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CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS, MÉTODO DE BIURET.
INTRODUCCIÓN
Las proteínas ocupan un lugar de máxima importancia entre las
moléculas constituyentes de los seres vivos (biomoléculas).
Prácticamente todos los procesos biológicos dependen de la
presencia o la actividad de este tipo de moléculas (Berg et al,
2008).
Determinar la concentración de proteínas en una muestra
biológica es una técnica de rutina básica cuando se aborda un
esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se
quiere conocer la actividad específica de una preparación
enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como
para muchos otros propósitos. Existen diferentes métodos para
la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se
basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para
absorber luz en el UV, b) para la formación de derivados
químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de unir
ciertos colorantes (Segal, 2005).
La reacción de biuret es una reacción coloreada (violeta)
debida a la formación de un complejo de Cu en un medio
alcalino en compuestos que poseen más de un enlace peptidico,
como las proteinas (Cambell et al, 2006):
Figura 1: Reacción de Biuret.
La curva de patrón es un método de química analítica empleado
para medir la concentración de una sustancia en una muestra
por comparación con una serie de elementos de concentración
conocida. Se basa en la existencia de una relación en
principio lineal entre un carácter medible (por ejemplo la
absorbancia en los enfoques de espectrofotometría) y la
variable a determinar (la concentración). Para ello, se
efectúan diluciones de unas muestras de contenido conocido y
se produce su lectura y el consiguiente establecimiento de
una función matemática que relacione ambas; después, se lee
el mismo carácter en la muestra problema y, mediante la
sustitución de la variable independiente de esa función, se
obtiene la concentración de esta. Se dice pues que la
respuesta de la muestra puede cuantificarse y, empleando la
curva patrón, se puede interpolar el dato de la muestra
problema hasta encontrar la concentración (Harris, 2003)
OBJETIVO GENERAL
Aplicar un método colorimétrico para determinar la
concentración de proteína en una muestra problema.
OBJETIVOS PARTICULARES
- Aprender el manejo del espectrofotómetro y su aplicación
en los métodos colorimétricos.
- Aprender el empleo de una curva patrón para la
determinación de la cantidad de moléculas presentes en
una muestra, en este caso de proteínas.
- Determinar la concentración de proteínas en una muestra
de leche, utilizando el método de Biuret.
HIPÓTESIS
Si se mide la absorbancia a 540 nm de una muestra coloreada
con el reactivo de Biuret ésta será proporcional a la
concentración de proteína de dicha muestra.
MATERIAL Y MÉTODO
Primero, se dispuso a tomar la caseína y macerar con ayuda
de un mortero con pistilo, después se peso para ocupar 0.1g
para una solución de 1:10, al no disolverse bien se le
agregaron gotas de hidróxido de sodio hasta llegar a la
homogenación deseada, también se realizo la solución de leche
0.05ml para una solución 1:20 y se disolvieron en agua; Al
mismo tiempo se calentaba agua hasta llegar a una temperatura
de 500C a 550C.
A continuación, se separaron 24 tubos de ensaye en dos
grupos de 12 “A y B” los seis primeros se utilizaron para
obtener la curva patrón y los otros seis para obtener la
curva problema esto en los dos grupos, el tubo 1 se ocupó
como blanco, al tubo 2 0.1ml, al 3 0.2ml, al 4 0.4ml, al 5
0.8ml, al 6 1.0ml de albumina sérica bovina (BSA) con
concentración de 10 mg/ml, respectivamente.
En seguida, los tubos 7 con 0.25ml y 8 con 0.5ml de caseína,
el 9 con 0.25ml y el 10 con 0.5ml de sobrenadante, el 11 con
0.25 ml y el 12 con 0.5ml de leche diluida, (todo esto
obtenido en la práctica anterior); a todos los tubos se les
agrego Cloruro de Sodio al 0.9% con diferente cantidad de
2.9ml al 2, 2.8ml al 3, 2.6ml al 4, 2.2ml al 5 y 2ml al 6.
Para tener una solución de 3ml y reactivo de Biuret con la
misma cantidad de 3 ml, así logramos una solución de 6ml, se
homogenizo la solución por medio de un agitado tipo vortex.
(Solamente al tubo 1 se le agregaron 3 ml de reactivo de
biuret y 3 ml de NaCl)
Después de tener todos los tubos con la solución se colocaron
en un vaso de precipitados de 1000 ml con agua caliente y se
dejaron durante 10 minutos aproximadamente (hasta lograr
tonalidades de azul cielo a violeta), al termino del tiempo
se colocaron en agua a temperatura ambiente, hasta lograr que
se enfriara la solución.
