19

3. METODE PENELITIAN

3.1 Materi Penelitian

3.1.1 Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun mangrove Nypa

fruticans yang diperoleh dari Konservasi Hutan Mangrove “Clungup Mangrove

Conservation” Kabupaten Malang, Jawa Timur. Daun diambil dari pohon

mangrove Nypa fruticans yang berumur kisaran 5 tahun. Tanaman ini tumbuh

rapat bersama dan biasanya membentuk komunitas yang luas disepanjang

sungai dekat muara sungai dengan air payau. Bentuk buahnya bulat seperti buah

pandan dengan panjang bonggol hingga 45 cm. Daunnya memanjang seperti

daun pada pohon kelapa yang memiliki ruas daun (Kitamura et al., 1997).

Penelitian ini terdiri dari beberapa tahapan yaitu proses ekstraksi sampel,

uji fitokimia, uji aktivitas antioksidan dan uji toksisitas. Bahan-bahan yang

digunakan pada proses ekstraksi senyawa bioaktif pada sampel meliputi

metanol, kertas saring, plastik wrap, aluminium foil dan kertas label. Setelah

memperoleh ekstrak kasar, maka dilakukan pengujian fitokimia menggunakan

bahan-bahan antara lain aquades, asam sulfat 2 N, asam sulfat pekat, HCl pekat,

HCl 2 N, kloroform, etanol, pereaksi meyer, FeCl3 10%, serbuk magnesium,

amonia pekat dan asam asetat anhidrat. Pada pengujian toksisitas

menggunakan bahan antara lain air laut dan starter indukan telur Artemia salina

Lench. Pada pengujian aktivitas antioksidan menggunakan bahan antara lain

methanol, DPPH, alumunium foil, kertas label dan asam askorbat.

3.2.1 Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari alat-alat untuk

ekstraksi sampel daun mangrove nipah adalah timbangan digital, oven, rotary

20

evaporator, gelas ukur, erlenmeyer, beaker glass, botol kaca, spatula dan

corong. Alat yang digunakan untuk pengujian fitokimia yaitu tabung reaksi, rak

tabung reaksi, beaker glass 100 ml, pipet tetes, pipet volume, gelas ukur,

spatula, labu ukur, bola hisap dan timbangan digital. Pada pengujian toksisitas

menggunakan alat timbangan digital, mikro pipet, spatula, corong, botol vial,

beaker glass, gelas ukur, aerator, selang, cover glass, bola hisap, pipet serologis

dan pipet volume. Pada pengujian total fenol menggunakan alat gelas ukur,

waterbath, labu ukur, beaker glass, pipet volume, timbangan analitik, spatula,

tabung reaksi, rak tabung reaksi, bola hisap dan spektofotometri UV-Vis. Pada

pengujian aktivitas antioksidan menggunakan alat gelas ukur, beaker glass, botol

vial, pipet serologis, bola hisap, pipet tetes spatula, spectofotometri UV-Vis.

3.2 Metode Penelitian

Metode merupakan suatu kerangka kerja untuk melakukan suatu tindakan

atau juga dapat di sebut sebagai kerangka berfikir dalam penyusunan suatu

gagasan dengan maksud dan tujuan tertentu. Penelitian merupakan suatu

kegiatan mengkaji secara teliti dan teratur dalam suatu bidang ilmu tertentu yang

menurut pada suatu kaidah yang disebut metode (Notohadiprawiro, 2006)

Metode yang di gunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimen.

Metode eksperimen bersifat laboratoris. Penelitian dilakukan secara sengaja

dengan cara memberikan perlakuan tertentu terhadap subjek penelitian guna

membangkitkan suatu kejadian atau keadaan yang akan diteliti untuk diketahui

bagaimana akibatnya (Jaedun, 2011).

