses untuk mengeluarkan cairan dari dalam sel

dengan cara merendam jaringan yang telah difiksasi ke dalam alkohol dimulai

dari konsentrasi rendah ke konsentrasi tinggi. Pertama jaringan direndam dalam

alkohol 70% selama 24 jam. Perendaman dilakukan dalam botol film yang telah

digunakan untuk perendaman dengan larutan fiksatif. Larutan fiksatif dibuang

terlebih dahulu, kemudian alkohol dengan konsentrasi 70% dimasukkan ke dalam

botol film hingga jaringan terendam. Selanjutnya organ diambil dari botol film

dan dibungkus menggunakan kain kasa. Kemudian kain kasa diikat menggunakan

benang yang dibentuk seperti teh celup agar memudahkan dalam proses

pergantian alkohol. Setelah 24 jam, organ yang dibungkus kain kasa diambil dan

24

ditiriskan diatas kertas tisu. Kemudian organ tersebut dimasukkan ke dalam botol

berisi alkohol 80%, 90%, 95%, 95% masing-masing selama dua jam dan alkohol

100% selama 12 jam dengan cara yang sama. Perendaman dilakukan pada suhu

ruang.

(c) Clearing

Clearing merupakan proses penjernihan yang bertujuan untuk menggantikan

alkohol dan sekaligus menambahkan clearing agent (xylol) yang berfungsi

sebagai pelarut parafin. Jaringan direndam dalam alkohol-xylol (1:1) selama 30

menit. Perendaman dilakukan sama halnya seperti pada perendaman dengan

alkohol pada suhu ruang.

(d) Impregnasi

Selanjutnya dilakukan tahap impregnasi, yaitu penggantian xylol dengan

parafin cair yang berlangsung di dalam oven dengan suhu 60 oC. Proses ini

dilakukan dengan perendaman jaringan ke dalam xylol-parafin (1:1) yang

diletakkan dalam gelas piala selama 45 menit. Proses perendaman dilakukan

dengan cara yang sama seperti proses perendaman sebelumnya.

(e) Embedding

Embedding merupakan proses untuk memasukkan parafin cair ke dalam sel.

Proses ini berlangsung di dalam oven dengan suhu 60 oC. Titik cair parafin, yaitu

54 o

C-58 oC. Proses ini bertujuan agar parafin menyusup ke dalam seluruh celah

antar sel dan bahkan ke dalam sel sehingga jaringan lebih tahan saat pemotongan.

Jaringan direndam secara berturut-turut ke dalam gelas piala yang berisi parafin I,

parafin II, parafin III masing-masing selama 45 menit. Proses perendaman

dilakukan dengan cara yang sama seperti proses perendaman sebelumnya.

(f) Blocking

Jaringan yang telah dilakukan proses embedding menggunakan parafin cair

lalu diblok (dicetak agar mudah dipotong) dengan parafin cair, kemudian

dibekukan. Proses ini membutuhkan cetakan yang dapat dibuat dari kertas yang

kaku, seperti kertas kalender dengan ukuran 2x2x2 cm3. Parafin cair dituangkan

ke dalam cetakan hingga memenuhi sekitar 1/8 bagian cetakan dan dibiarkan

hingga sedikit membeku. Setelah itu, jaringan disusun dalam cetakan dan dituangi

25

parafin cair hingga material jaringan terendam. Selanjutnya dibiarkan beku dalam

suhu ruang selama 24 jam.

(g) Trimming

Setelah parafin beku dengan sempurna, blok parafin dikeluarkan dari

cetakan lalu ditrimming menggunakan silet bermata satu agar dapat disesuaikan

dengan tempat blok pada alat pemotong.

(2) Pemotongan jaringan

Pemotongan jaringan dilakukan menggunakan mikrotom. Ketebalan

sayatan, yaitu 4 mikrometer. Teknik pemotongan parafin yang menggandung

preparat adalah sebagai berikut:

(a) Blok parafin yang mengandung preparat diletakkan pada tempat duduknya di

mikrotom. Tempat duduk blok parafin beserta blok parafinnya kemudian

diletakkan pada pemegangnya (holder) pada mikrotom dan dikunci dengan

kuat. Mata pisau mikrotom harus tajam agar proses pemotongan dapat

dilakukan dengan sempurna.