Posteriormente se realizo la cuantificación de la solución
por medio de un espectrofotómetro a 540 nm de los tubos A y
B, entre cada medición se lavaban las celdas; al tener todas
las mediciones se dispuso a realizar la curva obtenida.
RESULTADOS
Los valores de absorbancia obtenidos con el espectrofotómetro
a 540 nm para cada una de las 12 soluciones se muestran a
continuación (solamente se muestran los tubos A y no los
duplicados):
Tabla 1: Valores de absorbancia de cada una de las muestras.
TuboNo. Solución * Proteína
(mg)
Absorbancia
a 540 nm1 3 ml NaCl, 0 Blanco2 0.1 ml BSA y 2.9 ml NaCl 1 0.0343 0.2 ml BSA y 2.8 ml NaCl 2 0.0714 0.4 ml BSA y 2.6 ml NaCl 4 0.1425 0.8 ml BSA y 2.2 ml NaCl 8 0.277
6 1 ml BSA y 2 ml NaCl 10 0.3457 0.25 ml caseína y 2.75 ml
NaCl¿? 0.079
8 0.5 ml caseína y 2.5 ml NaCl
¿? 0.198
9 0.25 ml sabrenadante y 2.75ml NaCl
¿? 0.221
10 0.5 ml sobrenadantey 2.5 mlNaCl
¿? 0.240
11 0.25 ml leche diluida y 2.75 ml NaCl
¿? 0.044
12 0.5 ml leche diluida y 2.5 ml NaCl
¿? 0.068
*A todas las soluciones se agregaron 3 ml del reactivo de Biuret.
Con los valores de la tabla anterior, tubos dos a seis, se
realizó la gráfica 1, de la curva patrón de proteína,
obtenida por el método de regresión lineal de mínimos
cuadrados; donde las abscisas (x) representan la
concentración en mg de proteína, y las ordenadas (y) los
valores de la absorbancia de cada concentración.
Figura 2: Curva patrón de proteína.
La determinación de la cantidad de proteína en las muestras
problema, tubos siete a doce, se obtuvo con el valor de la
absorbancia obtenida por el espectrofotómetro para cada
muestra (tabla 1), mediante la interpolación de estos valores
en la curva patrón (figura 3) y despejado los valores
respectivos de x de la ecuación de la recta (y= mx + b) tal
como se muestra a continuación (tabla 2):
Figura 3: interpolación de los valores de absorbancia de las muestras problemas en la curva patrón.
De acuerdo a la figura anterior, la cantidad aproximada de
proteína en las muestras problema, de la siete a la doce,
seria: 2.35, 5.7, 6.2, 6.9, 1.05 y 1.9 mg, respectivamente.
La determinación de la cantidad de proteína en las muestras
problema despejando los valores de “x” de la ecuación de la
recta (y = 0.0344X +0.0017) quedaría:
Tabla 2: determinación de la cantidad de proteína utilizandola ecuación de recta.
Tubo No.
Absorbancia (y) a 540 nm
Proteína (mg)
7 0.079 2.218
8 0.198 5.7069 0.221 6.37510 0.240 6.92711 0.044 1.22912 0.068 1.927
Tomando en cuenta los factores de disolución, por cada
mililitro de muestra se obtiene la siguiente tabla:
Tabla 3: Concentración de proteína en las muestras problema.
Tubo No.
Proteína (mg)
Factor de disolución
Proteína (mg/ml)
7 2.218 4x100 887.28 5.706 2x100 1141.29 6.375 4x10 22510 6.927 2x10 138.5411 1.229 4x20 98.3212 1.927 2x20 77.08
A continuación se resumen los resultados finales en la
siguiente tabla:
Tabla 4: resultados finales de la concentración de proteína
Tubo No.
Solución *Proteín
a (mg)
Proteína
(mg/ml)
Absorbancia
a 540 nm
1 3 ml NaCl, 0 0 Blanco2 0.1 ml BSA y 2.9 ml NaCl 1 10 0.0343 0.2 ml BSA y 2.8 ml NaCl 2 10 0.0714 0.4 ml BSA y 2.6 ml NaCl 4 10 0.1425 0.8 ml BSA y 2.2 ml NaCl 8 10 0.2776 1 ml BSA y 2 ml NaCl 10 10 0.3457 0.25 ml caseína y 2.75 ml
NaCl 2.218887.2 0.079
8 0.5 ml caseína y 2.5 ml NaCl 5.706 1141.2 0.1989 0.25 ml sabrenadante y 2.75
ml NaCl 6.375225 0.221
10 0.5 ml sobrenadantey 2.5 ml NaCl 6.927
138.54 0.240
11 0.25 ml leche diluida y 2.75 ml NaCl 1.229
98.32 0.044
12 0.5 ml leche diluida y 2.5 mlNaCl 1.927
77.08 0.068
*A todas las soluciones se agregaron 3 ml del reactivo de
Biuret.