3.2.1 Variabel Penelitian

Variabel penelitian gejala yang dapat diukur menurut objektivitasnya,

reabilitas dan validalitas ilmiah. Dilihat dari peran dan posisinya, variabel dibagi

atas variabel bebas dan variabel terikat. Veriabel bebas merupakan variabel

21

penjelas, penentu dan penduga, sedangkan variabel terikat adalah variabel

konsekuensi atas akibat (Suryana, 2010).

Variabel bebas dari penelitian ini adalah suhu dan lama waktu

pengeringan yang berbeda. Kedua variabel ini akan menentukan berapa suhu

dan waktu opimal yang selanjutnya akan digunakan untuk menentukan nilai IC50.

Variabel terikat pada penelitian ini adalah nilai aktivitas antioksidan yang

diukur dengan LC50 menggunakan analisa probit yang diperoleh dari pengujian

toksisitas dengan menggunakan hewan uji Artemia salina Lench dengan metode

BSLT, nilai IC50 yang diperoleh dari hasil akumulasi persentase nilai IC50 dari

masing-masing larutan konsentrasi larutan ekstrak pada tiap jenis pelarutnya.

3.2.2 Rancangan Penelitian

Rancangan penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap

(RAL) faktorial dengan 3 ulangan. Faktor pertama adalah suhu pengeringan

bahan (40, 50, 60ºC) dan faktor ke dua adalah lama waktu pengeringan (24, 36,

48 jam). Data hasil penelitian dianalisis dengan menggunakan ANOVA (Analysis

of Variance) untuk mengetahui pengaruh perlakuan terhadap respon parameter

yang dilakukan, dengan uji F pada taraf 5% dan 1% dan jika didapatkan hasil

yang berbeda nyata maka dilakukan uji Tukey pada taraf 5% (Sastrosupadi,

2000).

Peneitian pendahuluan dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui

pelarut apakah yang paling baik digunakan untuk mendapatkan nilai rendemen

tertinggi pada sampel daun mangrove yang sebelumnya diberikan perlakuan

pengeringan menggunakan suhu 40ºC dan lama waktu 24 jam. Menurut Hermani

dan Rahmawati (2009) kadar flavonoid tertinggi dihasilkan dari pengeringan suhu

oven 40ºC selama 24 jam. Untuk daun yang dikeringkan dengan oven, produk

22

akan berwarna lebih hijau dari pada di keringkan dengan sinar matahari karena

suhu yang di gunakan lebih stabil.

3.2.3 Parameter Uji

Parameter uji pada penelitian ini adalah uji kuantitatif, yaitu berdasarkan

data yang diperoleh dari hasil perhitungan probit nilai LC50 dan perhitungan rata-

rata nilai IC50 dari masing-masing pelarut. Nilai LC50 menunjukkan besarnya

konsentrasi suatu bahan uji yang dapat menyebabkan 50% kematian hewan uji

setelah perlakuan 24 jam. Data tersebut dianalisis menggunakan probit analisis

untuk mengetahui nilai LC50. Jika nilai LC50 masing-masing ekstrak senyawa uji

kurang dari 1000 µg/mL maka dianggap menunjukkan adanya aktivitas biologik

(Nisfi, 2010). Sedangkan nilai IC50 merupakan konsentrasi larutan sampel yang

mampu mereduksi aktivitas DPPH sebesar 50% (Ika, 2013). Selain itu parameter

uji dalam penelitian ini juga terdiri atas perhitungan rendemen, kadar air serta uji

fitokimia.

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Penelitian Tahap 1

Penelitian tahap 1 bertujuan untuk mengetahui ekstrak terbaik yaitu pada

suhu dan lama waktu paling optimal dari daun nipah serta untuk mengetahui

fitokimia, rendemen, serta nilai LC50 dari sampel daun mangrove nipah dengan

tiga pelarut yang berbeda, yaitu n-heksan, etil asetat, dan metanol sehingga

dapat diperoleh pelarut terbaik yang akan digunakan untuk penelitian utama.