(b) Ketebalan potongan diatur dengan cara menggeser bagian pengatur ketebalan

hingga ketebalan yang diinginkan. Ketebalan sayatan, yaitu 4 mikrometer.

(c) Blok preparat digarakkan ke arah pisau sedekat mungkin lalu blok preparat

dipotong secara teratur dan ritmis. Pita-pita parafin yang awal tanpa jaringan

dibuang hingga diperoleh potongan yang mengandung preparat jaringan.

(d) Hasil irisan diambil dengan jarum lalu diletakkan di permukaan air hangat

dalam 45-50 oC waterbath hingga mengembang.

(e) Setelah pita parafin terkembang dengan baik, pita parafin ditempelkan pada

gelas obyek yang telah diberi zat perekat seperti albumin dengan cara

memasukkan kaca obyek itu ke dalam waterbath dan menggerakkannya ke

arah pita parafin. Setelah merekat, gelas obyek digerakkan keluar dari

waterbath dengan hati-hati dan dibiarkan hingga mengering.

(3) Pewarnaan jaringan

(a) Dewaxing

Sebelum dilakukan dewaxing, gelas obyek yang berisi jaringan diletakkan

dalam keranjang preparat yang ukurannya sesuai dengan gelas obyek. Keranjang

tersebut dapat diisi dengan 10 gelas obyek. Dewaxing merupakan proses untuk

26

mengeluarkan parafin. Wadah perendaman berupa wadah berbentuk persegi

panjang dengan ukurannya sesuai dengan keranjang untuk gelas obyek. Jaringan

pada gelas obyek yang telah diletakkan dalam keranjang direndam ke dalam xylol

1 dan xylol II masing-masing 2 menit. Lilin akan terlepas dari jaringan dan

jaringan akan tampak jernih.

(b) Hidrasi

Hidrasi merupakan proses pemasukan air ke dalam preparat jaringan pada

gelas obyek setelah proses dewaxing. Jaringan pada gelas obyek yang sebelumnya

telah melalui proses dewaxing kemudian direndam dalam alkohol 100% dalam

wadah perendaman, seperti pada proses dewaxing sebanyak dua kali, lalu secara

berturut-turut dimasukkan ke dalam alkohol 95%, 90%, 80%, 70%, dan 50%

masing-masing selama dua menit dengan cara yang sama pula. Setelah itu,

preparat jaringan direndam ke dalam akuades selama dua menit.

(c) Pewarnaan hemaktosilin-eosin

Setelah hidrasi, preparat jaringan diberi pewarna hemaktosilin-eosin.

Pertama, preparat jaringan direndam dengan pewarnaan hemaktosilin selama 7

menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 7 menit untuk menghilangkan

kelebihan zat warna yang tidak diserap. Selanjutnya preparat jaringan direndam

dengan pewarna eosin selama 3 menit dan dicuci dengan akuades.

(d) Dehidrasi

Preparat jaringan kemudian direndam dalam alkohol 70%, 85%, 90%, dan

100% masing-masing dilakukan selama dua menit. Selanjutnya preparat jaringan

direndam dalam xylol I dan xylol II masing-masing selama dua menit. Alat dan

proses perendaman yang dilakukan sama seperti proses perendaman sebelumnya.

(e) Mounting

Preparat jaringan yang telah diwarnai dapat dibuat preparat yang lebih awet

dengan cara mounting menggunakan mounting agent atau Canada Balsam.

Preparat jaringan ditutup dengan gelas penutup dan dikeringkan selama 24 jam,

kemudian diamati dibawah mikroskop.

3.3.4 Pemeriksaan preparat histologi

Pengamatan preparat awetan dilakukan dengan mikroskop cahaya Olympus

BH52 dengan perbesaran 400x. Proses pengambilan gambar dilakukan dengan

27

Micro Ocular MD 130 Electron Eyepiece. Diagram alir pembuatan preparat jeroan

ikan bandeng (Chanos chanos) dapat dilihat pada Gambar 7.

Gambar 7 Diagram alir pembuatan preparat jeroan (hati, ginjal, usus) ikan

bandeng (Chanos chanos).