DISCUSIÓN
De acuerdo a los resultados finales (tabla 4) obtenidos en la
determinación de la concentración de proteína en las muestras
de caseína, sobrenadante y leche diluida, que aunque no son
los esperados, pues, la concentración de proteínas tendría
que ser mayor en la leche diluida que en el sobrenadante y
los valores de la concentración de cada muestra problema
iguales entre sí, no se descarta este método de
cuantificación de proteínas, pero es recomendable utilizar
los materiales de laboratorio correctos para hacer las
diluciones y ser precisos, mas aun exactos, en la medición de
volúmenes.
El sobrenadante consiste en una suspensión a la cual se le ha
eliminado la mayor cantidad de proteínas contenidas en la
leche, por lo que su concentración de proteína tendría que
ser mejor que el de la leche pura.
CONCLUSIÓN
Efectivamente, aplicando el método Biuret se puede determinar
la concentración de proteína en una o varias muestras
problema, que resultan al interpolar los valores de
absorbancia en una curva patrón originada a partir de
concentración de proteína conocida.
BIBLIOGRAFÍA
Berg, J.M.; John, L.T.; Lubert, S. (2008) Bioquímica. 2ª ed. Reverté, Barcelona.
Segal, C. (2005) Manual de prácticas de biología molecular de la célula. Editorial publidisia. Cambell, P.N.; Smith, A.d.; Peters, T.J. (2006)Bioquímica ilustrada: bioquímica y biología molecular en la era posgenómica.Masson, España.
Harris, D.C. (2003). Quantitative chemical analysis. San Francisco: W.H. Freeman.
ANEXO (CUESTIONARIO)1.- describa que es el espectrofotómetro y para que sirve.
Sirve para calcular las concentraciones de las distintas
sustancias en función de la absorción del color. Técnicas de
bioquímica y biología moleculas.freifelder David. Editorial
reverte.2003
2.- mencione que es un espectro de absorción y las diferentes
longitudes de onda del espectro.
La espectroscopia de absorción es la medida de la cantidad de
luz absorbida por un compuesto en función de la longitud de
onda de la luz. En general, se irradia una muestra con una
fuente de luz y se mide la cantidad de luz transmitida a
varias longitudes de onda, utilizando un detector y
registrando el fenómeno en una grafica. Técnicas de
bioquímica y biología moleculas.freifelder David. Editorial
reverte.2003
3.- defina con sus propias palabras que es una curva patrón.
Son las medidas conocidas en orden ascendente que sirven de
guía para ajustar una solución problema.
4.- cuales son las ventajas y las desventajas, de emplear los
reactivos de biuret para cuantificar proteínas explique.
Dentro de las ventajas del reactivo de Biuret es que es
bastante específico para proteínas, muestra pocas
interferencias y es barato. Y la desventaja es que es poco
sensible.
5.- mencione cual es la razón de que en el método de biuret
la absorbancia de una proteína se lea a una longitud de 540
nm.
El color violeta característico se presenta a esa longitud la
cual se da por la coordinación de un átomo de cobre con
cuatro átomos de nitrógeno. El complejo se basa en la
desprotonación de los grupos amida para formar el enlace con
el cobre (II) o por el establecimiento de un enlace
coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de
los átomos de oxigeno y de nitrógeno del péptido. Técnicas de
bioquímica y biología moleculas.freifelder David. Editorial
reverte.2003
6.- explique si una curva patrón puede ser empleada para
cuantificar sustancias diferentes a las proteínas y cual
seria la diferencia con estas.
7.- ¿Cuál es la finalidad de utilizar un tubo como blanco?
Mencione si siempre se utiliza agua como blanco.
Tomar la medida de la cual parte la curva patrón, no siempre
se utiliza agua como blanco, si no una mezcla concentrada de
la sustancia con la cual se esta trabajando. Técnicas de
bioquímica y biología moleculas.freifelder David. Editorial
reverte.2003
8.-realice una curva patrón con los datos de absorbancia y
proteína obtenidos en una determinación hipotética:
Se realizo una solución estándar de albúmina (10mg/ml).
Los valores de absorbancia referidos se determinaron por
duplicado.
9.-con los datos obtenidos en el ejemplo anterior, determina
la ecuación de la recta que representa la curva patrón.