Pada penelitian ini, digunakan sampel daun yang dioven pada suhu 40ºC selama

24 jam. Menurut Hermani dan Rahmawati (2009) kadar flavonoid yang tertinggi

dihasilkan dari pengeringan suhu oven 40oC selama 24 jam. Untuk daun yang

dikeringkan dengan oven, produk akan berwarna lebih hijau dari pada

dikeringkan dengan sinar matahari karena suhu yang digunakan lebih stabil.

23

a. Ekstraksi Sampel (Fathonah, 2016)

Ekstraksi sampel menggunakan metode maserasi bertingkat. Pelarut yang

digunakan adalah n- heksan, etil asetat, dan metanol. Sampel dalam bentuk

kering diambil sebanyak 150 g dan dilarutkan dalam pelarut non polar yaitu n-

heksan dengan perbandingan 1:4 (b/v) sebanyak 600 ml. Kemudian

dihomogenkan dengan magnetic stirer selama 24 jam pada suhu 28-30ºC. Hasil

maserasi sampel dalam pelarut n-heksan disaring dengan kertas saring halus

dan menghasilkan filtrat dan residu. Filtrat dari n-heksan (A) kemudian di

pisahkan dari pelarut menggunakan vacuum rotary evaporator suhu 40-50 ºC.

Kemudian sisa pelarut pada ekstrak diuapkan dengan menggunakan nitrogen

sehingga diperoleh ekstrak pekat. Residu dari ekstrak A dimaserasi kembali

dengan pelarut etil asetat sebanyak 600 ml dan dihomogenkan dengan magnetic

stirer selama 24 jam pada suhu 28-30 ºC. Kemudian disaring sehingga diperoleh

ekstrak etil asetat (B) dan residu. Ekstrak etil asetat (B) kemudian dilakukan

pemisahan dengan pelarut menggunakan vacuum rotary evaporator suhu 40-50

ºC. Lalu sisa pelarut pada ekstrak diuapkan dengan nitrogen sehingga diperoleh

ekstrak pekat. Residu dari ekstrak B dimaserasi kembali dengan pelarut metanol

sebanyak 600 ml dan di homogenkan dengan magnetic stirer selama 24 jam

pada suhu 28-30 ºC. Kemudian disaring sehingga diperoleh ekstrak metanol (C)

dan residu. Ekstrak metanol (C) kemudian dilakukan pemisahan dengan pelarut

menggunakan vacuum rotary evaporator suhu 40-50 ºC. Lalu sisa pelarut pada

ekstrak diuapkan dengan menggunakan nitrogen sehingga diperoleh ekstrak

pekat. Proses ekstraksi sampel dapat dilihat pada Gambar 2.

24

Gambar 2. Metode Ekstraksi Sampel daun mangrove Nypa fruticans

Ditimbang bahan baku yang dikeringkan suhu 40ºC selama 24jam sebanyak 150 g

Dihomogenkan dengan magnetic stirer selama 24

jam suhu 28-30℃

Di tambahkan metanol 1:4

Dihomogenkan dengan magntic stiter selama 24 jam suhu

28-30ºC

Disaring dengan kertas saring

residu

Ditambahkan n-heksan 1:4 (b/v)

Dihomogenkan dengan magnetic stirer selama 24 jam suhu 28-30℃

Disaring dengan kertas saring halus

Filtrat

Dievaporasi suhu 40-50℃

Diuapkan sisa pelarut

dengan nitrogen

Ekstrak n-heksan pekat

(A)

Residu (g)

Ditambahkan etil asetat 600 ml (1:4)

Disaring dengan kertas saring halus

Filtrat Residu(g)

Dievaporasi suhu 40-50ºC

Diuapkan sisa pelarut dengan gas nitrogen

Ekstrak etil asetat pekat (B)

filtrat

Dievaporasi suhu 40-50ºC

Diuapkan sisa pelarut dengan gas nitrogen

Ekstrak metanol pekat (C)

analisis

analisis

analisis

25

b. Perhitungan Rendemen (Yulia, 2007)