Pemotongan bagian jeroan

(hati, ginjal, dan usus)

Fiksasi dengan larutan BNF 10%

Penjernihan (clearing) dengan alkohol-xylol (1:1)

Dehidrasi dengan alkohol berseri

Impregnasi dengan xylol-parafin (1:1)

Pembenaman (embedding) dalam parafin

Perekatan jaringan dengan mounting agent

Pewarnaan hematoksilin-eosin

Pelekatan pita parafin pada gelas obyek

Pemotongan dengan mikrotom

Trimming

Pengamatan dengan mikroskop

Preparat awetan

Pengambilan gambar

Ikan bandeng

28

3.4 Analisis Data

Analisis data dilakukan terhadap hasil pengukuran terhadap nilai

organoleptik jeroan ikan bandeng (Chanos chanos) dan preparat histologis.

Analisis hasil pengukuran organoleptik jeroan ikan bandeng dilakukan untuk

mencari nilai rata-ratanya. Preparat histologi dianalisis untuk mengetahui

gambaran jeroan ikan bandeng secara histologis.

3.4.1 Organoleptik

Hasil pengukuran terhadap nilai organoleptik jeroan ikan bandeng (Chanos

chanos) dicari nilai rata-ratanya Nilai rata-rata tersebut dihitung menggunakan

rumus berikut (BSN 2006):

X=

Keterangan:

X : nilai rata-rata

Xi : nilai X ke-i

N : jumlah data

3.4.2 Histologi

Gambaran histologis dianalisis secara deskriptif kualitatif dengan melihat

preparat histologi di bawah lensa mikroskop. Hasil yang diperoleh dibandingkan

dengan jaringan ikan normal secara umum.

17

Pewarnaan histologi pada umumnya menggunakan kombinasi hematoksilin

dan eosin (HE). Hematoksilin dan eosin adalah metode pewarnaan yang berfungsi

ganda. Pertama memungkinkan pengenalan komponen jaringan tertentu dengan

cara memulasnya secara differensial. Kedua, dapat memulas dengan tingkat atau

derajat warna berbeda yang menghasilkan kedalaman pulasan yang berbeda.

Hematoksilin berasal dari ekstrak dari pohon yang diberi nama logwood tree.

Pada pulasan H & E, kompleks warna hemaktosilin berwarna ungu tua. Pewarna

eosin memberikan warna merah muda sampai merah pada komponen jaringan

yang tidak terpulas ungu-biru oleh hemaktosilin. Hematoksilin bekerja sebagai

pewarna basa. Zat ini mewarnai unsur basofilik pada jaringan. Eosin bersifat asam

serta memulas komponen asidofilik pada jaringan (Cormack 1992).

Mounting adalah suatu proses perekatan sayatan jaringan pada kaca sediaan

menggunakan bahan perekat (adhesive). Proses mounting dilakukan menggunakan

mounting media. Mounting media merupakan zat pengisi antara preparat yang

telah diwarnai dengan kaca penutup. Terdapat dua jenis mounting media, yaitu

dalam bentuk resin dan cairan. Resin media terdiri dari tiga tipe, yaitu alami, semi

sintetis, dan sintetis sepenuhnya. Contoh resin media adalah Canada Balsam.

Canada balsam merupakan mounting alami yang terdiri dari komponen volatil,

yaitu resin yang merupakan cairan kental berwarna kuning dan meleleh ketika

dipanaskan. Balsam yang dikeringkan akan berbentuk padat dan harus

ditambahkan xylene sehingga dapat digunakan sebagai mounting media.

Komponen tak jenuh dalam resin membuat Canada balsam sebagai agen

pereduksi ringan. Oleh karena itu, media Canada balsam dapat mempertahankan

warna pada preparat awetan histologi lebih dari satu bulan atau satu tahun. Contoh

mounting media dalam bentuk cairan, antara lain Gliserol jelly, Buffer gliserol

dengan PDD, fructose syrup, dan Apathy’s medium (Cormack 1992).

Penutupan kaca obyek dilakukan dengan menutupkan kaca penutup di atas

sajian, sehingga apabila xylol dalam media penjernih menguap maka kaca

penutup melekat erat dengan kaca obyek. Hal ini dilakukan agar permukaan yang

dihasilkan tidak menyebabkan pantulan cahaya selama pengamatan mikroskopis

(Geneser 1994).