10.- basándose en la curva patrón y la ecuación de la línea
recta, determine la cantidad de proteína en MG/ml de las
siguientes muestras, cuyos valores de absorbancia se indican
11.- elabore una lista de 5 compuestos que se podrían
cuantificar empleando una curva patrón, y menciona que
importancia tiene determinar la cantidad de dichos
compuestos.
a) inmunoglobulinas. Mal funcionamiento inmunológico
b) hemoglobina. Una concentración baja produce anemia.
c) insulina. Una concentración baja produce diabetes.
d) fibrilinas. La falta de esta produce deformación en los
huesos.
e) seroalbumina. Su falta produce deformaciones.
Bioquimica.berg Jeremy.editorial reverte.2008
2.6.2. Análisis del modelo SIPara analizar el modelo SI (2.17), dado por las ecuaciones (2.21) y (2.23), consideramos sus ecuaciones limites respectivamente dado por:
El modelo limite (2.24), N(t) es constante k= y(2.24) se reduce a una unica ecuación
Asi el modelo SI (2.17) es dado por la unica ecuación (2.25).El equilibrio de (2.23) es la solucion constante de (2.25), satisfaciendo
Asi, esta en equilibrio(libre de enfermedad), y haytambien un equilibrio endémico dado por:
El lado izquiero de (2.26) es una funcion en
El cual es monótona decreciente, donde
cuando y
Y 0 cuando Así (2.25) tiene el unico equilibrio libre de enfermedadsi
Si , alli hay un único equilibrio endémico determinadopor (2.26).Teorema 2.6.1 El modelo SI (2.17) tiene un único equilibrio asintóticamente estable. El equilibrio libre de enfermedad es asintóticamente estable si dado por (2.27) y el equilibrioendémico es asintóticamente estable si , dado por (2.26).Prueba
a)El equilibrio libre de enfermedad es asintóticamente estable. Tenemos la ecuación característica del equilibrio libre de enfermedad
, para
(2.28)Observar que
Ya que < , para las raíces de esta
ecuación característica están en el semiplano izquiero si , Si , allí hay una raíz real positiva de (2.28) y así el equilibrio de enfermedad libre es inestable.
b) El equilibrio endémico dado por (2.26). Linealizando (2.25), para este equilibrio
tenemos
De donde la expresión característica resulta
o también
Para , y usando la parte a) tenemos
que
asi por transitividad tenemos
y seguimos de esta estimación y (2.26) que (2.29) no tiene raíces en , es decir
para (2.29)
Asi en el equilibrio endémico es asintóticamente estable, si
2.6.2.1. Estabilidad GlobalAlgunas cuestiones previas.Para obtener una relación analógica con (2.7) entre el numero reproductor básico , el periodo de vida medio Ly la edad media de infección A, tenemos
1. El Número reproductor básico para periodo de vida exponencialPara obtener una relación entre ,A y L como en (2.7) combinamos (2.26) con (2.27)
de donde
Para un periodo de vida exponencial , con y
se reduce a la estimación clásica (2.7).
Observación 2Un resultado al reemplazar en las relaciones (2.26) y (2.27) produce lo siguiente
a) Para el equilibrio endémico dado por (2.26)
para , tenemos que
El cual corresponde al equilibrio endémico, como lo habíamos afirmado por observación 1 parte b).
b) Para el numero reproductor basico dado por (2.27)
Lo cual para métodos de simulación del modelo SI, permite controlar el valor de
2. El número reproductor básico para un periodo de vida fijo.Para otra elección de periodo de vida exponencial
, la relación puede ser bastante diferente. Por ejemplo para un periodo de vida fijo
Nosotros podemos obtener una fórmula para como (2.30)
Luego en (2.30) resulta
donde
Asi Asi puede ser aproximado por una función de ,
pero esta función particular de depende de .
La integral es minimizada no negativa, por la
función no decreciente con fijo, por la función
Esto se cumple ya que cada perturbación de esta función
mantenida fijo, debe incrementarse el
instante . Asi
También tenemos
Luego (2.30) implica
Por tanto
Para toda elección de la función de supervivencia
Si definimos , entonces (2.31) toma la forma
Sin embargo, la proporción de puede ser
arbitrariamente grande. Veamos para la elección de la función de supervivencia
, para ε>0 (2.32)Tenemos
por (2.30), tenemos
Asi, la elección (2.32) para produce y este
puede ser hecho arbitrariamente grande, eligiendo suficientemente pequeño. En lo que sigue, probaremos que la estabilidad asintótica tanto para el equilibrio libre de enfermedad como el equilibrio endémico del modelo SI(2.17) es global.Teorema 2.6.2 (Estabilidad Global)
PruebaPara probar este resultado, usaremos el Teorema 1.5.4, con una ligera modificación. Si (1.38) es reemplazado por
con dicha modificación, se puede verificar que