Nilai perhitungan rendemen menunjukkan jumlah ekstrak jumlah

ekstrak sampel yang diperoleh dari setiap gram sampel yang diekstrak

(%w/w). Perhitungan rendemen adalah sebagai berikut:

% rendemen =

x 100%

c. Uji Fitokimia

Uji fitokimia merupakan tahap selanjutnya dari proses ekstraksi bahan

baku yang bertujuan untuk mengetahui kandungan bioaktif yang terkandung

dalam ekstrak tersebut. Uji fitokimia yang dilakukan meliputi uji alkaloid, uji

tannin, uji steroid, uji terpenoid, uji saponin dan uji flavonoid.

Uji Alkaloid (Nafisah et al., 2014)

Sampel diuji kandungan senyawa alkaloid menggunakan prinsip

mereaksikan ekstrak sampel dengan asam dan pereaksi Meyer. Ekstrak dari

sampel sebanyak 1 ml dimasukkan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan

5 tetes amonia pekat. Setelah itu larutan disaring dan selanjutnya

ditambahkan 2 N dan dikocok sampai terbentuk lapisan atas dan bawah.

Larutan tersebut kemudian ditambahkan 1 tetes pereaksi Meyer, apabila

positif alkaloid maka akan terbentuk endapan. Pengujian alkaloid dari

ekstrak daun Nypa fruticans dapat dilihat pada Gambar 3.

26

Gambar 3. Uji Alkaloid

Uji Tannin (Marliana, et al., 2005)

Ekstrak dari sampel sebanyak 3 ml ditambahkan aquades sebanyak 3 ml.

Larutan tersebut ditambahkan 5 tetes NaCl 10% lalu disaring. Filtrat dibagi

menjadi 3 bagian yaitu A, B, C. Filtrat A sebagai larutan blanko, filtrat B

ditambhakan pereaksi FeCl3 1% sebanyak 3 tetes, lalu filtrat C ditambahkan

larutan garam gelatin. Kemudian diamati perubahan yang terjadi. Uji tannin

dalam ekstrak sampel dapat dilihat pada Gambar 4.

Ekstrak daun Nypa fruticans

Dimasukkan kedalam tabung reaksi

Ditambahkan ammonia pekat

Disaring dengan kertas saring halus

Ditambahkan asam sulfat 2N dan dikocok hingga terbentuk lapisan

Ditetesi pereaksi Meyer

Diamati perubahan yang terjadi. Positif alkaloid jika terbentuk endapan putih, coklat, dan jingga

27

Gambar 4. Uji Tannin

Uji Flavonoid (Darminto, et al., 2009)

Ekstrak sebanyak 1 ml ditambahkan 2 ml etanol 95%, 0,5 g serbuk

Mg, dan 2 ml HCN 2 N. Larurtan didiamkan selama 1 menit, kemudian

ditambahkan 2 ml HCN pekat. Larutan positif apabila terbentuk warna kuning

sampai jingga. Uji flavonid dapat dilihat pada Gambar 5.

Gambar 5. Uji Flavonoid

Ekstrak daun Nypa fruticans

Dimasukkan kedalam tabung reaksi

Ditambahkan aquades, NaCl 10%

Ditambahkan FeCl3 1% sebanyak 2-3 tetes

Ditambahkan asam sulfat 2N dan dikocok hingga terbentuk lapisan

Diamati perubahan yang terjadi. Positif tannin jika terbentuk warna coklat kehijauan atau biru kehitaman

Ekstrak kulit batang Nypa fruticans

Ditambahkan etanol 95%, serbuk Mg, dan HCl 2 N

didiamkan

Ditambahkan HCl pekat

Diamati perubahan yang terjadi. Positif alkaloid jika terbentuk warna kuning sampai jingga

28

Uji Steroid (Sangi et al., 2008)

Sebanyak 50 mg sampel uji ditambahkan asam asetat anhidrat

sampai sampel terendam semuanya, dibiarkan selama kira-kira 15 menit.

Kemudian 6 tetes larutan dipindahkan ke dalam tabung reaksi dan di

tambahkan 3 tetes asam sulfat pekat. Adanya triterpenoid ditunjukkan

dengan terjadinya warna merah, jingga, atau ungu, sedangkan adanya

steroid ditunjukkan dengan adanya warna biru dan jika warna berubah

menjadi hijau kebiruan maka positif sterol. Pengujian steroid dan terpenoid

pada ekstrak daun mangrove Nypa fruticans dapat dilihat pada Gambar 6.

. Gambar 6. Uji Steroid dan Terpenoid

Uji Saponin (Rasyid, 2012)

Pengujian saponin dilakukan menggunakan metode Forth yaitu

melihat ada atau tidaknya busa yang terbentuk dengan mereaksikan sampel

dan air. Ekstrak kasar sampel diambil sebanyak 1 g dan ditambahkan 10 ml

aquades. Larutan dipanaskan selama 5 menit. Kemudian larutan

dimasukkan tabung reaksi dalam keadaan panas lalu dikocok secara vertikal

selama 10 detik. Hasil positif apabila terbentuk busa yang stabil dan tidak

hilang saat ditambahkan satu tetes HCN 2 N. Uji saponin dapat dilihat pada

Gambar 7.

Ekstrak daun Nypa fruticans

Ditambahkan asetat anhidrat

Ditambahkan asam sulfat pekat

Diamati perubahan yang terjadi. Positif steroid jika terbentuk warna biru atau hijau kebiruan dan positif triterpenoid jika terbentuk warna merah

jingga atau ungu

29

Gambar 7. Uji Saponin

d. Uji Toksisitas Menggunakan Metode Brine Shrimp Lethality Test Penyiapan Larva Artemia salina Lench. (Muaja et al., 2013)

Penyiapan larva Artemia salina Lench. Dilakukan dengan cara mengambil

telur Artemia salina Lench. sebanyak 1 g dan ditetaskan dengan cara merendam

telur tersebut dalam air laut buatan sebanyak 2 L dan diberi penerangan dengan

lampu pijar 40-60 watt serta diaerasi selama 48 jam. Telur Artemia salina Lench.

akan menetas menjadi nauplii instar III/IV yang siap digunakan sebagai hewan

uji. Air laut buatan dibuat dengan cara melarutkan 40g garam dalam 2 L air

kemudian disaring. Penetasan telur Artemia salina lench. dapat dilihat pada

Gambar 8.

Ekstrak daun Nypa fruticans

Ditambahkan aquades

Dipanaskan

Diamati tidak ada busa. Positif jika terbentuk busa yang stabil dan tidak hilang saat ditambahkan satu tetes HCl 2 N

Dimasukkan dalam tabung reaksi dan dikocok vertikal

30

Gambar 8. Penetasan telur Artemia salina Leach.

Penentuan Konsentrasi Larutan Ekstrak dan Uji Toksisitas Artemia salina Leach. (Muaja et al., 2013)

Penentuan konsentrasi larutan uji yang digunakan dimulai dari

pembuatan larutan induk dengan konsentrasi 2000 ppm yang di buat dari

melarutkan 40 mg ekstrak sampel dalam 20 ml air laut. Larutan induk

tersebut kemudian diencerkan kembali hingga menghasilkan larutan dengan

konsentrasi 1000, 500, 100, 50, 25, dan 12,5 ppm serta 0 ppm tanpa

tambahan ekstrak sampel digunakan sebagai kontrol. Perhitungan untuk

konsentrasi larutan uji dapat dilihat pada Lampiran 1.

Uji toksisitas dilakukan dengan mengisikan 5 ml larutan ekstrak dari

masing-masing sampel (A, B, C) untuk tiap konsentrasinya ke dalam botol

vial, sehingga ada 19 botol vial untuk 1 kali ulangan. Lalu 10 ekor Artemia

salina Leach. dimasukkan kedalam masing-masing botol vial tersebut.

Pengamatan jumlah larva Artemia salina Leach. yang mati dilakukan selama

24 jam ditiap 6 jam sekali. Skema uji toksisitas dapat dilihat pada Gambar

10.

Telur Artemia salina Leach.

Direndam dalam air laut dalam wadah toples

Diaerasi sampai telur menetas

Artemia salina Leach. umur 48 jam siap digunakan

31

Gambar 9. Skema Uji Toksisitas

3.3.2 Penelitian Tahap 2

Penelitian tahap 2 (utama) bertujuan untuk mengetahui pengaruh

perbedaan interaksi suhu dan lama waktu pengeringan ekstrak daun Nypa

fruticans terhadap nilai LC50 dan IC50 dari ekstrak tersebut. Penelitian ini

menggunakan bentuk sampel yang telah diberi perlakuan pengeringan dengan 3

suhu yang berbeda dan 3 lama waktu yang berbeda yaitu suhu 40ºC, 50ºC dan

60ºC dan lama waktu 24 jam, 36 jam dan 48 jam. Proses preparasi bahan sama

seperti pada penelitian tahap 1 yang kemudian dilanjutkan dengan proses

ekstraksi secara bertingkat. Pada penelitian tahap 2 (utama) ini juga

ditambahkan parameter uji yang meliputi uji kadar air, total fenol dan analisa

ekstrak menggunakan LC-MS.

Ekstrak daun mangrove Nypa Fruticans diberi perlakuan pengeringan

berbeda terlebih dahulu yang terdiri dari 3 suhu yaitu 40, 50, 60ºC dan 3 lama

waktu pengeringan yaitu 24, 36, 48 jam. Kemudian dimaserasi dengan pelarut

Disiapkan larutan stock 2000 ppm

Diencerkan larutan stock dengan konsentrasi 1000, 500, 100, 50, 25, dan 12,5 ppm

Dibuat kontrol (0 ppm)

Larutan dipipet dan dimasukkan dalam botol vial

Dimasukkan larva Artemia salina Leach. pada tiap perlakuan

Diamati jumlah larva yang mati dan dihitung

32

metanol yang bersifat polar universal. Proses maserasi ini akan menghasilkan 9

ekstrak dengan perlakuan pengeringan berbeda dan dilakukan pengulangan

sebanyak 3 kali. Adapun rancangan penelitian utama dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Rancangan Penelitian

Perlakuan Interaksi suhu dan lama waktu

Waktu 24(x) 36(y) 48(z)

Suhu I II III I II III I II III

40 (A) Ax1 Ax2 Ax3 Ay1 Ay2 Ay3 Az1 Az2 Az3

50(B) Bx1 Bx2 Bx3 By1 By2 By3 Bz1 Bz2 Bz3

60(C) Cx1 Cx2 Cx3 Cy1 Cy2 Cy3 Cz1 Cz2 Cz3

a. Uji Kadar Air (Legowo et al., 2004)

Metode analisis kadar air yang dilakukan menggunakan metode oven

kering (metode termogravimetri) yang didasarkan pada prinsip perhitungan

selisih bobot bahan (sampel) sebelum dan sesudah pengeringan. Selisih bobot

tersebut merupakan air yang teruapkan dan dihitung sebagai kadar air bahan.

Langkah-langkah analisis kadar air dengan metode termogravimetri adalah

sampel sebanyak 2 sampai 5 g ditimbang pada cawan yang sudah diketahui

bobotnya lalu dikeringkan pada oven suhu 105º C selama 4 sampai 6 jam.

Setelah itu didinginkan dalam eksikator dan ditimbang hingga diperoleh bobot

tetap. Bobot dianggap konstan bila selisih penimbangan tidak lebih dari 0,2 mg.

Perhitungan kadar air diperoleh dengan membandingkan bobot sampel sebelum

dikeringkan dan bobot yang hilang setelah dikeringkan dikali 100%. Rumus

perhitungannya sebagai berikut:

Kadar air (% bb) =

x 100%

(% bk) =

x 100%

Keterangan : a = berat bahan awal ; b = berat bahan akhir; bb = berat basah;

bk = berat kering

a. Total Fenol

33

Pembuatan Kurva Standart Asam Galat (Ratnayanti et al., 2012)

Larutan stok asam galat dengan konsentrasi 100 ppm (mg/L) dibuat

dengan melarutkan 0,01 g asam galat dalam labu ukur 100 mL dan

ditambahkan akuades sampai tanpa batas. Diambil sebanyak 0; 0,2; 0,4;

0,8; 1,6 dan 3,2 mL dari larutan stok asam galat 100 ppm dan kemudian

masing-masing ditambahkan dengan reagen folin 50% sebanyak 0,8 mL,

dimasukkan pada labu ukur 10 mL. Selanjutnya ditambahkan Na2CO3 5%

hingga tanda batas, sehingga menghasilkan larutan standart dengan

konsentrasi 0; 2; 4; 8; 16; dan 32 ppm. Masing-masing larutan didiamkan

selama 60 menit, dan serapannya diukur pada panjang gelombang 760 nm.

Dengan mengalurkan absorbansi terhadap konsentrasi, dapat diperoleh

kurva kalibrasi dengan persamaan regresi y = bx + a. Hasil yang diperoleh

dibuat dalam bentuk kurva, sebagai sumbu y adalah absorbansi dan panjang

gelombang cahaya sebagai sumbu x. Dari kurva tersebut dapat ditentukan

panjang gelombang yang memberikan serapan maksimum. Skema kerja

pembuatan kurva standart asam galat dapat dilihat pada Gambar 10.

34

Gambar 10. Skema Kerja Pembuatan Kurva Standart Asam Galat

Penentuan Total Senyawa Fenolat dengan Metode Folinciocalteu (Ratnayanti et al., 2012) Sampel sebanyak 0,001 g ditimbang teliti dan dilarutkan dengan metanol

85% dalam labu ukur 10 mL sampai tanda batas. Campuran tersebut disaring,

dan filtratnya dipipet 1,0 mL kemudian ditambahkan dengan reagen folin 50%

sebanyak 0,8 mL, dimasukkan pada labu ukur 10 mL. Setelah itu dikocok dan

ditambahkan Na2CO3 5%sampai tanda batas, sehingga volume total larutan

menjadi 10 mL. Larutan didiamkan selama 60 menit, dan serapannya diukur

pada panjang gelombang maksimum. Pengukuran dilakukan pengulangan

sebanyak 6 kali. Konsentrasi senyawa fenolat dalam sampel dapat ditentukan

dengan mengalurkan absorbansi sampel pada kurva kalibrasi. Skema kerja

Serbuk asam galat 0,01 gram

Ditambahkan aquades sampai batas labu ukur 100 ml

Didapatkan larutan induk 100 ppm

Diambil sebanyak 0; 0,2; 0,4; 0,8; 0,16; dan 3,2 ml

Dimasukkan kedalam labu ukur 10 ml

Ditambahkan reagen follin 50% sebanyak 0,8 ml

Ditambahkan Na2CO3 5% sampai batas labu ukur 10

Dihasilkan konsentrasi 0; 2; 4; 8; 16; dan 32 ppm

Didiamkan selama 60 menit

Serapannya diukur pada panjang gelombang 769 nm

35

penentuan total senyawa fenolat metode folinciocalteu dapat dilihat pada

Gambar 11.

Gambar 11. Skema Kerja Penentuan Total Senyawa Fenolat Metode

Folinciocalteu

b. Uji Aktivitas Antioksidan Metode DPPH (Modifikasi Rohimat et al., 2014 dan Wikanta et al., 2010)

Sampel ekstrak daun mangrove Nypa fruticans sebanyak 0,001 g

Dilarutkan dengan metanol 85% dalam labu ukur 10 ml sampai tanda batas

Disaring dengan keras saring halus

Filtrat dipipet 0,1 ml

Ditambahkan dengan reagen folin 50% sebanyak 0,8 ml, dimasukkan pada labu ukur 10 ml

Dikocok

Ditambahkan Na2CO3 5% sampai tanda batas labu ukur 10 ml

Larutan didiamkan selama 60 menit di ruang gelap

Serapannya diukur pada panjang gelombang 760 nm dengan spektrofotometer UV-Vis

36

Sebanyak 5 mg sampel ekstrak dilarutkan dalam 5 mL metanol sehingga

diperoleh larutan dengan konsentrasi 1000 ppm (larutan induk). Larutan induk

dipipet sebanyak 62,5 µL, 125 µL, 250 µL, 500 µL, 1000 µL dimasukkan kedalam

tabung reaksi untuk mendapatkan konsentrasi sampel 12,5 ppm, 25 ppm, 50

ppm, 100 ppm, 100 ppm dan 200 ppm. Kedalam masing-masing tabung

ditambahkan 1 mL larutan DPPH 0,1 mM kemudian ditambahkan metanol hingga

menjadi 5 mL. Setelah homogen , diinkubasi pada suhu ruang (27ºC) selama 30

menit. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 517 nm. Setiap sampel

dilakukan 6 kali ulangan dan dihitung presentase peredamannya menggunakan

persamaan berikut:

% Peredaman =

x 100%

A0 adalah absorbansi kontrol (metanol + DPPH) tanpa ekstra dan A1 adalah

absorbansi sampel uji (Ekstrak + DPPH). Skema kerja uji aktivitas antioksidan

metode DPPH dapat dilihat pada Gambar 12.

37

Ekstrak daun mangrove Nypa fruticans 5 mg

Dilarutkan dalam 5 ml metanol (1000 ppm) menjadi larutan induk

Diambil 6,25 µL

Diambil 125 µL

Diambil 250 µL

Diambil 500 µL

Diambil 1000 µL

Konsentrasi 12,5 ppm

Konsentrasi 25 ppm

Konsentrasi 50 ppm

Konsentrasi 100 ppm

Konsentrasi 200 ppm

Dimasukkan kedalam botol vial

Ditambahkan larutan DPPH 0,1 nM sebanyak 1 mL

Ditambahkan metanol sampai volumenya menjadi 5 mL

dihomogenkan

Dibiarkan selama 30 menit ditempat gelap

Diukur absorbansi pada panjang gelombang 517 nm dengan spektrofotometer UV-Vis

Diukur % inhibisi dan nilai IC50 (melalui suatu persamaan garis linier)

Gambar 12. Uji Aktivitas Antioksidan Metode DPPH

38

c. Identifikasi Senyawa Bioaktif Menggunakan LC-MS (Modifikasi Lisdiawati et al., 2007)

Metode LC-MS merupakan metode pemisahan dan identifikasi untuk

senyawa obat atau organik. Metode ini sangat sensitif dan selektif

dibandingkan metode deteksi dengan sinar UV biasa (Purwanto, 2011).

Skema kerja identifikasi senyawa bioaktif menggunakan LC-MS dapat dilihat

pada Gambar 13.

Gambar 13. Skema Kerja Identifikasi Senyawa Bioaktif Menggunakan LC-MS

0,8 mg ekstrak Nypa fruticans

Dilarutkan dalam 0,8 ml metanol 95% dengan asam asetat 0,3%

0,2 µL larutan disuntikkan pada instrumen LC-MS dengan laju alir 0,1 mL/menit

Dipompa selama 10-15 menit

Masuk kedalam katup kolom selector

Dilakukan pemisahan menuju UV detector

Berat molekul dideteksi dengan spektrofotometer massa